Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações

Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de populações neuronais selectivos, marcados após a infecção retrógrada com um vírus da raiva modificado expressando marcadores fluorescentes, e análises independentes cluster, imparcial que permitem a caracterização abrangente de métricas morfológicas entre subclasses neuronais distintas.

Os objetivos deste protocolo são descrever etapas para reconstruir a morfologia de neurônios marcados com vírus e realizar análises de cluster independentes e imparciais em populações de neurônios marcados para permitir a caracterização abrangente de métricas morfológicas ao longo de subclasses neuronais distintas. Descrevemos uma nova abordagem para coletar e analisar dados neuroanatômicos para facilitar uma amostragem mais abrangente e uma classificação imparcial de tipos neuronais morfologicamente únicos dentro de uma população neuronal seletiva. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a análise em larga escala da morfologia neuronal e utiliza métodos imparciais para classificar subclasses neuronais distintas.

Os aspectos mais desafiadores das reconstruções morfológicas são selecionar neurônios bem isolados para reconstruir, atribuir a profundidade z adequada e alinhar mandris para continuar as reconstruções em seções de tecido adjacentes. Comece uma reconstrução selecionando uma lâmina com uma seção de tecido cerebral corado de 50 mícrons de um primata injetado estereotaxicamente com o vírus da raiva modificado expressando EGFP. Coloque a lâmina no suporte da lâmina do microscópio e concentre-se em uma única seção de interesse usando uma objetiva de baixa ampliação.

Certifique-se de que a imagem da câmera esteja visível na imagem ao vivo posicionando corretamente o obturador da câmera. Escolha um neurônio rotulado razoavelmente isolado dentro da estrutura cerebral de interesse para permitir a reconstrução inequívoca da arborização dendrítica. Mude para ampliação de 10x e coloque a área em foco.

Escolha preferencialmente os neurônios se o corpo celular estiver totalmente dentro de uma única seção para estimar com precisão sua área e redondeza. Uma vez que um neurônio bem manchado e bem isolado seja escolhido, clique no botão de nova seção no software para adicionar a seção inicial contendo o corpo celular ao gerenciador de seção. Insira o número de seções a serem incluídas na reconstrução.

Recomende inserir duas a três seções para começar. Atribua uma espessura de seção de 50 mícrons. Escolha a objetiva de dois x, clique no botão de contorno na barra de ferramentas superior e escolha o tipo de contorno no menu suspenso.

Trace o contorno da estrutura de destino usando o mouse para clicar nos pontos ao longo do contorno. Quando terminar de traçar o contorno, clique com o botão direito do mouse e selecione fechar contorno no menu para fechar o contorno. Em seguida, com a visualização ainda em dois x, clique no símbolo do marcador desejado na barra de ferramentas à esquerda.

Em seguida, clique no centro da estrutura alvo para colocar o marcador. Quando os contornos estiverem concluídos, selecione a objetiva 40x ou 60x para traçar o contorno do corpo celular. Em seguida, selecione o botão de rastreamento de neurônios na barra de ferramentas superior e selecione a estrutura do neurônio a ser rastreada, neste caso, o corpo da célula, no menu suspenso.

Trace o corpo celular clicando nos pontos ao redor da maior extensão do corpo celular, ajustando a profundidade z conforme necessário para colocar o corpo celular em foco. E clique com o botão direito do mouse para finalizar o contorno do corpo celular. Em seguida, coloque um marcador de estilo diferente no centro do contorno do corpo celular, garantindo que o marcador esteja aproximadamente no centro na profundidade z.

É fundamental estabelecer a profundidade z correta na seção inicial. bem como nas seções adjacentes, antes de iniciar cada rastreamento para que os valores do eixo z sejam precisos. Para começar a traçar árvores dendríticas, selecione dendrito no menu suspenso superior.

Em seguida, trace cada dendrito começando no corpo celular. Quando um dendrito se ramificar, clique com o botão direito do mouse e selecione nó bifurcado ou nó trifurcado para colocar um nó neste ponto de ramificação. Certifique-se de ajustar a profundidade z em todo o traçado para capturar com precisão o ângulo e a direção do dendrito.

No final do dendrito nesta seção, clique com o botão direito do mouse e selecione o final no menu suspenso. Quando todas as árvores dendríticas forem traçadas na seção inicial, identifique as terminações dendríticas que provavelmente continuarão na seção adjacente. E coloque-os em foco na profundidade z apropriada na imagem do microscópio em 20x.

Inclua os principais pontos de referência próximos, como vasos sanguíneos ou padrões ou feixes de dendritos facilmente reconhecíveis na imagem do microscópio. Em seguida, tire uma foto da imagem ao vivo usando uma câmera digital portátil na tela do computador. Em seguida, mude a objetiva do microscópio para dois x e vá para a seção adjacente na lâmina.

