Fabricação de Micro-tecidos utilizando Módulos de Colágeno Gel células contendo

O objetivo geral deste procedimento é produzir microtecidos modulares que possam ser utilizados em experimentos de engenharia de tecidos. Isso é realizado primeiramente puxando a solução de colágeno para dentro de um tubo de polietileno, usando uma seringa, e, em seguida, gelificando o colágeno. O segundo passo consiste em cortar o tubo de polietileno em segmentos de dois milímetros para formar os módulos de microtecidos.

O terceiro passo do procedimento é separar os módulos do tubo, e, por fim, os módulos são revestidos com células endoteliais. Em última análise, os microtecidos resultantes podem ser utilizados em ensaios celulares in vitro para estudar a interação celular por meio de uma câmara microfluídica. Além disso, os microtecidos podem ser implantados para gerar tecidos destinados ao estudo da interação e remodelação dos microtecidos in vivo.

Olá, meu nome é Brendan Long do Laboratório Sepan aqui na Universidade de Toronto. Um dos principais obstáculos na criação de substitutos teciduais tridimensionais de grande porte é a falta de vascularização rápida após a implantação. Neste vídeo, mostraremos como criar tecidos modulares revestidos com células endoteliais para ajudar a superar essa limitação.

Quem demonstrará o procedimento será Deem Chamberlain, pesquisador pós-doutorando do laboratório Septin. A quantidade de colágeno a ser neutralizada dependerá do comprimento do tubo de polietileno. Nesta demonstração, utilizaremos um tubo de polietileno de dois metros de comprimento, com diâmetro interno de 0,76 milímetro e diâmetro externo de 1,22 milímetro.

Para preparar o tubo, introduza uma agulha de 20 G em uma das extremidades do tubo e, em seguida, coloque o tubo em um envelope autoadesivo conversor para esterilização a gás. Como um mililitro de colágeno preenche cerca de dois metros de tubo de polietileno, neutralizaremos um mililitro de colágeno. Coloque o colágeno em um tubo cônico de 15 mililitros e mantenha o tubo sobre gelo.

Adicione 128 microlitros de 10 x alfa MEM por mililitro de colágeno ao tubo e misture pipetando repetidamente a solução. Tendo o cuidado de minimizar a formação de bolhas, a solução deve ficar amarela à medida que o alfa MEM é misturado ao colágeno acidificado. Em seguida, neutralize o colágeno adicionando bicarbonato de sódio 0,8 molar. Para uma estimativa geral do pH, adicione bicarbonato de sódio até que a solução de colágeno amarela se torne de cor rosa claro.

Normalmente, são necessários de 30 a 60 microlitros por mililitro de colágeno para atingir um pH de 7,4. Para evitar que o colágeno neutralizado entre em gelificação, mantenha-o em gelo até o momento de uso. Para iniciar o procedimento de gelificação do colágeno, leve o saco contendo os tubos de polietileno esterilizados para uma cabine de segurança biológica e corte a extremidade selada do saco, mantendo os tubos dentro do saco.

Use pinças esterilizadas para acoplar uma seringa de três mililitros à agulha de calibre 20 que foi previamente inserida em uma extremidade da tubulação. Insira a outra extremidade da tubulação no colágeno neutralizado até que a ponta fique no fundo do tubo cônico, mantido sobre gelo. Você deve realizar este próximo passo lentamente; caso contrário, introduzirá bolhas de ar no colágeno.

Retire lentamente o êmbolo da seringa para puxar o colágeno para dentro do tubo de polietileno. Quando o colágeno tiver sido puxado através do tubo, retire a agulha de 20 gauge e coloque ambas as extremidades do tubo de volta para dentro do saco. Após fechar o saco com fita adesiva, incube a 37 graus Celsius por 60 minutos.

Um dispositivo de corte pré-montado será usado para cortar o tubo. Para iniciar este procedimento, coloque o tubo em uma bandeja estéril diante do dispositivo de corte e carregue o tubo no dispositivo de corte na saída do equipamento; prepare um tubo cônico de 50 mililitros contendo 25 mililitros de meio para células endoteliais. Para coletar os módulos cortados, configure o dispositivo de corte para produzir segmentos de tubo de dois milímetros de comprimento e, em seguida, corte o tubo.

Incube os módulos cortados no tubo cônico de 50 mililitros a 37 graus Celsius por 60 minutos. Para remover os módulos de colágeno da tubulação, vortexe o tubo cônico de 50 litros contendo os módulos em velocidade média. Deixe o módulo sedimentar no fundo do tubo por 10 segundos, o que leva cerca de cinco minutos.

Um pellet solto de módulos se formará na parte inferior do tubo, enquanto o tubo formará uma camada na parte superior do meio. Depois que os módulos se assentarem, utilize uma pipeta serológica de boca larga de 10 mililitros para transferi-los para um tubo cônico de 15 mililitros. Vortex o tubo cônico de 15 mililitros e, em seguida, deixe os módulos sedimentarem mais duas vezes.

