Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Este vídeo demonstra um procedimento para analisar a morfologia de dendritos e axônios, coletivamente conhecidos como neuritos, utilizando um programa semiautomatizado com o objetivo de observar alterações locais. O software First Neuron J é usado para traçar imagens TIFF de oito bits de neurônios, a fim de identificar a posição dos segmentos de neuritos. Em seguida, o software Neuron Studio é utilizado para definir informações estruturais sobre a conectividade entre os neuritos.

Por fim, o programa MATLAB bonfire é executado para extrair dados morfológicos das células, incluindo a análise de shoal, bem como o número de pontos de ramificação e extremidades de neuritos. Os resultados mostram alterações locais na morfologia dos neuritos com base no desempenho da análise de shoal em sub-regiões do arborizado neurítico. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a análise de shoal feita manualmente, é que o programa é semi-automatizado, o que aumenta significativamente a eficiência da análise e permite que os dados sejam auditados, de modo que a precisão da análise possa ser verificada.

Quem demonstrará o procedimento será um estudante de graduação da Hirsch AWA, trabalhando no laboratório Firestein durante o verão. Para utilizar o programa bonfire na análise das características morfológicas dos neuritos, imagens TIFF de oito bits de neurônios individuais devem ser obtidas após o download do programa bonfire. As configurações do programa devem ser ajustadas com base na resolução das imagens que você deseja analisar; na seção parâmetros do bonfire do programa bonfire, substitua o valor atual da variável picks conversion pelo valor da resolução de suas imagens.

Para que o bonfire analise os dados, os arquivos devem ser organizados em uma estrutura específica, incluindo uma pasta principal, uma pasta bonfire contendo os arquivos MATLAB M do bonfire, subpastas contendo cada uma das diferentes condições e os arquivos de imagem celular dentro das pastas das diferentes condições; comece preparando a imagem para o rastreamento. Para este experimento, apenas as dendrites serão rastreadas, a fim de analisar alterações na morfologia dendrítica. Inicie preparando a imagem para o rastreamento.

Abra a imagem selecionando o botão de abrir na barra de ferramentas do NeuronJ e escolha a imagem que deseja rastrear. Agora, redimensione a imagem selecionando o botão de maximizar para ajustar o brilho e o contraste da imagem, de modo que você possa visualizar todos os neuritos. Selecione a imagem na barra de ferramentas do NeuronJ e, em seguida, escolha ajustar brilho e contraste. Para iniciar o rastreamento, selecione o botão adicionar traços na barra de ferramentas do NeuronJ e contorne o perímetro do corpo celular.

Em seguida, selecione o botão de contornos de rótulo na barra de ferramentas do Neuron J e escolha N um no menu suspenso ID de contorno; selecione o tipo zero seis na janela de atributos do Neuron J e clique em OK. Para iniciar o rastreamento dos neuritos, selecione o botão adicionar contornos na barra de ferramentas do Neuron J e adicione um contorno ao longo de cada ramo de neurito de interesse. É preferível que os segmentos desenhados terminem em cada ponto de bifurcação, com cada ramo descendente iniciando nesse ponto como um novo contorno.

Selecione o botão salvar traçados na barra de ferramentas do Neuron J e salve o traçado que você acabou de criar na mesma pasta do arquivo de imagem original. Em seguida, exporte os arquivos de traçado e os arquivos de identificação de traçado do Neuron J. Selecione o botão exportar traçado na barra de ferramentas do Neuron J. Agora, selecione a opção arquivos de texto separados por tabulação, arquivo separado para cada traçado, na caixa de diálogo de exportação do Neuron J e clique em OK, permitindo que o Neuron J escolha os nomes dos arquivos e o local de salvamento.

Selecione o botão medir traçados na barra de ferramentas do Neuron J e, em seguida, selecione a opção exibir medições de traçados na janela de medições do Neuron J. Selecione Executar Arquivo na janela de traçados do Neuron J e, depois, selecione Salvar como e salve o arquivo. O nome do arquivo deve corresponder exatamente ao nome do arquivo de imagem original, seguido por sublinhado info, e não deve conter uma extensão de arquivo de três letras. Verifique se o seu computador não adiciona automaticamente uma extensão de arquivo XLS.

Se isso ocorrer, a extensão do arquivo deve ser excluída manualmente. Primeiro, reorganize as pastas usando o bonfire load abrindo o matlab e clicando no botão com três pontos no canto superior direito da janela de comando. Selecione a pasta bonfire na sua pasta principal na janela de busca de pasta, digite bonfire load na janela de comando e pressione enter.

Selecione a pasta de condição que deseja analisar na janela Procurar pasta e clique em OK. Isso reorganizará a estrutura de pastas criando subpastas de células contendo todos os dados de cada célula individual. Agora, para criar arquivos com nome de arquivo_sublinhado premium swc, digite bonfire_sublinhado NDF dois s WC na janela de comando e pressione Enter.

