Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações
15 de fevereiro de 2017
Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de populações neuronais selectivos, marcados após a infecção retrógrada com um vírus da raiva modificado expressando marcadores fluorescentes, e análises independentes cluster, imparcial que permitem a caracterização abrangente de métricas morfológicas entre subclasses neuronais distintas.
Os objetivos deste protocolo são descrever os passos para reconstruir a morfologia de neurônios marcados com vírus e realizar análises independentes e imparciais de agrupamento em populações de neurônios marcados, permitindo a caracterização abrangente de métricas morfológicas ao longo de subclasses neuronais distintas. Descrevemos uma abordagem inovadora para coletar e analisar dados neuroanatômicos, facilitando uma amostragem mais abrangente e uma classificação imparcial de tipos neuronais morfologicamente únicos dentro de uma população neuronal específica. A principal vantagem desta técnica é que ela permite análise em larga escala da morfologia neuronal e utiliza métodos imparciais para classificar subclasses neuronais distintas.
Os aspectos mais desafiadores das reconstruções morfológicas são a seleção de neurônios bem isolados para reconstrução, a atribuição da profundidade z correta e o alinhamento dos arbórios para continuar as reconstruções em seções adjacentes de tecido. Inicie uma reconstrução selecionando uma lâmina contendo uma seção de tecido cerebral corada de 50 mícrons de um primata injetado estereotaxicamente com vírus da raiva modificado que expressa EGFP. Coloque a lâmina no porta-lâminas do microscópio e foque em uma única seção de interesse usando uma objetiva de baixa ampliação.
Certifique-se de que a imagem da câmera esteja visível na imagem ao vivo posicionando corretamente o obturador da câmera. Escolha um neurônio marcado razoavelmente isolado dentro da estrutura cerebral de interesse para permitir a reconstrução inequívoca da arborização dendrítica. Alterne para ampliação de 10x e coloque a área em foco.
Escolha preferencialmente neurônios se o corpo celular estiver totalmente contido em uma única seção, para estimar com precisão sua área e circularidade. Após selecionar um neurônio bem corado e bem isolado, clique no botão de nova seção no software para adicionar a seção principal contendo o corpo celular ao gerenciador de seções. Insira o número de seções a serem incluídas na reconstrução.
Recomenda-se inserir duas a três seções para começar. Atribua uma espessura de seção de 50 micrômetros. Escolha a objetiva de dois x e clique no botão contorno na barra de ferramentas superior e selecione o tipo de contorno no menu suspenso.
Trace o contorno da estrutura-alvo usando o mouse para clicar em pontos ao longo do contorno. Ao terminar de rastrear o contorno, clique com o botão direito do mouse e selecione fechar contorno no menu para fechar o contorno. Em seguida, mantendo a visualização ainda em dois x, clique no símbolo do marcador desejado na barra de ferramentas à esquerda.
Em seguida, clique no centro da estrutura-alvo para posicionar o marcador. Após os contornos estarem completos, selecione a objetiva de 40x ou 60x para rastrear o contorno do corpo celular. Em seguida, selecione o botão de rastreamento de neurônio na barra de ferramentas superior e escolha a estrutura do neurônio a ser rastreada, neste caso, o corpo celular, no menu suspenso.
Contorne o corpo celular clicando em pontos ao redor da maior extensão do corpo celular, ajustando a profundidade em z conforme necessário para colocar o corpo celular em foco. Em seguida, clique com o botão direito do mouse para finalizar o contorno do corpo celular. A seguir, coloque um marcador de estilo diferente no centro do contorno do corpo celular, garantindo que o marcador esteja aproximadamente no centro em profundidade em z.
É fundamental estabelecer a profundidade z correta na seção inicial, bem como em seções adjacentes, antes de iniciar cada rastreamento, para que os valores do eixo z sejam precisos. Para começar o rastreamento dos arbórios dendríticos, selecione dendrito no menu suspenso superior.
Em seguida, trace cada dendrito a partir do corpo celular. Quando um dendrito se ramificar, clique com o botão direito do mouse e selecione nó bifurcado ou nó trifurcado para colocar um nó neste ponto de ramificação. Certifique-se de ajustar a profundidade em z ao longo do traçado para capturar com precisão o ângulo e a direção do dendrito.
No final do dendrito nesta seção, clique com o botão direito do mouse e selecione "ending" (final) no menu suspenso. Quando todas as árvores dendríticas forem traçadas na seção principal, identifique os terminais dendríticos que provavelmente continuarão na seção adjacente. Em seguida, coloque esses terminais em foco na profundidade z apropriada na imagem do microscópio em 20x.
Inclua grandes formações próximas, como vasos sanguíneos ou padrões ou feixes de dendritos facilmente reconhecíveis na imagem do microscópio. Em seguida, tire uma foto da imagem em tempo real usando uma câmera digital segurada manualmente diante da tela do computador. Depois, troque a objetiva do microscópio para dois x e mova-se para a seção adjacente na lâmina.
