Relação custo-benefício Método de Rastreamento Fonte microbiana, utilizando específicas Vírus Humano e Animal

Método econômico para rastreamento da origem microbiana utilizando vírus humanos e animais específicos. O estudo descreve um método econômico para a identificação da fonte de contaminação fecal, urina ou por nitratos na água, utilizando PCR quantitativa para a quantificação específica de vírus de origem humana, suína, bovina, vírus de DNA, adenovírus e poliomavírus propostos como ferramentas de rastreamento da origem microbiana. Desenvolvemos um protocolo para a concentração de vírus a partir de amostras de água de 10 litros por floculação orgânica, extração do ácido nucleico viral do sedimento utilizando leite desnatado e quantificação de vírus de DNA humanos, bovinos ou suínos utilizando PCR quantitativa.

Sabe-se bem que a contaminação microbiana da vitamina representa um risco significativo à saúde e precisamos conhecer as fontes dessa contaminação. Propomos o uso de vírus de DNA altamente prevalentes como ferramentas de rastreamento da origem microbiana. Os vírus selecionados são adenovírus e poliomavírus.

Esses vírus estão sendo excretados persistentemente durante todo o ano e em todas as áreas geográficas. Estudados em pesquisas anteriores. Desenvolvemos métodos robustos e de baixo custo para concentração de vírus em água, e temos trabalhado no desenvolvimento de ensaios de QPCR para a quantificação de adenovírus entéricos e poliomavírus bovinos.

Além disso, utilizamos adenovírus humanos e poliomavírus NGC, testados por QPCR, também como marcadores de contaminação humana em água, coleta de amostras de água. Neste estudo, quatro réplicas de 10 litros por amostra de água são coletadas em recipientes plásticos com fundo plano e uma amostra adicional como controle do processo. Esta última amostra será inoculada com uma quantidade conhecida das partículas virais utilizadas como controle.

Um controle negativo é preparado no laboratório utilizando água da torneira em um recipiente plástico adicional de 10 litros. Se a amostra apresentar grande quantidade de material em suspensão, areia e outros materiais, deixe sedimentar por 15 minutos e transfira a água para um novo recipiente. Concentração viral por floculação orgânica.

A detecção de vírus em amostras de água com baixa ou moderada poluição exige a concentração dos vírus a partir de pelo menos vários litros de água em um volume muito menor. O procedimento de concentração inclui a acidificação de amostras de água de 10 litros, floculação utilizando leite desnatado, sedimentação dos flocos por gravidade e coleta do precipitado em 10 mililitros de tampão fosfato para iniciar o processo. Uma solução de leite desnatado em água do mar artificial é preparada dissolvendo 10 gramas de pó de leite desnatado em um litro de água do mar artificial e ajustando cuidadosamente o pH para 3,5 com ácido clorídrico. Os flocos devem ser visíveis.

Prepare a solução logo antes de usá-la ou armazene-a a quatro graus Celsius por 24 horas. As amostras de água são agitadas e a condutividade nas amostras é medida. Se for inferior a 1,5 milisiemens, serão adicionados sais marinhos.

Ajuste o pH da amostra de água para 3,5 pela adição de ácido clorídrico. Registre o pH das amostras antes e depois do condicionamento, bem como o volume de ácido clorídrico utilizado. A condutividade também deve ser registrada.

Após ajustar o pH, adicionamos 100 mililitros de leite desnatado padronizado a 1% à amostra de água de 10 litros e agitamos as amostras por oito a 10 horas para permitir que os vírus se adsorvam aos flocos. Para a amostra de adição usada como controle do processo, adicione o volume padrão do vírus controle, um mililitro, por exemplo, à amostra. Interrompa a agitação e deixe os flocos sedimentarem por gravidade por oito a 10 horas.

Após 16 horas, geralmente no dia seguinte, poderemos coletar os sedimentos. Para isso, remova o sobrenadante utilizando uma bomba peristáltica. Colete o sedimento com os flocos, aproximadamente 500 mililitros, em um frasco de centrífuga.

