Name: Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Aprenda a usar o ensaio de microarray pan-viral Virochip para detectar patógenos virais em amostras clínicas. Este método amplifica e hibridiza ácidos nucleicos para identificar vírus conhecidos e novos.

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Agradecemos a David Wang, Anatoly Urisman, Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, e Alexander Greninger para o desenvolvimento inicial e otimização do protocolo Virochip. Este trabalho é apoiado por uma K08 NIH conceder e Prêmio Abbott Discovery (para CC) e do Howard Hughes Medical Institute (para JLD).

As etapas do ensaio Virochip incluem (1) a extração de ácidos nucléicos a partir de amostras clínicas, (2) transcrição reversa do RNA extraído e 2 ª vertente de síntese-cDNA, (3) amplificação por PCR de cDNA preparado de forma aleatória, (3) Cy3 incorporação corante fluorescente (4), a hibridização de material marcado para o microarray Virochip, e (5) de varredura e análise (Figura 1). O protocolo mostrado abaixo irão demonstrar o uso do ensaio Virochip em uma amostra swab nasal de uma criança com uma doença semelhante à gripe. Seqüências Primer Primer A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA (N 9) -3 ' Primer B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 ' 1. Extração de ácido nucléico <ol><li> Extração de ácidos nucléicos de amostras clínicas devem ser realizadas sob o Nível de Biossegurança 2 (NB-2) ou em condições mais elevadas, uma vez que estas amostras são potencialmente infecciosos. </li><li> O swab nasal amostra é transportada em meio de holding viral. Alíquota de 200 mL da amostra em tubo de microcentrífuga de 1,5 mL Eppendorf. </li><li> Opcional: pass amostra através de um filtro mM 0,22 (purificar para partículas virais) </li><li> Opcional: amostra pré-tratamento com DNAse (a degradar DNA genômico de host e purificar para protegidas, o ácido nucléico viral encapsidated), utilizando o kit Turbo DNAse (Ambion) por instruções do fabricante </li><li> Extrair a amostra usando o Zymo ZR Viral RNA Extraction Kit ou Kit Qiagen Virus UltraSens acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 2. Transcrição reversa e 2 ª vertente de síntese-CDNA ("Round A") <ol><li> Adicione 1 uL Primer 40 pmol / mL A a 4 uL extraído RNA. Calor a 65 ° C por 5 min em um termociclador (por exemplo, GeneAmp PCR System 9700) e, em seguida, deixe esfriar em temperatura ambiente x 5 min. </li><li> Adicionar 5 mL de uma mistura principal consiste em 2 mL tampão RT 5X, 1 mL 12,5 mM dNTP, 1 mL de água, 0,5 mL 0,1 M DTT, e 0,5 mL SSIII RT (Invitrogen). Incubar a 42 ° C x 60 minutos. </li><li> Em um termociclador programável, o calor a 94 ° C x 2 min (para abortar a reação da transcriptase reversa), arrefecer até 10 ° C, centrífuga, pulso e, em seguida, adicionar 5 mL Sequenase mix composto por um tampão 5X Sequenase mL, 3,8 mL de água, e 0,15 mL Sequenase (USB Corporation). Para 2 ª vertente de síntese, rampa acima de 10 ° C a 37 ° C por 8 min, segure 8 min, então o calor a 94 ° C min x 2 (para inativar Sequenase) e arrefecer a 10 ° C (espera). </li><li> Opcional: Rd Uma amostra de cDNA podem ser armazenados neste momento a -20 ° C. </li></ol> 3. Amplificação por PCR do CDNA aleatoriamente Primário ("Round B") <ol><li> Adicionar 5 uL de Rd Uma amostra de 45 mL de uma mistura principal composto de 5 mL tampão PCR 10X, 1 mL 12,5 mM dNTP, 1 mL 100 B cartilha pmol / mL, 1 mL KlenTaq LA (Sigma), e 37 mL de água. </li><li> Executar PCR protocolo da seguinte forma: 94 ° C, 2 min → (25 ciclos de 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( espera) </li><li> Verifique o Rd amostra B em um gel de eletroforese de agarose 1,5%. Uma mancha de cerca de 200 - 1000 bp deve ser visualizada (Figura 2A) </li></ol> 4. Cy3 Incorporação corante fluorescente <ol><li> Opcional: outra amostra podem ser rotulados com o corante fluorescente e Cy5 hibridizado ao microarray mesmo. </li><li> Para incorporar aa-dNTP, adicionar 5 uL de amostra Rd B a 45 uL de uma mistura principal, composto por 5 tampão PCR 10X uL, 1 uL 12,5 mM aa-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / uL cartilha B, 1, 1 uL KlenTaq LA (Sigma) e 37 uL de água. Executar PCR protocolo da seguinte forma: 94 ° C, 2 min → (15 ciclos de 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( espera) </li><li> Limpe o Rd amostra C com o DNA Limpo e Concentrador-5 Kit (Zymo Research) por instruções do fabricante. Eluir em 10 mL. </li><li> Adicione 1 uL de bicarbonato de 1M (Sigma) e 1 uL Cy5 (GE Healthcare) para a amostra C Rd. </li><li> Incubar x 1 hora no escuro. </li><li> Limpe a amostra Cy3 marcado com o DNA Limpo e Concentrador-5 Kit (Zymo Research) por instruções do fabricante. Eluir em 12 mL. </li></ol> 5. Hibridização para Virochip Microarray <ol><li> Opcional: usar 1,5 mL para verificar a concentração de cDNA e da quantidade de corante incorporado em um espectrofotômetro Nanodrop (para normalização das amostras) </li><li> Em um tubo de strip PCR adicionar 1 mL de buffer fragmentação 25X, 5 mL tampão 5X bloqueio, 9,5 mL (ou quantidade de normalizar) de Cy3 marcado amostra, e água a um volume total de 25 mL (Agilent) </li><li> Adicionar 25 mL de tampão de hibridização 2X GEX (Agilent). Girar rapidamente para remover as bolhas. </li><li> Carga 40 mL da amostra em slides junta. </li><li> Lugar Agilent-impressos série Virochip (Universidade de California, San Francisco / Agilent) (lado marcado "Agilent" para baixo) em cima do deslize junta e aperte o parafuso firmemente. </li><li> Hibridizar durante a noite em 65 ° C forno, ajuste de velocidade de 10 rpm. </li><li> Para lavar matrizes, pré-aqueça tampão 2 (Agilent) a 37 ° C. Desmonte subaquático junta corrediça / array sanduíche em tampão 1 (Agilent). Lavar em tampão 1 x 1 min. Lavar em tampão pré-aquecido 2 x 1 min. Remover lentamente deslize do buffer 2, tendo o cuidado de evitar bolhas (use kimwipe para espalhar a umidade extra tendo cuidado para evitar tocar directamente lado ativo da matriz) </li><li> Lugar de slides no suporte de slides e inserir em scanner matriz. </li></ol> 6. Virochip Digitalização e Análise <ol><li> Varredura Cy3 marcado matriz em 5 mm ou 2 mm de acordo com o protocolo do instrumento de rastreamento padrão (Figura 2B). </li><li> Analisar microarrays Virochip por inspeção visual, análise de cluster, ou o programa de análise automatizada Virochip, E-Predict 11. Por cada um desses três métodos, o vírus influenza é facilmente detectada na amostra swab nasal (de uma criança com doença semelhante à influenza) (Figura 2C) </li></ol> 7. Resultados representativos: Quando o protocolo é feito corretamente, uma mancha deve ser visto na eletroforese em gel de agarose após a etapa B Rd (Figura 2A). O microarray Virochip na plataforma Agilent será difícil analisar visualmente (Figura 2B), mas se um vírus estiver presente, deve ser facilmente identificado por inspeção visual, análise de cluster, e / ou E-Predict (Figura 1C). As amostras podem ser incrementadas com quantidades medidas de ácido nucléico de um vírus conhecido (por exemplo, vírus do mosaico do tabaco; MS2 bacteriófago) para servir como um controle positivo para o ensaio. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquemática do processamento de microarray Virochip e análise. Extraído de ácidos nucléicos a partir de amostras clínicas são amplificados aleatoriamente, marcados com corantes fluorescentes e hibridizada com o microarray Virochip. Microarrays são digitalizadas com resolução de 2 mm e analisados ​​utilizando uma variedade de ferramentas computacionais, incluindo E-Predict. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Passos no ensaio Virochip Após a amplificação por PCR aleatória, uma mancha de 200 -. 1000 bp pode ser visualizado por eletroforese em gel (A) (B) Três microarrays Virochip dos 8 matrizes / lâmina de vidro são mostradas, com uma pequena região. de um microarray blown-up na inserção no canto inferior direito. (C) Automated análise microarray viral usando E-Predict revelando a presença do vírus influenza A na amostra clínica. A pontuação alta similaridade (s = 0,55) corresponde a um p-valor que é próximo de zero, tornando esta uma previsão extremamente significativo.

