Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

O objetivo geral deste procedimento é inferir o tropismo viral em um paciente infectado pelo HIV, sequenciando a região V três do gene do envelope viral para iniciar o extrato H-I-V-R-N-A do plasma sanguíneo do paciente. Em seguida, amplifique a região V três do HIV GP um 20 usando RTPC aninhado. Em seguida, identifique a presença do produto usando eletroforese em gel, seguida de sequenciamento de base populacional dos três produtos amplificados V.

Por fim, analise as sequências usando software de chamada de base e infera o uso de co-receptores usando o algoritmo genoma para feno. Em última análise, esses resultados podem mostrar se a tropa viral de um paciente é R cinco ou não R cinco por meio do sequenciamento populacional da alça três do HIVV. Portanto, a principal vantagem dessa técnica é um ensaio de tropa em relação aos métodos existentes, como ensaios baseados em células fenotípicas, é que ela pode ser realizada em qualquer laboratório equipado com aparelhos de sequenciamento para reduzir o custo em menos tempo com menos material de partida.

Esta técnica é relevante para o tratamento com terapia antirretroviral porque pode identificar se a população viral de um paciente tem probabilidade de responder a um antagonista CCR cinco A partir de 500 microlitros de plasma. Use um extrator automatizado mag fácil para extrair H-I-V-R-N-A. Agora vá para uma sala limpa de PCR para configurar o RTPCR para garantir a amostragem adequada da população viral.

Planeje realizar cada reação de transcrição reversa em triplicado nesta reação de uma etapa. Use o RNA viral para sintetizar CDNA, amplificando especificamente a região três do HIVV com o reparo principal SQV três F1 e CO 6 0 2. Com base em componentes por reação.

Faça uma solução de mistura de estoque suficiente para o número de amostras a serem amplificadas usando uma pipeta repetidora Adicione 36 microlitros de mistura de amostra a cada poço da placa de PCR. Agora mude para uma pipeta multicanal para transformar microlitros de extrato de amostra de RNA em cada um dos poços designados. Tome cuidado para trocar as pontas entre cada adição.

Quando a transferência estiver concluída, cubra os poços com tampas de tiras de PCR. Em seguida, coloque a placa de PCR em um termociclador programado para uma etapa RTPC da região do HIVV três. Para a PCR aninhada, use o reparo de primer SQV três F dois e CD quatro R.

Calcule a quantidade de reagente necessária para o número de amostras a serem amplificadas em uma sala limpa de PCR. Gere a mistura de PCR aninhada e, em seguida, use uma pipeta repetidora para alíquota de 19 microlitros por poço de uma placa de PCR limpa. Após a conclusão do R-T-P-C-R, vá para uma sala de pós-amplificação.

Use uma pipeta multicanal de oito canais para transferir um microlitro do modelo RTPC para a mistura de PCR aninhada. Mude as dicas entre cada adição. Cubra os poços com tampas de tiras de PCR e transfira a placa para um termociclador para amplificação.

Remova a placa do termociclador depois que a temperatura retornar a 25 graus Celsius. Para confirmar que a região V três foi amplificada com sucesso, primeiro analise os produtos por eletroforese em gel. Prepare um gel 1.6% AROS com corante de gel seguro para cibersegurança.

Usando uma pipeta multicanal de 10 microlitros. Transfira oito amostras de PCR de microlitros para os respectivos poços. Carregue também uma escada de DNA para pelo menos um poço por linha.

Execute o gel em cerca de 100 volts por 10 minutos. Visualize bandas por fluorescência ultravioleta e documente a imagem por fotografia. Anote as amostras em que todas as amplificações triplicadas foram bem-sucedidas.

Se necessário, repita R-T-P-C-R para as amostras com menos de três amplificações do produto. As amostras de CDNA viral amplificadas são posteriormente verificadas por reações de sequenciamento de DNA que serão realizadas usando os primers V 3 0 2 F e S QV três R one. Retire o grande direagente do congelador e descongele à temperatura ambiente.

Calcular e preparar os reagentes necessários para o número de amostras a serem executadas. Alíquota de cinco microlitros de mistura de reacção de sequenciação nos poços de placas apropriados utilizando uma pipeta multicanal. Cubra o prato com um lenço umedecido e reserve.

Enquanto isso, prepare uma diluição de um a 15 do produto de PCR amplificado adicionando 180 microlitros de água estéril ao produto de PCR restante. Pipetar um microlitro da amostra diluída para o fundo da placa adequada. Os poços sempre mudam as pontas entre as amostras quando a transferência da amostra é concluída.