Selecione a mesma pasta de condição que foi recém-organizada com o carregamento do bonfire na janela de procura de pasta e selecione Ok. Isso criará um arquivo WC em cada pasta de célula para a condição escolhida. Cada pasta de célula conterá cinco arquivos.

A imagem TIF original, o arquivo NDF, as informações com sublinhado, o arquivo de identificação de traços, um arquivo TXT e um arquivo swc. Antes de usar o Neuron Studio, recomendamos que você se familiarize com os recursos e atalhos do programa. Eles possuem um excelente manual do usuário online, e conhecer os atalhos de teclado economizará muito tempo.

Para começar, abra o programa Neuron Studio e selecione arquivo aberto na barra de ferramentas do Neuron Studio, localize a imagem TIF do neurônio que deseja editar e abra-a. Selecione configurações de execução e insira um em cada uma das três caixas.

No campo tamanho do voxel, selecione a importação de arquivo s wc. Selecione o arquivo s WC apropriado que corresponda ao arquivo com o qual você deseja trabalhar. O arquivo de imagem será agora sobreposto com a imagem de rastreamento.

O corpo celular deve ser sobreposto por um círculo vermelho para ligar os neuritos. Utilize a ferramenta de neurito para unir os nós de forma que cada ponto de ramificação, representado por nós amarelos, possa criar apenas duas ramificações. Todos os traçados devem ser contínuos com o corpo celular.

Agora, para exportar dados do Neuron Studio, selecione arquivo, salve os neuritos e salve com o nome padrão para verificar erros nos arquivos swc digitando bonfire trace. Acesse a janela de comandos e pressione enter. Selecione a pasta da condição que contém os dados que foram processados recentemente na janela procurar pasta e selecione ok se houver quaisquer erros em alguma das imagens na pasta.

O programa gerará imagens exibindo onde o erro está localizado para extrair dados morfológicos dos arquivos dot S WC. Digite bonfire na janela de comando e pressione enter. Selecione a pasta da condição que deseja analisar na janela de procura por pasta e selecione ok para cada um dos neurônios de interesse.

A análise bonfire gerará um gráfico da morfologia neuronal juntamente com os anéis periféricos utilizados na análise. Além disso, o comando bonfire gerará o arquivo MAT que contém todas as informações morfológicas obtidas a partir da análise. Para visualizar os gráficos preliminares dos dados, digite bonfire results na janela de comando do MATLAB, selecione a pasta da condição que deseja visualizar na janela de busca de pasta e clique em Ok.

A janela de navegação por pasta será fechada temporariamente e reaberta, permitindo a seleção de condições adicionais. Após a seleção das condições, selecione cancelar para sair do processo de seleção. O resultado do Bonfire retornará gráficos resumo incluindo os dados das pastas de condições que você selecionou para exportar os dados morfológicos para o Excel, tipo Bonfire Export, na janela de comando do MATLAB.

Selecione a pasta da condição contendo os dados que deseja exportar na janela de procura por pasta e clique em OK. O bonfire export criará arquivos Excel com os dados morfológicos e os colocará na pasta da condição que foi selecionada. Agora mostraremos um exemplo dos dados gerados pelo programa bonfire em um conjunto de dados contendo duas condições.

Estas são imagens invertidas de exemplo de ambas as condições. Pode-se observar nessas imagens que a condição um contém mais dendritos do que a condição dois. Esse fenômeno também pode ser observado em uma variedade de gráficos gerados pelo programa bonfire.

Como o programa bonfire realiza sua análise em sub-regiões dos dendritos, os dendritos aumentados na condição um podem ser facilmente identificados; traçar a curva do arborização dendrítica total mostra que há mais dendritos distais ao corpo celular para os neurônios da condição um. Traçar o número médio de pontos de ramificação e pontos terminais por célula mostra que a condição um contém mais pontos de ramificação e mais pontos terminais do que a condição dois. O número médio de processos por célula é mostrado para dendritos primários, secundários, terciários ou de ordem superior. Há mais dendritos terciários e de ordem superior na condição um. Traçar o número médio de processos por célula para dendritos radiculares, intermediários e terminais mostra que a condição um possui mais processos intermediários ou terminais do que a condição dois.

Mostram-se aqui as curvas de análise de cardume específicas para identidade de segmento, nas quais os segmentos são agrupados como primários, secundários ou terciários ou superiores. O aumento nos dendritos terciários ocorre distal ao corpo celular para neurônios da condição um. Apresentam-se as curvas de análise de cardume específicas para identidade de segmento, nas quais os segmentos são agrupados como segmentos basais, segmentos intermediários ou segmentos terminais.

O aumento nos dendritos intermediários e terminais na condição um ocorre distalmente ao corpo celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a análise de agrupamento usando o programa bonfire para observar alterações locais na neuro morfologia.