Equilibre os potes pela adição de leite desnatado tamponado pH 3,5, centrifugue os potes em centrífuga de alta velocidade, 8.000 ×g durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Assim que a centrífuga parar, remova cuidadosamente os potes da centrífuga. Despeje e descarte com muito cuidado o sobrenadante.

Reconstitua o precipitado em cada frasco de centrífuga até um volume final de 10 mililitros de fosfato, extração de ácidos nucleicos e quantificação de vírus. O concentrado viral é utilizado para a extração de ácidos nucleicos virais e os adenovírus e poliomavírus específicos de interesse serão quantificados por A-Q-P-C-R. Realize uma extração de ácido nucleico com o kit mini RNA viral KeyAmp.

A lise dos vírus presentes em 140 microlitros de concentrados virais é realizada manualmente, e os ácidos nucleicos totais são extraídos em 80 microlitros. Este kit permite o uso de uma plataforma automatizada, como o Key cube.

O próximo passo é a quantificação do genoma viral. Cópias nas amostras podem ser quantificadas por meio de PCR quantitativa com sondas TaqMan, utilizando o mesmo placa de 96 poços para adenovírus humanos, vírus JC polyomavírus e vírus polyomavírus bovino. Como todos utilizam os mesmos ciclos de amplificação, adenovírus suínos devem ser testados separadamente em uma placa independente para a quantificação do vírus alvo.

Prepare a mistura para PCR quantitativa em uma área separada e limpa. Após o preparo da mistura, distribua 15 microlitros em cada poço, incluindo os controles. Adicione as extrações de ácidos nucleicos das amostras — 10 microlitros em uma área separada — diretamente e uma diluição dez vezes em água purificada de cada amostra em duplicata; o volume total para uma reação após a adição do alvo será de 25 microlitros, sendo 15 da mistura mais 10 da amostra ou padrão. Cubra os poços contendo as amostras com parte de uma tampa adesiva.

Guarde a outra parte da tampa para o próximo passo. Diluição AB das suspensões padrão de DNA. Adicione 10 microlitros de 10 elevado a zero até 10 elevado a seis cópias genômicas, em microlitros simulados por triplicata, utilizando um micropipetador exclusivo para a tampa de DNA padrão.

Os poços contendo os padrões com a tampa adesiva previamente cortada. Esta figura mostra a distribuição das amostras de suspensão de padrões e controles. Na placa de 96 poços.

Realize a QPCR em um sistema adequado, selecionando os parâmetros apropriados após a ativação do amplitude gold por 10 minutos. A 95 graus Celsius, são realizados 40 ciclos de amplificação assim que as reações forem concluídas. Armazene os dados e resultados conforme descrito no manual do usuário do equipamento utilizado.

A quantidade de DNA será definida como a mediana dos dados obtidos após a correção do fator de diluição, quando necessário. O gráfico de amplificação e a curva padrão obtidos para a quantificação de adenovírus suínos apresentaram um coeficiente de correlação de 0,999. Os valores aceitáveis de inclinação variam de menos 3,1 a menos 3,6 seguindo o procedimento.

Vírus humanos e animais descritos foram testados em amostras de água subterrânea de uma área com altos níveis de nitratos para definir as fontes de contaminação. As quatro réplicas analisadas apresentaram resultados positivos para adenovírus suínos, valor médio de 7,74 de 10 a duas cópias genômicas por litro, o que estaria relacionado à presença de chorume suíno na área ao redor do local de coleta, e comprovaria a presença de contaminação fecal suína na água subterrânea. Nenhuma contaminação humana foi detectada em nenhuma das amostras testadas.

Os dados virológicos foram confirmados por PCR aninhada e análise de sequenciamento. Conclusão. Neste estudo, apresentamos resultados da análise de amostras de águas subterrâneas, demonstrando contaminação de origem suína na ausência de contaminação humana ou bovina. O procedimento também foi aplicado à análise de águas de banho, água do mar e água de rio.

Apresentamos aqui o procedimento para aplicar essas ferramentas na identificação da fonte de contaminação em águas subterrâneas, utilizando altos níveis de nitrato como exemplo da aplicabilidade dos métodos desenvolvidos para detectar a fonte de contaminação no meio ambiente.