Em seguida, alinhe os contornos da seção previamente traçada na visualização do software com os limites do NGL e do TRN na nova seção. Retorne ao aumento de 20x e alinhe utilizando pontos de referência. Depois, com a ajuda da foto das terminações dendríticas da seção previamente traçada, mova o traçado para alinhar os dendritos, utilizando primeiro a ferramenta de seta para selecionar a reconstrução.
Em seguida, clique com o botão direito e selecione mover no menu suspenso e mova o traçado conforme necessário. Para girar o traçado, clique com o botão direito e selecione girar no menu suspenso e gire o traçado conforme necessário. Alternativamente, selecione a ferramenta de correspondência no menu suspenso de ferramentas superior e escolha o número de pontos a serem correspondidos.
Em seguida, clique na extremidade na reconstrução e no ponto de continuação correspondente na imagem ao vivo para associar as extremidades dendríticas aos seus inícios. Uma vez que o rastreamento da seção anterior esteja alinhado com os dendritos na nova seção, adicione uma nova seção ao gerenciador de seções como antes. Alternativamente, selecione simplesmente a seção adjacente criada anteriormente e ajuste a profundidade em z da mesma maneira.
Certifique-se de que a nova seção correspondente está selecionada no gerenciador de seções, clicando na seção atual. Em seguida, após aumentar a ampliação para 40x ou 60x, selecione o dendrito usando a seta. Clique com o botão direito do mouse na extremidade do dendrito da seção anterior e selecione adicionar ao final no menu suspenso.
Uma mensagem perguntará se a continuação está em uma nova seção. Clique em sim. Em seguida, trace a continuação do dendrito usando o mouse como ferramenta de desenho.
Tire imagens dos terminais em preparação para o alinhamento com a próxima seção. Em seguida, adicione continuidades aos traçados dendríticos até que pelo menos três seções sejam traçadas para o neurônio ou até que os dendritos não possam mais ser seguidos ou encontrados. Usando um programa de extração associado ao sistema de reconstrução de neurônios, abra um arquivo de reconstrução concluído.
No menu suspenso editar, selecione selecionar todos os objetos. Selecione análise da estrutura do ramo na barra de ferramentas de análise superior e, em seguida, clique em cada guia e escolha as opções de análise desejadas em cada uma. Extraia todos os dados desejados clicando no botão OK na janela de análise e salve em formato de planilha clicando com o botão direito do mouse nas janelas de saída e selecionando exportar para Excel para análises posteriores.
Esta fotografia mostra uma única seção coronal através do LGN dorsal de um animal. A coloração para citocromo oxidase é utilizada para visualizar as camadas do LGN. E a coloração para GFP marca o local de injeção do vírus.
A seta indica regiões de neurônios densos, marcados por retrotransporte, do núcleo reticular talâmico. A orientação da seção segue a bússola dorsal-ventral-medial-lateral ilustrada. A barra de escala está ilustrada no canto inferior esquerdo.
Esta imagem mostra os contornos do NGL em vermelho e do TRN em marrom-avermelhado em todas as seções que contêm injeção do vírus, conforme indicado pelos contornos pretos. As estrelas amarelas indicam os centros dos locais de injeção. Esta imagem mostra a renderização 3D dos contornos e do local de injeção.
Este é um mapa das localizações dos neurônios TRN reconstruídos, codificados por cores de acordo com a atribuição de agrupamento dentro de um único contorno agregado de TRN mostrado em marrom. A barra de escala representa 500 micrômetros. Esta imagem mostra contornos agregados do TRN em preto e do LGN em cinza, com cinco neurônios TRN reconstruídos coloridos do quente ao frio de acordo com sua posição medial lateral dentro do TRN.
A barra de escala representa 500 mícrons. Estas fotografias mostram o detalhe dos mesmos cinco neurônios do núcleo reticular talâmico (TRN) com barras de escala coloridas correspondentes que representam 100 mícrons. Esta árvore dendrograma hierárquica ilustra as distâncias de ligação entre 160 neurônios do TRN reconstruídos com base em 10 métricas morfológicas independentes e mostra os resultados gerais da análise de agrupamento.
Três grupos distintos de neurônios TRN são ilustrados em azul, verde e vermelho. Uma vez dominadas essas técnicas de reconstrução neuronal, um único neurônio pode ser completamente reconstruído em uma a duas horas. É importante monitorar e ajustar constantemente a profundidade z durante a reconstrução dos neurônios.
O protocolo descrito aqui representa uma melhoria em relação aos métodos tradicionais de análise neuroanatômica, mais suscetíveis a vieses, e permite aos pesquisadores explorar novas subclasses de neurônios com base em dados morfológicos em larga escala. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como reconstruir neurônios por meio de seções adjacentes de tecido e extrair dados morfológicos para análises posteriores.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para reconstruir a morfologia de neurônios marcados por meio de infecção retrógrada com um vírus da raiva modificado. Ele enfatiza análises de agrupamento imparciais para caracterizar subclasses distintas de neurônios com base em métricas morfológicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neuroanatomia
- Biologia Celular
Contexto
- Compreender a morfologia neuronal é fundamental para classificar tipos neuronais.