Em seguida, alinhe os contornos da seção traçada anteriormente na visualização do software com os limites do LGN e TRN na nova seção. Retorne para 20x e alinhe usando pontos de referência. Em seguida, com o auxílio da foto das terminações dos dendritos da seção traçada anteriormente, mova o traçado para alinhar os dendritos usando primeiro a ferramenta de seta para selecionar a reconstrução.

Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione mover no menu suspenso e mova o rastreamento de acordo. Para girar o traçado, clique com o botão direito do mouse e selecione girar no menu suspenso e gire o traçado de acordo. Como alternativa, selecione a ferramenta de correspondência no menu suspenso de ferramentas superiores e selecione o número de pontos a serem correspondidos.

Em seguida, clique no final da reconstrução e no ponto de continuação correspondente na imagem ao vivo para combinar as terminações dendríticas com os inícios. Uma vez que o traçado da seção anterior esteja alinhado com os dendritos na nova seção, adicione uma nova seção ao gerenciador de seções como antes. Como alternativa, basta selecionar a seção adjacente que foi criada anteriormente e ajustar a profundidade z da mesma maneira.

Certifique-se de que a nova seção correspondente esteja selecionada no gerenciador de seções clicando na seção atual. Em seguida, depois de aumentar a ampliação para 40x ou 60x, selecione o dendrito usando a seta. Clique com o botão direito do mouse no final do dendrito da seção anterior e selecione adicionar ao final no menu suspenso.

Um prompt perguntará se a continuação está em uma nova seção. Clique em sim. Em seguida, trace a continuação do dendrito usando o mouse como ferramenta de desenho.

Tire fotos dos finais em preparação para o alinhamento com a próxima seção. Em seguida, adicione continuações aos traçados dendríticos até que pelo menos três seções sejam traçadas para o neurônio ou até que os dendritos não possam mais ser seguidos ou encontrados. Usando um programa de extração associado ao sistema de reconstrução de neurônios, abra um arquivo de reconstrução concluído.

No menu suspenso de edição, selecione selecionar todos os objetos. Selecione a análise da estrutura de ramificação na barra de ferramentas de análise superior e, em seguida, clique em cada guia e selecione as opções de análise desejadas em cada guia. Extraia todos os dados desejados clicando no botão OK na janela de análise e salve em formato de planilha clicando com o botão direito do mouse nas janelas de saída e selecionando exportar para o Excel para análise posterior.

Esta fotografia mostra uma única seção coronal através do LGN dorsal de um animal. A coloração da citocromo oxidase é usada para visualizar as camadas de LGN. E a coloração GFP marca o local da injeção do vírus.

A seta indica regiões de neurônios de núcleo reticular talâmico densos e rotulados de forma retral. A orientação da seção é de acordo com o compasso lateral medial ventral dorsal ilustrado. A barra de escala é ilustrada no canto inferior esquerdo.

Esta imagem mostra os contornos do LGN em vermelho e do TRN em marrom para todas as seções contendo injeção de vírus, conforme indicado pelos contornos pretos. Estrelas amarelas indicam centros de locais de injeção. Esta imagem mostra a renderização 3D dos contornos e do local da injeção.

Este é um mapa das localizações dos neurônios TRN reconstruídos codificados por cores de acordo com a atribuição de cluster dentro de um único contorno TRN agregado mostrado em marrom. A barra de escala representa 500 mícrons. Esta imagem mostra contornos agregados de TRN em preto e LGN em cinza com cinco neurônios TRN reconstruídos de cor quente a fria de acordo com sua posição lateral medial dentro do TRN.

A barra de escala representa 500 mícrons. Essas fotografias mostram os detalhes dos mesmos cinco neurônios TRN com barras de escala de cores correspondentes representando 100 mícrons. Esta árvore hierárquica de dendrograma ilustra as distâncias de ligação entre 160 neurônios TRN reconstruídos com base em 10 métricas morfológicas independentes e mostra os resultados gerais da análise de agrupamento.

Três grupos distintos de neurônios TRN são ilustrados em azul, verde e vermelho. Uma vez que essas técnicas de reconstrução neuronal são dominadas, um único neurônio pode ser completamente reconstruído em uma a duas horas. É importante monitorar e ajustar constantemente a profundidade z durante a reconstrução dos neurônios.

O protocolo descrito aqui é uma melhoria em relação aos métodos tradicionais de análise neuroanatômica mais tendenciosos e permite que os pesquisadores explorem novas subclasses de neurônios com base em dados morfológicos em larga escala. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como reconstruir neurônios por meio de seções de tecido adjacentes e extrair dados morfológicos para análise posterior.