Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Nós desenvolvemos um programa de computador para analisar a morfologia neuronal. Em combinação com dois existentes ferramentas de análise de código aberto, o nosso programa realiza análise de Sholl e determina o número de neurites, pontos de ramificação, e dicas de neurite. As análises são realizadas para que as mudanças locais na morfologia neurite pode ser observado.

Este vídeo demonstra um procedimento para analisar a morfologia de dendritos e axônios, conhecidos coletivamente como neuritos, usando um programa semi-automatizado para observar mudanças locais. O primeiro software neuron J é usado para rastrear imagens TIFF de oito bits de neurônios para identificar a posição dos segmentos de neuritos. O software Neuron Studio é então usado para definir informações estruturais sobre a conectividade entre os neuritos.

Finalmente, o programa MATLAB de fogueira é executado para extrair dados morfológicos das células, incluindo análise de cardumes, bem como o número de pontos de ramificação de neuritos e pontas de neuritos. Os resultados mostram mudanças locais na morfologia dos neuritos com base no desempenho da análise de cardumes nas sub-regiões da árvore neurótica. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a análise manual de cardumes, é que o programa é semiautomatizado, o que aumenta muito a eficiência da análise e permite que os dados sejam auditados para que a precisão da análise possa ser verificada.

Demonstrando o procedimento estará o aluno de graduação da Hirsch AWA trabalhando no laboratório de Firestein durante o verão. Para usar o programa fogueira para analisar as características morfológicas do Neurites eight bit tiff, imagens de neurônios individuais devem ser obtidas após o download do programa fogueira. As configurações do programa devem ser ajustadas com base na resolução da imagem das imagens que você deseja analisar na parte de parâmetros da fogueira do programa de fogueira, substitua o valor atual para a conversão de escolhas variáveis pelo valor da resolução da imagem de suas imagens.

Para que o bonfire analise os dados, os arquivos devem ser organizados em uma estrutura específica, incluindo uma pasta mestra, uma pasta bonfire contendo os arquivos bonfire MATLAB M, subpastas contendo cada uma das diferentes condições e os arquivos de imagem da célula dentro das diferentes pastas de condição começam preparando a imagem para rastreamento. Para este experimento, apenas os dendritos serão rastreados a fim de analisar as mudanças na morfologia dendrítica. Comece preparando a imagem para traçado.

Abra a imagem selecionando o botão abrir na barra de ferramentas neuron J e selecione a imagem que deseja traçar. Agora, redimensione a imagem selecionando o botão maximizar para ajustar o brilho e o contraste da imagem para que você possa visualizar todas as imagens selecionadas de neurites na barra de ferramentas do neurônio J e, em seguida, selecione ajustar o contraste de brilho. Para iniciar o rastreamento, selecione o botão adicionar traços na barra de ferramentas do neurônio J Trace ao redor do perímetro do corpo celular.

Em seguida, selecione o botão de rastreamento de rótulo na barra de ferramentas do neurônio J e selecione N um no menu suspenso ID de rastreamento, selecione o tipo zero seis na janela de atributos do neurônio J e selecione OK. Para começar a rastrear os neurites, selecione o botão adicionar traços na barra de ferramentas do neurônio J e adicione um traço ao longo de cada ramo de neurite de interesse. É melhor que os segmentos desenhados parem em cada ponto de ramificação com cada ponto de ramificação filha, começando nesse ponto como um novo traço.

Selecione o botão salvar traçados na barra de ferramentas neuron J e salve o traçado que você acabou de criar na mesma pasta que o arquivo de imagem original. Em seguida, exporte os arquivos de rastreamento e os arquivos identificadores de rastreamento do neuron J.Selecione o botão exportar rastreamento na barra de ferramentas do neuron J. Agora selecione a opção de arquivos de texto delimitados por tabulação, arquivo separado para cada rastreamento na caixa de diálogo de exportação do neurônio J e selecione ok, permitir que o neurônio J escolha os nomes dos arquivos e o local de salvamento.

Selecione o botão de rastreamento de medida na barra de ferramentas do neurônio J e, em seguida, selecione a opção exibir medições de rastreamento na janela de medições do neurônio J e selecione executar Selecionar arquivo na janela de rastreamento do neurônio J e, em seguida, selecione salvar como e salve o arquivo. O nome do arquivo deve corresponder exatamente ao nome do arquivo de imagem original, seguido por informações de sublinhado e não deve conter uma extensão de arquivo de três letras. Verifique se o seu computador não adiciona automaticamente uma extensão de arquivo XLS.

Em caso afirmativo, a extensão do arquivo deve ser excluída manualmente. Primeiro, reorganize as pastas usando bonfire load abrindo o matlab e clicando no botão de três pontos no canto superior direito da janela de comando. Selecione a pasta bonfire em sua pasta mestra na janela procurar pasta, digite bonfire load na janela de comando e pressione enter.

