Name: Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Aprenda a reconstruir a morfologia de neurônios marcados por vírus e realizar análises de clustering imparcial para classificar subclasses neuronais distintas em amostras de tecido cerebral de primatas.

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Nós gostaríamos de agradecer Drs. Ed Callaway e Marty Usrey por nos permitir usar o tecido preparado como parte de um estudo prévio e Libby Fairless e Shiyuan Liu para ajudar com reconstruções neuronais. Este trabalho foi financiado pelo NIH (NEI: EY018683) e da Fundação Whitehall.

<ol><li>Cajal, S. R. y <a target="_blank" href="https://archive.org/details/b2129592x_0001">Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres</a>. , Maloine. (1911).</li>
<li>Seung, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+functional+connectomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toward functional connectomics.</a> Nature. 471, 170-172 (2011).</li>
<li>Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+circuit+tracing+with+neurotropic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).</li>
<li>Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+neuronal+tracing+with+a+deletion-mutant+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus.</a> Nature Methods. 4, 47-49 (2007).</li>
<li>Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+substrates+for+parallel+streams+of+corticogeniculate+feedback+originating+in+both+V1+and+V2+of+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey.</a> Neuron. 90, 388-399 (2016).</li>
<li>Cauli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+fusiform+neocortical+interneurons+based+on+unsupervised+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering.</a> PNAS. 97, 6144-6149 (2000).</li>
<li>Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+visual+sector+thalamic+reticular+neurons+in+the+macaque+monkey+sugests+retinotopically-specialized%2C+parallel+stream-mixed+input+to+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus.</a> J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/neuron/abstract/S0896-6273(11)00600-3">New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits.</a> Neuron. 71, 617-631 (2011).</li>
<li>Callaway, E. M., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+with+glycoprotein-deleted+rabies+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses.</a> Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).</li>
<li>Nhan, H. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+superior+colliculus-+and+middle+temporal+area-projecting+neurons+in+primate+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex.</a> J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thalamic+reticular+nucleus%3A+structure%2C+function+and+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept.</a> Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, e3564(2012).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Research. 171, 11-28 (1979).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+neuroanatomical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Basic neuroanatomical methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1(2003).</li>
<li>Thorndike, R. L. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10.1.1.177.7605">Who belongs in the family?</a> Psychometrika. 18, 267-276 (1953).</li>
<li>Talebi, V., Baker, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Categorically+distinct+types+of+receptive+fields+in+early+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).</li>
<li>Helmstaedter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomic+reconstruction+of+the+inner+plexiform+layer+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina.</a> Nature. 500, 168-174 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

estudos neuroanatômicos mantiveram-se um dos pilares da neurociência e recente interesse em conectonomia e relações estrutura-função renovou o entusiasmo para a caracterização morfológica detalhada de populações neuronais selectivos. Tradicionalmente, os estudos neuroanatômicos têm contado com classificações qualitativas de neurônios em classes morfologicamente distintas de neurônios definidos pela neuroanatomistas especializados. Com os avanços nas técnicas de reconstrução de neurônios e extração de dados morfológicos,...