<ol><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+detection+and+genotyping+of+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+a+critical+respiratory+illness+caused+by+human+metapneumovirus+by+use+of+a+pan-virus+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray.</a> J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+detection+of+human+parainfluenzavirus+4+infection+associated+with+respiratory+failure+in+an+immunocompetent+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult.</a> Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+DNA+microarrays+for+detection+of+viruses+in+acute+respiratory+tract+infections+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children.</a> J Pediatr. 153, 76-83 (2008).</li>
<li>Kistler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-viral+screening+of+respiratory+tract+infections+in+adults+with+and+without+asthma+reveals+unexpected+human+coronavirus+and+human+rhinovirus+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity.</a> J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).</li>
<li>Rota, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+coronavirus+associated+with+severe+acute+respiratory+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome.</a> Science. 300, 1394-1399 (2003).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+discovery+and+sequence+recovery+using+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays.</a> PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+Gammaretrovirus+in+prostate+tumors+of+patients+homozygous+for+R462Q+RNASEL+variant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant.</a> PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).</li>
<li>Kistler, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+divergent+avian+bornaviruses+from+cases+of+proventricular+dilatation+disease%3A+identification+of+a+candidate+etiologic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent.</a> Virol J. 5, e25-e25 (2008).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardioviruses+related+to+Theiler%27s+murine+encephalomyelitis+virus+in+human+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Predict%3A+a+computational+strategy+for+species+identification+based+on+observed+DNA+microarray+hybridization+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns.</a> Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo Virochip como descrito aqui é complexo e requer um técnico de pesquisa meticulosa e qualificados. Concentração de reagentes corretos e as condições de PCR, rotulagem, e hibridação são críticos. O protocolo Virochip pode ser facilmente modificado para acomodar a análise de tecidos doentes pelo uso de um método de extração de tecidos, tais como TRIzol (Invitrogen) para a extração de ácidos nucléicos. Sondas podem ser adicionados ou excluídos conforme necessário para obter o espectro desejado e amplitude de cobertura, por exemplo, sondas para detecção de alvos não-virais, tais como bactérias e fungos podem ser projetados e acrescentou &quot;on-the-fly&quot;. Algumas aplicações do ensaio Virochip atualmente em desenvolvimento incluem de amplo espectro de diagnóstico viral em laboratório clínico, investigação de surtos, a triagem pureza de medicamentos e vacinas, e da novela descoberta do patógeno viral.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / material </th><th> Nome do reagente / material </th></tr><tr><td> Primera </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA (N9) -3 &#39; </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-3 &#39; </td></tr><tr><td rowspan="5"> RT Master Mix (5 mL) </td><td> 2 mL tampão 5X RT </td></tr><tr><td> 1 mL 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 mL de água </td></tr><tr><td> 0,5 mL 0,1 M DTT </td></tr><tr><td> 0,5 mL SSIII RT (Invitrogen) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sequenase Mix (5 mL) </td><td> Um buffer de Sequenase mL 5X </td></tr><tr><td> 3,8 mL de água </td></tr><tr><td> 0,15 mL Sequenase (USB Corporation) </td></tr><tr><td rowspan="5"> º B PCR Master Mix (45 mL) </td><td> 5 mL tampão PCR 10X </td></tr><tr><td> 1 mL 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 mL 100 B cartilha pmol / mL </td></tr><tr><td> 1 mL KlenTaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 mL de água </td></tr><tr><td rowspan="5"> º C PCR Master Mix (45 mL) </td><td> 5 uL tampão PCR 10X </td></tr><tr><td> 1 mL 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 mL 100 B cartilha pmol / mL </td></tr><tr><td> 1 mL KlenTaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 mL de água </td></tr><tr><td rowspan="4"> Tampão de hibridação (25 mL) </td><td> Um buffer de fragmentação mL 25X (Agilent) </td></tr><tr><td> 5 mL tampão 5X de bloqueio (Agilent) </td></tr><tr><td> 9,5 mL (ou quantidade de normalizar) de Cy3 marcado amostra </td></tr><tr><td> Adicionar água ao volume total de 25 mL </td></tr><tr><td> Agilent Virochip microarray </td><td> licença pendente; disponível a partir de Chiu laboratório, UCSF </td></tr></tbody></table>