Selecione a pasta de condição que deseja analisar na pasta de procuração, janela e seleção. Okey. Isso reorganizará a estrutura de pastas criando subpastas de células contendo todos os dados de cada célula individual. Agora, para criar o nome do arquivo, sublinhe os arquivos swc premium, digite fogueira, sublinhado NDF dois s WC na janela de comando e pressione Enter.

Selecione a mesma pasta de condição que acabou de ser reorganizada com bonfire load na janela procurar pasta e selecione. Okey. Isso criará um arquivo WC em cada pasta de célula para a condição escolhida. Cada pasta de célula conterá cinco arquivos.

A imagem TIF original, o arquivo NDF, as informações de sublinhado, o arquivo identificador de rastreamento, um arquivo TXT e um arquivo swc. Antes de usar o Neuron Studio, recomendamos que você se familiarize com os recursos e atalhos do programa. Eles têm um excelente manual do usuário on-line e conhecer os atalhos de teclado economizará muito tempo.

Para começar, abra o programa neuron studio e selecione file open na barra de ferramentas do neuron studio, encontre a imagem TIF do neurônio. Você deseja editá-lo e abri-lo. Selecione as configurações de execução e insira uma em cada uma das três caixas.

Na janela de tamanho do voxel, selecione file import s wc. Selecione o arquivo s WC apropriado que corresponda ao arquivo com o qual você deseja trabalhar. O arquivo de imagem agora será sobreposto com a imagem de rastreamento.

O soma celular deve ser coberto com um círculo vermelho para ligar os neuritos. Use a ferramenta neurite para unir nós de modo que cada ponto de ramificação representado por nós amarelos possa criar apenas duas ramificações. Todos os traços devem ser contínuos com o soma.

Agora, para exportar dados do Neuron Studio, selecione o arquivo, salve neurites e salve como o nome padrão para verificar se há erros nos arquivos swc, digite bonfire trace. Verifique a janela de comando e pressione Enter. Selecione a pasta de condição que contém os dados que acabaram de ser processados na janela procurar pasta e selecione OK se houver algum erro em qualquer uma das imagens na pasta.

O programa produzirá imagens exibindo onde o erro está localizado para extrair dados morfológicos dos arquivos WC dot S. Digite fogueira na janela de comando e pressione Enter. Selecione a pasta de condição que deseja analisar na janela procurar pasta e selecione ok para cada um dos neurônios de interesse.

A análise da fogueira gerará um gráfico da morfologia neuronal junto com os anéis de ombro usados na análise. Além disso, o comando bonfire gerará o arquivo MAT que contém todas as informações morfológicas que foram retiradas da análise. Para visualizar os gráficos preliminares dos resultados da fogueira do tipo de dados na janela de comando do MATLAB, selecione a pasta de condição para a condição a ser visualizada na janela procurar pasta e selecione. Okey.

A janela de navegação por pasta será fechada temporariamente e reaberta, permitindo que condições adicionais sejam selecionadas. Uma vez selecionadas as condições, selecionar cancelar para sair do processo de seleção. O resultado da fogueira retornará gráficos de resumo, incluindo os dados das pastas de condições que você selecionou para exportar os dados morfológicos para o tipo Excel Exportar fogueira para a janela de comando do MATLAB.

Selecione a pasta de condição que contém os dados que você deseja exportar na janela de procura de pasta e selecione. Ok, a exportação da fogueira criará arquivos do Excel dos dados morfológicos e os colocará na pasta de condições selecionada. Agora mostraremos um exemplo dos dados gerados pelo programa fogueira em um conjunto de dados contendo duas condições.

Estes são exemplos de imagens invertidas de ambas as condições. Pode-se ver nessas imagens que a condição um contém mais dendritos do que a condição dois. Esse fenômeno também pode ser observado em uma variedade de gráficos gerados pelo programa fogueira.

Como o programa da fogueira realiza sua análise em sub-regiões dos dendritos, o aumento dos dendritos na condição um pode ser prontamente identificado, traçar a curva de cardume da árvore dendrítica total mostra que há mais dendritos distais ao corpo celular para neurônios da condição um plotar o número médio de pontos de ramificação e pontos terminais por célula mostra que a condição um contém mais pontos de ramificação e mais pontos terminais do que a condição dois. O número médio de processos por célula é mostrado para dendritos primários, secundários, terciários ou de ordem superior. Existem mais dendritos terciários e de ordem superior para a condição um, traçar o número médio de processos por célula para dendritos raiz, intermediários e terminais mostra que a condição um tem mais processos intermediários ou terminais do que a condição dois.

Aqui estão as curvas de análise de cardume específicas da identidade do segmento nas quais os segmentos são agrupados como primário, secundário ou terciário ou maior. O aumento de dendritos terciários ocorre distal ao corpo celular para neurônios de condição um. As curvas de análise de cardume específicas da identidade do segmento são mostradas nas quais os segmentos são agrupados como segmentos raiz, segmentos intermediários ou segmentos terminais.

O aumento de dendritos intermediários e terminais na condição um ocorre distal ao corpo celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a análise do cardume usando o programa fogueira para observar mudanças locais na neuromorfologia.