Fabricação de Micro-tecidos utilizando Módulos de Colágeno Gel células contendo

O objetivo geral deste procedimento é produzir microtecidos modulares que possam ser usados para experimentos de engenharia de tecidos. Isso é feito primeiro puxando a solução de colágeno para um tubo de polietileno, usando uma seringa e, em seguida, gelificando o colágeno. O segundo passo é cortar o tubo de polietileno em comprimentos de dois milímetros para formar os módulos de micro tecido.

A terceira etapa do procedimento é separar os módulos da tubulação e, por último, os módulos são revestidos com células endoteliais. Em última análise, os microtecidos resultantes podem ser usados para ensaios celulares in vitro para estudar a interação das células por meio de uma câmara microfluídica. Além disso, os microtecidos podem ser implantados para gerar tecidos para estudar a interação e remodelação dos microtecidos in vivo.

Olá, meu nome é Brendan Long, do Sepan Lab aqui na Universidade de Toronto. Um dos principais obstáculos na criação de grandes substitutos de tecido 3D é a falta de vascularização rápida após a implantação. Neste vídeo, mostraremos como criar tecido modular revestido com células endoteliais para ajudar a superar essa limitação.

Demonstrando o procedimento será considerado Chamberlain, um pós-operatório do laboratório Septin. A quantidade de colágeno a ser neutralizada dependerá do comprimento do tubo de polietileno. Nesta demonstração, usaremos um tubo de polietileno de dois metros com diâmetro interno de 0,76 milímetro e diâmetro externo de 1,22 milímetro.

Para preparar o tubo, enfie uma agulha de 20 G em uma extremidade do tubo e, em seguida, coloque o tubo em uma bolsa de autocura do conversor para esterilização a gás. Como um mililitro de colágeno preenche cerca de dois metros de tubo de polietileno, neutralizaremos um mililitro de colágeno. Coloque o colágeno em um tubo cônico de 15 mililitros e mantenha o tubo no gelo.

Adicione 128 microlitros de 10 x alfa, MEM por mililitro de colágeno ao tubo e misture pipetando repetidamente a solução. Tomando cuidado para minimizar a formação de bolhas, a solução deve ficar amarela à medida que o alfa MEM é misturado ao colágeno acidificado. Em seguida, neutralize o colágeno adicionando bicarbonato de sódio 0,8 molar Para uma estimativa geral do pH, adicione bicarbonato de sódio até que a solução de colágeno amarelo fique com uma cor rosa claro.

Normalmente, são necessários de 30 a 60 microlitros por mililitro de colágeno para atingir um pH de 7,4. Para evitar que o colágeno neutralizado gelifique, mantenha-o no gelo até que esteja pronto para ser usado. Para iniciar o procedimento de gelificação do colágeno, leve o saco contendo o tubo de polietileno esterilizado para um armário de segurança biológica e corte a extremidade selada do saco, mantendo o tubo no saco.

Use uma pinça esterilizada para prender uma seringa de três mililitros à agulha de calibre 20 que foi inserida anteriormente em uma extremidade do tubo. Insira a outra extremidade do tubo no colágeno neutralizado até que a ponta esteja na parte inferior do tubo cônico, que é mantido no gelo. Este próximo passo você tem que fazer lentamente, caso contrário, você introduz bolhas de ar no colágeno.

Retraia o êmbolo da seringa lentamente para puxar o colágeno para dentro do tubo de polietileno. Quando o colágeno tiver sido puxado através do tubo, puxe a agulha de calibre 20 para fora e coloque as duas extremidades do tubo de volta na bolsa. Depois de fechar o saco, incubado a 37 graus Celsius por 60 minutos.

Um dispositivo de corte pré-montado será usado para cortar a tubulação. Para iniciar este procedimento, coloque a tubulação em uma bandeja estéril na frente do dispositivo de corte e carregue a tubulação no dispositivo de corte na saída do dispositivo de corte, configure um tubo cônico de 50 mililitros contendo 25 mililitros de meio de células endoteliais. Para coletar os módulos de corte, defina o dispositivo de corte para cortar dois milímetros de comprimento de tubulação e, em seguida, corte a tubulação.

Incubar os módulos cortados no tubo cónico de 50 mililitros a 37 graus Celsius durante 60 minutos. Para remover os módulos de colágeno da tubulação, vórtice, o tubo cônico de 50 litros contendo os módulos em velocidade média. Por 10 segundos, deixe o módulo assentar no fundo do tubo, o que leva cerca de cinco minutos.

Um pellet solto de módulos se formará na parte inferior do tubo, enquanto o tubo formará uma camada no topo da mídia. Depois que os módulos estiverem assentados, use uma pipeta sorológica de boca larga de 10 mililitros para transferi-los para um tubo cônico de 15 mililitros. Vortex, o tubo cônico de 15 mililitros, e então permita que os módulos se assentem por mais duas vezes.