Neuroanatomia é um dos fundamentos da neurociência 1 e interesse recente no &quot;conectonomia&quot; renovou o entusiasmo para a compreensão da diversidade morfológica de populações neuronais e as conexões entre os neurônios específicos 2. Métodos para a rotulagem e neurônios reconstruindo melhoraram muito com as recentes inovações, incluindo o rastreamento circuito genético e mediada por vírus aproxima 3, 4, permitindo pesquisas morfológicas mais abrangentes de populações neuronais 5. Além de melhorias na rotulagem neurônios individuais, técnicas de análise de dados quantitativos também surgiram que permitem a classificação independente e imparcial de neurônios em subpopulações distintas com base em dados morfológicos 5, 6. Estas técnicas imparciais são uma melhoria em cima mais traditional métodos de classificação qualitativos que têm sido o padrão no campo por mais de um século. O objetivo deste estudo é delinear, passo-a-passo, a combinação de rotulagem mediada por vírus de neurônios dentro de uma população seletiva, reconstruções em larga escala de uma amostra abrangente desses neurônios, e análise quantitativa dos dados baseados em agrupamento independente com avaliação estatística. Ao combinar esses métodos, destacamos uma nova abordagem para a recolha e análise de dados neuroanatômicos para facilitar a amostragem completa e classificação imparcial de tipos neuronais morfologicamente únicas dentro de uma população neuronal selectiva. Como um exemplo destes métodos, que descrevem a análise de uma grande população de neurónios dentro de um único sector de o núcleo reticular talâmico (TRN) do macaco macaque. Estes dados são de um estudo prévio 7. Métodos para marcar seletivamente neurônios TRN salientes ao latera dorsall geniculate núcleo do tálamo (dLGN) usando a injeção cirúrgica do vírus da raiva modificado que codifica EGFP 4, 8 (ver Tabela de materiais específicos / Equipamentos, linha 2) são delineadas. Este vírus da raiva modificada não tem o gene que codifica para uma proteína de revestimento essencial, eliminando o movimento trans-sináptica do vírus. Uma vez que o virus entra terminais de axónios no local da injecção, ela age como um traçador retrógrado tradicional com a importante vantagem de dirigir a expressão de EGFP em toda a arborização dendrítica completa de neurónios infectados 5, 9, 10. Por conseguinte, este vírus da raiva suprimida-G pode ser utilizada para infectar selectivamente e rotular qualquer população de neurónios a seguir à injecção e transporte retrógrado. Para realizar uma análise global de uma população neuronal específica, é importante para provar a partir deuma ampla distribuição dos neurónios dentro da população. Uma vez que a técnica de marcação mediada por vírus produz intracelular completo &quot;, de Golgi-like&quot; enche de muitos neurónios com axónios no local da injecção do vírus, é possível reconstituir uma amostra muito grande dos neurónios dentro de toda a extensão de uma estrutura do cérebro. Além disso, porque o vírus da raiva modificado é tão eficaz em infectar e rotulagem de grandes números de neurónios, é possível reconstruir centenas de neurónios por animal. Os procedimentos de amostragem 160 neurónios em todo o sector visual da TRN 11, a fim de gerar uma amostra global de dLGN-se projectam neurónios TRN são descritas. O processo de reconstrução neurônios individuais usando um sistema de reconstrução neurônio incluindo um microscópio, câmera e software de reconstrução é descrito. Também são descritos métodos para determinar as posições de neurônios individuais dentro de uma estrutura cerebral (neste caso dentro da TRN) e verificar vírus injecção site volume e localização dentro de uma estrutura (neste caso, dentro do dLGN) usando reconstruções contorno volumétricos. Etapas para exportar dados morfológicos e executar agrupamento independente análises com base em métricas morfológicas medidos para cada neurônio são delineadas. Existem limitações para métodos de agrupamento e também há uma variedade de diferentes algoritmos de agrupamento disponíveis. Assim, estas opções e os benefícios de alguns dos algoritmos mais comumente utilizados são descritos. A análise de cluster não fornece verificação estatística da singularidade de clusters. Por conseguinte, os passos adicionais são descritos para verificar agrupamento óptima, bem como as relações entre os dados morfológicos dentro e entre grupos. métodos estatísticos para avaliar os clusters para o conjunto de dados de TRN para confirmar que os neurônios TRN são agrupados em três grupos exclusivos com base em 10 métricas morfológicas independentes são descritos. Assim, por delinear passos para a rotulagem selectiva, Reconstruir, e análise de dados morfológicos a partir de uma população neuronal específica, que descrevem métodos para quantificar diferenças morfológicas entre os neurónios dentro de uma população. achados anteriores de tipos neuronais distintas dentro do setor visual da TRN macaco macaque são confirmadas com métodos distintos de avaliação estatística. Juntos, esperamos que estas técnicas serão amplamente aplicável a conjuntos de dados neuroanatômicos e ajudar a estabelecer a classificação quantitativa da diversidade de populações neuronais através do cérebro.