Sele a placa com tampas de tira e vórtice por um segundo. Para centrifugar a placa, defina a velocidade para 140 5G. Quando a velocidade de centrifugação atingir 140 5G, pare a rotação.

Coloque a placa em um termociclador para que a reação prossiga. Em cada poço precipitar o DNA com quatro microlitros de acetato de sódio de três molares e 40 microlitros de etanol 95% resfriado, selar novamente as tampas. Córtex a placa por 10 segundos e bata na placa para desalojar quaisquer bolhas de ar.

Coloque as placas a menos 20 graus Celsius por entre 30 minutos e duas horas. Recuperar o ADN por centrifugação a 2000 G durante 20 minutos. Remova e descarte as tampas das tiras.

Inverter a placa sobre o recipiente de resíduos e transvasar o super natin. Livre-se de qualquer super natin restante. Secando as placas invertidas em uma toalha de papel.

Dobre duas folhas de papel toalha para colocar o prato em um sanduíche. Coloque a placa voltada para baixo na centrífuga e gire a 140 5G. Parando o giro quando atinge 140 5G.

Em seguida, lave com 155 microlitros de etanol a 95% e transvase. Em seguida, repita a centrifugação. Deixe a placa descansar por dois a cinco minutos para permitir que o etanol evapore.

Para desnaturar as amostras de DNA, use uma pipeta multicanal para distribuir 10 microlitros de corante alto para maide em todos os poços da placa, incluindo aqueles que estão vazios. Feche a placa com um septima e coloque em um termociclador a 90 graus Celsius por dois minutos. Finalmente, coloque a placa de amostra em uma placa de sequenciamento e no sequenciador.

Uma rota aceitável para a análise de dados é o uso do recall de software para realizar chamadas automáticas de base sem intervenção humana. O Recall é um software de chamada personalizado gratuito, faça login e selecione arquivos de amostra para carregar com a opção de navegação. Localize o arquivo de dados de sequenciamento bruto e carregue até 20 megabytes.

Em seguida, defina a sequência de referência para V três. Clique em processar dados. Selecione a pasta resultante no lado direito da página para mostrar a lista de exemplos.

Aqueles que são vermelhos falharam. Aqueles que são verdes já passaram. Ao clicar em uma amostra específica e no botão de exibição, você pode revisar a sequência, seguir as instruções no lado direito da página para navegar pela sequência, baixar arquivos em uma pasta zip.

O tropismo viral pode ser inferido a partir de sequências geradas por sequenciamento de base populacional usando o algoritmo geno para co-receptor feno. No menu suspenso da configuração significativa, selecione o otimizado com base na análise de dados clínicos de motivar 2% e 5,75% FPR. Agora escolha carregar ou colar uma sequência para análise.

Os arquivos FASTA são aceitáveis. Não adicione outro prossiga para obter um preditor geno Tono FPRA de capacidade de resposta aos antagonistas CCR cinco. O relatório G dois P gerado fornece a sequência V três loops em aminoácidos e indica posições relevantes de mutações associadas a vírus não R cinco.

Na parte inferior do relatório, a taxa de falsos positivos é dada e interpretada em termos de resposta a um antagonista CCR cinco. Este relatório pode ser baixado como um arquivo PDF. Se qualquer uma das três sequências de uma amostra for inferida como não R cinco, é improvável que o paciente responda a um antagonista CCR cinco como esperado eletroforese em gel de RTP CR Amplificações do HIV um V três loop indica que nem todas as amostras clínicas produzem um produto.

As sequências geradas a partir das amostras amplificadas podem ser visualizadas em um cromatograma lido por recordação. Espera-se uma sequência limpa com poucas misturas. Ocasionalmente, as sequências podem ser confusas e não passíveis de atribuição de base precisa.

Alguns pacientes podem ser identificados como tendo vírus não CCR cinco, conforme mostrado aqui. Esses pacientes provavelmente não responderão ao tratamento com um antagonista do CCR cinco. No entanto, a maioria dos pacientes tem uma população viral composta por CCR cinco usando vírus, conforme indicado por uma caixa verde na parte inferior do relatório de análise G dois P.

Então, uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em cerca de quatro dias do começo ao fim. Isso é da extração à análise. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como prever o tropismo viral usando métodos de sequenciamento de base populacional em conjunto com o algoritmo de bioinformática fenol do genoma.

Tudo bem, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.