Os módulos sedimentados do segundo e terceiro vórtices também são transferidos para o tubo de 15 mililitros. Depois que todos os módulos tiverem sido removidos da tubulação e agrupados, aumente o volume de mídia no tubo para cinco mililitros. Os módulos estão agora prontos para o revestimento com células endoteliais, que serão mostradas a seguir para preparar as células endoteliais para o revestimento dos módulos.

Primeiro, remova a mídia das células e lave com PBS. Depois de remover o PBS, adicione três mililitros de tripsina EDTA e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, resus, suspenda as células em sete mililitros de meio e transfira para um tubo de 15 mililitros.

Conte as células usando um hemocitômetro, você precisará de cinco vezes 10 elevado à sexta células endoteliais por mililitro de módulos compactados na parte inferior do tubo cônico. Pulverize as células a 300 G por cinco minutos. Ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de meio celular endotelial.

Agora adicione cinco mililitros de meio contendo células endoteliais aos módulos. Os módulos são incubados com as células endoteliais, tanto estática quanto dinamicamente para incubação estática, módulos mistos com células endoteliais por inversão e, em seguida, colocam o tubo na posição vertical a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após 15 minutos, inverta o tubo novamente e incubado a 37 graus Celsius por mais 15 minutos.

Para incubar os módulos com as células endoteliais dinamicamente, balance suavemente o tubo de 15 mililitros a 37 graus Celsius por 60 minutos. Quando a incubação com as células endoteliais estiver concluída, transfira os módulos para uma placa não tratada com cultura de tecidos e incube durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte, coloque os módulos em uma nova placa não tratada com cultura de tecidos com meio fresco para remover as células endoteliais não aderidas. Incubar módulos que são revestidos com células endoteliais a 37 graus Celsius até que as células cubram 100% da superfície dos módulos.

Isso geralmente leva cerca de sete dias. Os módulos parecerão cilíndricos quando forem removidos do tubo pela primeira vez. Se forem revestidos com células endoteliais, podem contrair até 50% em volume e desenvolver uma forma oval, além de se tornarem mais densos e opacos quando vistos por microscopia de luz.

Nessas imagens, o diâmetro e o comprimento dos módulos são indicados por d e l, respectivamente. A próxima imagem mostra duas células Hep G incorporadas uniformemente distribuídas dentro dos módulos no momento da fabricação. As células mantiveram alta viabilidade, conforme indicado pela cor verde das células vivas.

As células mortas seriam vermelhas quando as células endoteliais são confluentes. Na superfície dos módulos, há uma formação de junções apertadas, que podem ser vistas por imunofluorescência. A coloração da análise de transferência de massa de caderina VE demonstrou que os módulos são capazes de suportar altas densidades celulares sem desenvolver um núcleo necrótico devido ao transporte inadequado de oxigênio, o que geralmente é problemático em tecidos maiores.

Neste exemplo, a coloração massen Tri chro de pequenos módulos típicos mostra que os módulos mantiveram uma distribuição uniforme e alta de células vivas sete dias após a fabricação. Em contraste, um grande número de células mortas se formou dentro do núcleo dos grandes módulos, deixando apenas uma fina borda de células viáveis. Os módulos também foram produzidos com uma mistura de colágeno e um polímero ine ou contendo microesferas eluidoras de drogas.

Aqui, quando as células h hm EC one estão assentadas nos módulos de colágeno palin, os módulos mantêm sua forma cilíndrica e há propriedades limitadas de fixação celular em comparação com os módulos apenas de colágeno. Uma imagem de microscópio de luz de um módulo de colágeno contendo microesferas biodegradáveis à base de PLGA é mostrada aqui. Vários ensaios in vitro demonstraram ser compatíveis com módulos.

Por exemplo, em um ensaio de angiogênese, formações capilares em um módulo assentado com células endoteliais podem ser facilmente detectadas e quantificadas após cinco dias de incubação com células-tronco derivadas de tecido adiposo. Em outro exemplo, imagens de microscopia confocal de um ensaio de mortos-vivos em módulos mostram células vivas coradas de verde e células mortas coradas de vermelho. Finalmente, módulos também foram usados em câmaras microfluídicas e implantados em camundongos e ratos para estudar a interação entre diferentes tipos de células e como os microtecidos são remodelados pela resposta do hospedeiro.

Após o procedimento, os módulos podem ser cultivados em uma placa de Petri ou outros vasos, como um biorreator ou um dispositivo microfluídico. Este método também pode ser adaptado para criar tecidos diferentes usando várias combinações de tipos de células ou usando tubos com diâmetros diferentes. Obrigado por assistir.