<table><tbody><tr><td>TRISTE & Delta; G-EGFP</td><td>E.M. Laboratório Callaway, Instituto</td><td></td> Salk <td>Preparado pelo Dr. F. Osakada. Vírus da raiva deletado por G disponível através do Salk Institute Viral Core</td></tr><tr><td>Eletrodo de gravação: platina/irídio ou tungstênio</td><td>FHC</td><td>UEPSGGSE1N2M</td><td>Visite o site (www.fh-co.com) para especificações de pedidos alternativos</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummod Scientific</td><td>3-000-204, 110V</td><td>Alternativas: picospritzer, seringa Hamilton</td></tr><tr><td>Micrótomo de congelamento</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5905-50TAB</td><td>3,3'-Diaminobenzidina tetracloridrato, comprimido, substrato de 10 mg por comprimido. Cuidado: cancerígeno - deve ser branqueado antes de descartar</td></tr><tr><td>o Citocromo C</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2037-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldich</td><td>C9322-5G</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Life Technologies/Thermo Fisher</td><td>#A-11122&nbsp;</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>Vetor anti-coelho de cabra biotinilado</td><td>Laboratories</td><td>#BA-1000</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Sistema Neurolucida&nbsp;</td>Software <td>MicroBrightField</td><td></td><td>para rastreamento e análise de neurônios. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida</td></tr><tr><td>Neurolucida Explorer</td><td>MicroBrightField</td><td></td><td>Software de exportação de dados</td></tr><tr><td>Microfire Camera&nbsp;</td>Câmera de microscópio de cores <td>verdadeiras Optronics</td><td></td><td>de 2 megapixels. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf</td></tr><tr><td>Microscópio Nikon E800 Nikon</td><td>Instruments Inc.</td><td></td><td>Microscópio de pesquisa biológica. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Software de matemática computacional baseado em matriz. http://www.mathworks.com</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Programa de planilha</td> <td>da Microsoft</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstruções em larga escala e, clustering imparcial independente baseado no morfológicas métricas para classificar neurônios no seletivos populações

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de neurônios combinados com o uso de agrupamento independente e imparcial análises para criar um completo levantamento das características morfológicas observadas entre uma população neuronal selectiva. Combinação destas técnicas constitui uma nova abordagem para a recolha e análise de dados neuroanatômicos. Em conjunto, estas técnicas permitem em grande escala, e, portanto, mais abrangente, a amostragem de populações neuronais selectivos e estabelecer métodos quantitativos imparciais para descrever as classes neuronais morfologicamente únicos dentro de uma população. O protocolo descreve o uso de vírus da raiva modificado para etiquetar selectivamente neurónios. G-excluído atos de vírus da raiva como um traçador retrógrado após injecção estereotáxica em uma estrutura do cérebro alvo de interesse e serve como um veículo para a entrega e expressão de EGFP em neurônios. Um grande número de neurônios estão infectados usando estetécnica e expressar GFP ao longo de suas dendrites, produzindo &quot;Golgi-like&quot; preenchimentos completos de neurônios individuais. Por conseguinte, o método de rastreamento retrógrado mediada por vírus melhora nas técnicas tradicionais de rastreamento retrógrado à base de corantes, produzindo preenchimentos intracelulares completos. Neurónios individuais bem isoladas que abrangem todas as regiões do cérebro a área sob estudo são seleccionados para a reconstrução, a fim de obter uma amostra representativa de neurónios. O protocolo descreve os procedimentos para reconstruir corpos celulares e completar padrões de arborização dendrítica de neurônios marcados abrangendo vários cortes de tecido. Os dados morfológicos, incluindo as posições de cada neurónio dentro da estrutura do cérebro, são extraídas para análise posterior. funções de programação padrão foram utilizados para realizar conjunto independente de análises e avaliações de cluster com base em métricas morfológicas. Para verificar a utilidade destas análises, a avaliação estatística de uma análise de agrupamento performada em 160 neurônios reconstruídos no núcleo reticular talâmico do tálamo (TRN) do macaco macaque foi feita. Tanto a análise de cluster original e as avaliações estatísticas realizadas aqui indicam que os neurônios TRN são separados em três subpopulações, cada um com características morfológicas únicas.

Nós mostramos anteriormente que reconstruções em larga escala de neurónios dentro de uma população selectiva é viável injecção seguinte de vírus da raiva modificado no dLGN 5. Recentemente, o mesmo tecido foi utilizada para reconstruir 160 neurónios no sector visual da TRN (Bragg et ai, na avaliação;. A Figura 2A-B) seguindo os passos metodológicos detalhados descritos acima. No estudo TRN, três conjuntos únicos de neurónios TRN foram identif...

Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de populações neuronais selectivos, marcados após a infecção retrógrada com um vírus da raiva modificado expressando marcadores fluorescentes, e análises independentes cluster, imparcial que permitem a caracterização abrangente de métricas morfológicas entre subclasses neuronais distintas.

Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Os objetivos deste protocolo são descrever os passos para reconstruir a morfologia de neurônios marcados com vírus e realizar análises independentes e imparciais de agrupamento em populações de neurônios marcados, permitindo a caracterização abrangente de métricas morfológicas ao longo de subclasses neuronais distintas. Descrevemos uma abordagem inovadora para coletar e analisar dados neuroanatômicos, facilitando uma amostragem mais abrangente e uma classificação imparcial de tipos neuronais morfologicamente únicos dentro de uma população neuronal específica. A principal vantagem desta técnica é que ela permite análise em larga escala da morfologia neuronal e utiliza métodos imparciais para classificar subclasses neuronais distintas.Os aspectos mais desafiadores das reconstruções morfológicas são a seleção de neurônios bem isolados para reconstrução, a atribuição da profundidade z correta e o alinhamento dos arbórios para continuar as reconstruções em seções adjacentes de tecido. Inicie uma reconstrução selecionando uma lâmina contendo uma seção de tecido cerebral corada de 50 mícrons de um primata injetado estereotaxicamente com vírus da raiva modificado que expressa EGFP. Coloque

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Neurociência

Nós desenvolvemos um programa de computador para analisar a morfologia neuronal. Em combinação com dois existentes ferramentas de análise de código aberto, o nosso programa realiza análise de Sholl e determina o número de neurites, pontos de ramificação, e dicas de neurite. As análises são realizadas para que as mudanças locais na morfologia neurite pode ser observado.

Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Aqui, mostramos como analisar roteamento dendrítica de neurônios da medula Drosophila em colunas e camadas. O fluxo de trabalho inclui uma técnica de imagem dual-vista a melhorar a qualidade de imagem e ferramentas computacionais para a detecção, registrar mandris dendríticas para a matriz coluna de referência e para analisar as estruturas dendríticas no espaço 3D.

Analisando dendríticas Morfologia em Colunas e Camadas

Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

Aqui, nós fornecemos um fluxo de trabalho que permite a identificação de células saudáveis e patológicas, com base em sua forma 3-dimensional. Descrevemos o processo de usar contornos 2D projeção com base nas superfícies 3D para treinar um mapa auto-organizável que fornecerá a clusterização objetiva das populações investigadas célula.

Baseado na morfologia distinção entre saudável e patológico células utilizando transformações de Fourier e auto-organização mapas

O protocolo descrito aqui descreve a análise de imunofluorescência, recuperação de biocytin e reconstruções de alta qualidade de hippocampal CA2 interneurônios seguindo o intracelulares gravações eletrofisiológicas in vitro, permitindo neuronal caracterização e anatomia neuronal, finalmente, bem a ser estudado.

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O pipeline descrito é projetado para a segmentação de conjuntos de dados de microscopia eletrônica maiores que gigabytes, para extrair morfologias de células inteiras. Uma vez que as células são reconstruídas em 3D, software personalizado projetado em torno de necessidades individuais pode ser usado para executar uma análise qualitativa e quantitativa diretamente em 3D, também usando a realidade virtual para superar a oclusão de visão.

Um método para reconstrução 3D e análise de realidade virtual de células gliais e neuronais

Apresentado é uma ferramenta computacional que permite a medição automática simples e direta das orientações de ramos dendríticas neuronais a partir de imagens de fluorescência 2D.

Identificação Automática de Ramos Dendráticos e sua Orientação

O protocolo fornece um método detalhado de imagem neuronal na fatia cerebral usando um método de limpeza tecidual, ScaleSF. O protocolo inclui preparação de tecidos cerebrais, esclarecimento de tecidos, manuseio de fatias limpas e microscopia de varredura a laser confocal de estruturas neuronais de níveis mesoscópicos a microscópicos.

Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas

Os ensaios de crescimento de neuritos fornecem um valor quantitativo sobre os processos neuronais regenerativos. A vantagem deste software semiautomático é que ele segmenta corpos celulares e neurites separadamente, criando uma máscara e mede vários parâmetros, como comprimento de neurites, número de pontos de ramificação, área de aglomerado de células-corpo e número de aglomerados de células.

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A técnica é descrita para quantificar a resposta fisiológica em vivo dos neurônios de mamíferos durante o movimento e correlacionar a fisiologia do neurônio com a morfologia neuronal, fenótipo neuroquímico e microcircuitos sináptica.

Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

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