- Métodos tradicionais podem introduzir viés na análise morfológica.
- O vírus da raiva modificado pode rotular eficazmente populações neuronais específicas.
- Análises de agrupamento imparciais aprimoram a caracterização de subclasses neuronais.
Objetivo do Estudo
- Reconstruir a morfologia de neurônios marcados com vírus.
- Realizar análises de agrupamento imparciais em populações de neurônios marcados.
- Facilitar a caracterização abrangente de subclasses neuronais distintas.
Métodos Utilizados
- Seleção de neurônios bem isolados para reconstrução.
- Atribuição da profundidade z adequada para representação precisa da morfologia.
- Alinhamento dos arbortos em seções adjacentes do tecido.
- Uso de um microscópio para focalizar seções de tecido cerebral coradas.
Resultados Principais
- Análise bem-sucedida em larga escala da morfologia neuronal.
- Identificação de tipos neuronais morfologicamente únicos.
- Classificação isenta de subclasses neuronais distintas.
- Compreensão aprimorada da coleta e análise de dados neuroanatômicos.
Conclusões
- O protocolo fornece uma estrutura robusta para a reconstrução da morfologia neuronal.
- Métodos imparciais melhoram a precisão da classificação de subclasses neuronais.
- Essa abordagem pode facilitar estudos neuroanatômicos futuros.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a classificação morfológica em larga escala e imparcial de populações neuronais, apoiando a validação de alvos na descoberta de fármacos em neurociência ao reduzir a ambiguidade mecanicista na identificação de subtipos neuronais. A abordagem aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao fornecer métricas quantitativas e reprodutíveis para mitigar riscos em hipóteses de alvos ligadas à função de circuitos neuronais. Posiciona o fenotipamento morfológico como uma ferramenta escalável em estágio de descoberta para priorizar alvos com forte continuidade translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da classificação imparcial de subclasses neuronais com base em métricas morfológicas.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos ao estabelecer critérios quantitativos para distinguir populações neuronais funcionalmente distintas.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no alvo ao associar a singularidade morfológica à possível resposta diferencial a fármacos em populações neuronais específicas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas neuronais validados para o desenvolvimento de ensaios subsequentes, definindo subclasses morfologicamente distintas para modelos celulares consistentes.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade de ensaios mediante a extração de dados morfológicos quantitativos adequados para plataformas de triagem de alto conteúdo.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em diferentes populações neuronais, estabelecendo um fluxo de trabalho transferível para reconstrução e agrupamento em larga escala.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças ao permitir a classificação de tipos neuronais em regiões cerebrais de primatas relacionadas a alvos de transtornos neuropsiquiátricos.
- Alinhamento Pré-clínico: Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer biomarcadores morfológicos que se correlacionam com o engajamento de vias específicas a subtipos neuronais.
- Redução de Risco Mecanística: Reduz o risco biológico em estágios tardios ao validar a seletividade do alvo por meio de perfilagem morfológica abrangente de populações neuronais fora do alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a fase inicial de teste de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos líderes, em que a classificação morfológica orienta o triagem de compostos em sistemas neuronais relevantes para a doença.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao permitir a identificação imparcial de subclasses neuronais que podem modular diferencialmente circuitos relevantes para doenças.
- Triagem: Melhora a prontidão dos ensaios ao fornecer saídas morfológicas quantitativas que garantem consistência em modelos neuronais utilizados para avaliação de compostos.
- Análises: Oferece análise estatística de agrupamento e métricas morfológicas que permitem a comparação de populações neuronais entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica por meio de perfis morfológicos em sistemas neuronais de primatas com relevância para alvos cerebrais humanos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade reutilizável de perfilagem neuroanatômica aplicável a múltiplas populações neuronais e regiões cerebrais para validação de alvos em toda a carteira.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da redução da ambiguidade mecanicista na classificação de subtipos neuronais.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade da geração de dados morfológicos entre laboratórios e estudos.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de avançar/não avançar ao permitir a eliminação precoce de riscos associados aos alvos com base na especificidade de subclasses neuronais, reduzindo o risco de falhas biológicas em estágios tardios.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de decisões de avanço por meio da classificação objetiva da morfologia de populações neuronais em modelos pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige especialização em traçado neuroanatômico, microscopia confocal e software de reconstrução 3D para captura precisa da morfologia neuronal.
- Depende de infraestrutura de microscopia capaz de realizar seções z e imagens fluorescentes de cortes espessos de tecido, juntamente com ferramentas computacionais para extração morfológica e análise de agrupamento.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de traçado e das definições de métricas morfológicas para garantir a reprodutibilidade entre diferentes locais e operadores.
- Requer considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes populações neuronais, regiões cerebrais ou espécies, devido a variações na morfologia e na eficiência de marcação.
- Limitações práticas incluem o caráter demorado do traçado manual e a dependência de marcação viral de alta qualidade e preservação adequada do tecido para reconstruções confiáveis.
