Determinação de estruturas moleculares de glicoproteínas do envelope HIV usando Cryo-Electron Tomografia e Média Sub-tomogram Automated

Mais de 60 milhões de pessoas foram infectadas com o HIV, o vírus que causa a AIDS. HIV AIDS é uma crise de saúde global e, embora esforços intensivos de pesquisa tenham emprestado dramaticamente a vida de indivíduos infectados, uma verdadeira vacina permanece indescritível. Um dos principais focos da pesquisa da vacina contra o HIV é a glicoproteína do envelope, que o HIV usa para entrar nas células-alvo.

Neste vídeo, demonstramos como obtemos estruturas dessa importante proteína usando uma técnica de imagem chamada tomografia crioeletrônica. Começando com o HIV purificado, mostramos as etapas na preparação de amostras congeladas, as etapas no registro de imagens microscópicas eletrônicas dessas amostras congeladas e as etapas na conversão dessas imagens em modelos estruturais que podem ser úteis para o projeto da vacina contra o HIV AIDS. Um aspecto único do que apresentamos neste vídeo é que o trabalho será demonstrado por membros de seu laboratório, abrangendo uma ampla gama de idades, desde alunos do ensino fundamental e médio até estudantes de nível universitário e de pós-graduação, até pós-doutorandos e cientistas seniores.

A preparação de amostras de vírus vitrificados adequadas para tomografia crioeletrônica é realizada espalhando uma suspensão aquosa de vírus através de pequenos orifícios em um filme de carbono suportado por uma grade de cobre e, em seguida, congelando rapidamente os vírus. O objetivo desta etapa é preparar uma amostra congelada de vírus intactos capturados em um estado quase nativo. Para começar, as grades são colocadas dentro de uma unidade de descarga incandescente.

Este dispositivo limpa as grades expondo-as ao gás ionizado. Agora que as grades estão prontas para uso, uma suspensão de vírus misturados com pequenas partículas de ouro é preparada. Essas partículas são essenciais para a coleta e processamento de dados.

Em seguida, uma gota de suspensão de vírus é colocada na grade recém-limpa de plasma. A grade é então carregada em um robô, que a enxuga com papel de filtro, reduzindo a gota a uma fina película de líquido. A amostra é então mergulhada em etano líquido, que congela rapidamente os vírus a uma taxa superior a 100.000 kelvin por segundo.

A grade congelada de imersão é então transferida para uma caixa de armazenamento para transporte para o microscópio. Isso é repetido até que o número desejado de grades seja congelado. Agora que as grades de amostra de vírus estão prontas, o próximo passo é carregá-las no microscópio.

Para imagens, isso pode ser feito manualmente ou com assistência robótica. Quando as grades de amostra são carregadas manualmente, o usuário se senta em uma estação especializada onde as amostras podem ser manipuladas sob nitrogênio líquido, as amostras são colocadas em uma câmara portátil resfriada a nitrogênio que é selada, evacuada e depois conectada ao microscópio. Os microscópios mais novos são capazes de carregar amostras mais automatizadas.

Aqui, em um microscópio Titan Cryos, as amostras congeladas são entregues ao microscópio pelo usuário e, em seguida, carregadas roboticamente com as grades de amostra carregadas no microscópio. Cada grade pode ser examinada pelo usuário antes que a imagem possa começar. Os parâmetros do microscópio são configurados para cada área na grade de amostra que possui características de interesse.

Nesse caso, as características são vírus HIV. À medida que cada nova área é definida, o computador do microscópio armazena os parâmetros de imagem específicos da área. Quando o usuário tiver definido todas as posições de interesse, o computador revisita cada posição automaticamente e coleta um conjunto de dados.

Cada conjunto de dados é coletado inclinando a grade de amostra em relação ao feixe de elétrons, garantindo que o feixe permaneça focado no mesmo ponto da grade. A coleta de dados em microscopia eletrônica tradicionalmente exige que os usuários se sentem ao microscópio e interajam fisicamente com o equipamento. Esse estilo de interação do microscópio é mostrado aqui durante uma visita do presidente Obama a uma fábrica de inteligência.

Avanços recentes nas interfaces de computador do microscópio agora permitem que os usuários monitorem e ajustem a coleta de dados em tempo real a partir de um computador remoto no laboratório ou em outro lugar. Para visualizar as formas do envelope, a glicoproteína aumenta a média das informações de centenas de imagens individuais para aumentar o sinal. Este é um processo computacionalmente intensivo, que é realizado aqui usando um cluster de computadores chamado Bio Wolf.

Localizado no NIH, métodos poderosos foram desenvolvidos para extrair volumes individuais e calcular a média das informações usando algoritmos que podem funcionar em altos níveis de ruído. Intrínsecos a esse tipo de dados, os mapas de densidade obtidos de vírus nativos e vírus complexos a moléculas biologicamente importantes fornecem um rico banco de dados de informações sobre a biologia estrutural do HIV. Os mapas de densidade ganham vida em detalhes moleculares quando os dados são combinados com informações da cristalografia de raios-x das subunidades individuais que compõem o pico de glicoproteína do envelope.

Os dados que saem desses tomos podem ser muito densos e desafiadores para interpret. 3D software para a indústria do entretenimento pode ser usado para visualizar os modelos 3D adicionando cores, texturas e iluminação, tornando-os mais fáceis de analisar. O software de visualização comumente usado inclui um Mirror 3D Studio Max e Maya.

Acabamos de demonstrar procedimentos passo a passo de como se pode obter modelos moleculares para a estrutura do envelope. Glicoproteína, a partir do HIV purificado. Usando esse método, também determinamos estruturas para a glicoproteína do envelope em complexo com uma variedade de moléculas que podem se ligar e utilizar o vírus.

Aqui mostramos um exemplo para a estrutura da glicoproteína do envelope em complexo com um anticorpo chamado B12. Entender por que algumas moléculas podem se ligar e utilizar o vírus, enquanto outras não, é muito importante para o projeto racional da vacina. Determinar as estruturas moleculares das glicoproteínas do envelope do HIV ou de outros vírus, como influenza e Ebola, é fundamental para entender a entrada e utilização viral.

Como você viu, a tomografia crioeletrônica está surgindo agora como uma ferramenta poderosa para atingir esse objetivo.