Relação custo-benefício Método de Rastreamento Fonte microbiana, utilizando específicas Vírus Humano e Animal

Método econômico para rastreamento de fontes microbianas usando vírus humanos e animais específicos. O estudo descreve um método econômico para a identificação da fonte de contaminação por urina fecal ou contaminação por nitratos na água usando PCR quantitativo para a quantificação específica de vírus suínos humanos, bovinos, vírus de DNA, adenovírus e poliomavírus propostos como ferramentas de rastreamento de fonte microbiana. Desenvolvemos um protocolo para a concentração de vírus a partir de amostras de água de 10 litros por floculação orgânica usando leite desnatado, extração de ácidos nucléicos virais do sedimento e quantificação de vírus DNI humano bovino ou suíno usando PCR quantitativo.

É bem sabido que a contaminação microbiana da vitamina representa um risco significativo para a saúde e precisamos conhecer as fontes da contaminação. Propusemos o uso de vírus de DNA altamente prevalentes como ferramentas de rastreamento de fontes microbianas. Os vírus selecionados são adenovírus e poliomavírus.

Esses vírus estão sendo excretados persistentemente durante todo o ano e em todas as áreas geográficas. Estudado em estudos anteriores. Desenvolvemos métodos robustos de concentração de baixo custo para vírus na água e temos trabalhado no desenvolvimento de ensaios de QPCR para a quantificação de adenovírus de purina e poliomavírus bovinos.

Além disso, utilizamos adenovírus humanos, NGC Polyomavirus, testados pelo QPCR, também como marcadores de contaminação humana em água, coleta de amostras de água. Neste estudo, quatro repetições de 10 litros por amostra de água são coletadas em recipientes plásticos com fundo plano e uma amostra extra como controle de processo. Esta última amostra será semeada com uma quantidade conhecida de partículas virais usadas como controle.

Um controle negativo é preparado em laboratório usando água da torneira em um recipiente plástico extra de 10 litros. Se a amostra apresentar grande quantidade de material em suspensão, areia e outros materiais, deixe sedimentar por 15 minutos, transfira a água para um novo recipiente. Concentração viral por floculação orgânica.

A detecção de vírus em amostras de água baixa ou moderadamente poluída requer a concentração dos vírus de pelo menos vários litros de água em um volume muito menor. O procedimento de concentração inclui acidificação de amostras de água de 10 litros, floculação usando gravidade de leite desnatado, sedimentação dos lotes e coleta do precipitado em 10 mililitros de tampão fosfato para iniciar o processo, uma solução de localização de leite desnatado em água do mar artificial é preparada dissolvendo 10 gramas de leite em pó desnatado em um litro de água do mar artificial e ajustando cuidadosamente o pH para 3,5. Com ácido clorídrico, o rebanho deve ser visível.

Prepare a solução imediatamente antes de ser usada ou armazene a quatro graus Celsius por 24 horas. As amostras de água são agitadas e a condutividade nas amostras é medida. Se estiver abaixo de 1,5 milisiemens, sais marinhos serão adicionados.

Ajuste o pH da amostra de água para 3,5 pela adição de ácido clorídrico. Registre o pH das amostras antes e depois do condicionamento, bem como o volume de ácido clorídrico utilizado. A condutividade também deve ser registrada.

Depois de ajustar o pH, adicionamos 100 mililitros de leite desnatado preflod, 1% à amostra de água de 10 litros e agitamos as amostras por oito a 10 horas para permitir que os vírus sejam absorvidos pelos lotes. Para a amostra de pico usada como controle de processo, adicione o volume padrão do vírus de controle, um mililitro, por exemplo, à amostra. Pare de mexer e deixe o rebanho sedimentar por gravidade por oito a 10 horas.

Após 16 horas, geralmente no dia seguinte, poderemos coletar os sedimentos. Para isso, remova o sobrenadante usando uma bomba peristáltica. Colete o sedimento com os lotes, aproximadamente 500 mililitros em uma garrafa de centrífuga.