Os módulos sedimentados dos segundo e terceiro vórtices também são transferidos para o tubo de 15 mililitros. Após todos os módulos terem sido removidos da tubulação e reunidos, complete o volume do meio no tubo até cinco mililitros. Os módulos estão agora prontos para serem revestidos com células endoteliais, o que será mostrado a seguir para o preparo das células endoteliais destinadas ao revestimento dos módulos.

Primeiro, remova o meio das células e lave com PBS. Após a remoção do PBS, adicione três mililitros de tripsina EDTA e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, ressuspenda as células em sete mililitros de meio e transfira para um tubo de 15 mililitros.

Conte as células utilizando um hemocitômetro; você precisará de cinco vezes 10 à sexta potência de células endoteliais por mililitro de módulos compactados na parte inferior do tubo cônico. Peliculize as células a 300 ×g por cinco minutos. Reuspenda o pellet celular em cinco mililitros de meio para células endoteliais.

Agora, adicione cinco mililitros de meio contendo células endoteliais aos módulos. Os módulos são incubados com as células endoteliais, tanto de forma estática quanto dinâmica; para a incubação estática, misture os módulos com as células endoteliais por inversão e, em seguida, posicione o tubo na posição vertical a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após 15 minutos, inverta o tubo novamente e incube a 37 graus Celsius por mais 15 minutos.

Para incubação dinâmica dos módulos com as células endoteliais, agite suavemente o tubo de 15 mililitros a 37 graus Celsius por 60 minutos. Após a conclusão da incubação com as células endoteliais, transfira os módulos para uma placa não tratada para cultura de tecidos e incube durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, coloque os módulos em uma nova placa não tratada para cultura de tecidos com meio fresco para remover as células endoteliais não aderidas. Incube os módulos revestidos com células endoteliais a 37 graus Celsius até que as células cubram 100% da superfície dos módulos.

Isso geralmente leva cerca de sete dias. Os módulos terão aparência cilíndrica quando forem removidos pela primeira vez do tubo. Se estiverem revestidos com células endoteliais, podem contrair até 50% em volume e desenvolver uma forma oval, além de se tornarem mais densos e opacos quando observados por microscopia de luz.

Nestas imagens, o diâmetro e o comprimento dos módulos são indicados por d e l, respectivamente. Esta próxima imagem mostra células Hep G2 embutidas distribuídas uniformemente dentro dos módulos no momento da fabricação. As células mantiveram alta viabilidade, indicada pela coloração verde das células vivas.

Células mortas seriam de cor vermelha quando as células endoteliais estiverem confluentes. Na superfície dos módulos, há a formação de junções apertadas, que podem ser observadas por imunofluorescência. A coloração da cadherina VE para análise de transferência de massa demonstrou que os módulos são capazes de suportar altas densidades celulares sem desenvolver um núcleo necrótico devido ao transporte inadequado de oxigênio, o que frequentemente é um problema em tecidos maiores.

Neste exemplo, a coloração com tri-cromo de massa de módulos pequenos típicos mostra que os módulos mantiveram uma distribuição uniforme e elevada de células vivas sete dias após a fabricação. Em contraste, um grande número de células mortas havia se formado no núcleo dos módulos maiores, deixando apenas uma fina camada de células viáveis. Os módulos também foram produzidos com uma mistura de colágeno e um polímero ine ou contendo microesferas com liberação controlada de fármacos.

Aqui, quando células EC h hm são cultivadas em módulos de colágeno com palin, os módulos mantêm sua forma cilíndrica e apresentam propriedades limitadas de adesão celular em comparação com módulos de colágeno puro. Uma imagem de microscópio óptico de um módulo de colágeno contendo microesferas biodegradáveis à base de PLGA é mostrada aqui. Vários ensaios in vitro demonstraram ser compatíveis com os módulos.

Por exemplo, em um ensaio de angiogênese, formações semelhantes a capilares em um módulo semeado com células endoteliais podem ser facilmente detectadas e quantificadas após cinco dias de incubação com células-tronco derivadas de adipócitos. Em outro exemplo, imagens de microscopia confocal de um ensaio de viabilidade celular em módulos mostram células vivas coradas em verde e células mortas coradas em vermelho. Por fim, os módulos também foram utilizados em câmaras microfluídicas e implantados em camundongos e ratos para estudar a interação entre diferentes tipos celulares e como os microtecidos são remodelados pela resposta do hospedeiro.

Após o procedimento, os módulos podem ser cultivados em uma placa de Petri ou outros recipientes, como um biorreator ou um dispositivo microfluídico. Este método também pode ser adaptado para criar diferentes tecidos, utilizando várias combinações de tipos celulares ou tubos com diâmetros diferentes. Obrigado por assistir.