Equilibre os potes com a adição de leite desnatado com pH 3,5, centrifugue os potes com centrífuga de alta velocidade, 8.000 Gs 30 minutos a quatro graus Celsius. Assim que a centrífuga parar, remova os potes da centrífuga com cuidado da centrífuga. Despeje e descarte o sobrenadante com muito cuidado.

Dissolver o pellet em cada frasco de centrifugação até obter um volume final de 10 mililitros de fosfato, extração de ácido nucleico e quantificação de vírus. O concentrado viral é utilizado para a extração de ácidos nucléicos virais e os vírus específicos de adenovírus e polioma de interesse serão quantificados por A-Q-P-C-R. Realize uma extração de ácido nucleico com o mini kit de RNA viral da chave amp

A lise dos vírus presentes em 140. Microlitros de concentrados virais são realizados manualmente e os ácidos nucléicos totais são extraídos para 80 microlitros. Este kit permite o uso de uma plataforma automatizada, como o Key cube.

O próximo passo é a quantificação do genoma viral. As cópias nas amostras por meio de uma PCR quantitativa com sondas tac man, adenovírus humanos, vírus do polioma JC e vírus do polioma bovino podem ser quantificadas na mesma placa de 96 poços. Uma vez que todos utilizam os mesmos ciclos de amplificação, os adenovírus suínos devem ser testados separadamente numa placa independente para a quantificação do vírus-alvo.

Prepare a mistura de PCR quantitativa em uma área limpa e separada. Uma vez preparada a mistura, aloque 15 microlitros em cada poço, incluindo os controles. Adicione as extrações de ácido nucleico das amostras de 10 microlitros em uma área separada, execute direto e uma diluição de dez vezes em água purificada de cada amostra em duplicata, o volume total para uma reação após a adição do alvo será de 25 microlitros, 15 de mistura mais 10 de amostra ou cobertura padrão os poços contendo as amostras com parte de uma capa adesiva.

Guarde a outra parte da tampa para a etapa seguinte. AB diluição das suspensões-padrão de ADN. 10 microlitros de 10 a zero a 10 a seis cópias do genoma, simulando microlitros por triplicado e usando um micro pbit usado exclusivamente para a cobertura padrão de DNA.

Os poços contendo os padrões com a capa adesiva previamente cortada. Esta figura mostra a distribuição das amostras e controles de suspensão padrão. Na placa de 96 poços.

Execute o QPCR em um sistema adequado, selecionando os parâmetros apropriados após a ativação da amplitude ouro por 10 minutos. A 95 graus Celsius, 40 ciclos de amplificação são realizados assim que as reações são concluídas. Armazene dados e resultados conforme descrito no manual do usuário do equipamento utilizado.

A quantidade de ADN será definida como a mediana dos dados obtidos após a correcção do factor de diluição, quando necessário. O gráfico de amplificação e a curva padrão obtidos para a quantificação de adenovírus suínos apresentaram um coeficiente de correlação de 0,999. Os valores de inclinação aceitáveis variam de menos 3,1 e menos 3,6 após o procedimento.

Vírus humanos e animais descritos foram testados em amostras de águas subterrâneas de uma área com altos níveis de nitratos para definir as fontes de contaminação. As quatro repetições analisadas apresentaram resultados positivos para o valor médio de adenovírus suínos, 7,74 por 10 a duas cópias do genoma por litro, o que estaria relacionado à presença de dejetos suínos na área ao redor do local de amostragem, e comprovaria a presença de contaminação porcina fecal nas águas subterrâneas. Nenhuma contaminação humana estava presente em nenhuma das amostras testadas.

Os dados virológicos foram confirmados por nested PCR e análise de sequenciamento. Conclusão. Neste estudo, apresentamos resultados analisando amostras de água subterrânea, apresentando contaminação de origem suína na ausência de contaminação humana ou bovina. O procedimento também foi aplicado à análise de águas balneares, água do mar e água do rio.

Apresentamos aqui o procedimento de aplicação dessas ferramentas para a identificação da fonte de contaminação em águas subterrâneas, apresentando altos níveis de nitrato como exemplo da aplicabilidade dos métodos desenvolvidos para detectar a fonte de contaminação no ambiente.