usando um ensaio microarray pan-viral (virochip) para tela de amostras clínicas para patógenos virais

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

O diagnóstico de causas virais de muitas doenças infecciosas é difícil devido à diversidade inerente seqüência de vírus, bem como o surgimento contínuo de novos patógenos virais, como a SARS coronavirus e 2009 pandemia de H1N1 do vírus influenza, que não são detectáveis ​​através de métodos tradicionais. Para enfrentar esses desafios, temos desenvolvido e validado previamente uma plataforma de microarray pan-viral chamado de Virochip com a capacidade para detectar todos os vírus conhecidos, bem como variantes de romance com base na homologia de seqüência conservada 1. Usando o Virochip, identificamos o espectro de vírus associados com infecções respiratórias, incluindo casos de doença grave inexplicável em pacientes hospitalizados, com uma sensibilidade igual ou superior a 2-5 testes clínico convencional. O Virochip também tem sido usado para identificar novos vírus, incluindo o coronavírus SARS 6,7, um clade rinovírus romance 5, XMRV (um retrovírus ligado ao câncer de próstata) 8, bornavirus aviária (a causa de uma doença degenerativa nos papagaios) 9, Cardiovirus e um romance em crianças com doenças respiratórias e diarréicas 10. A versão atual do Virochip foi portado para uma plataforma de microarray Agilent e consiste de aproximadamente 36.000 sondas derivados de ~ 1.500 vírus no GenBank a partir de dezembro de 2009. Aqui demonstramos as etapas envolvidas no processamento de um ensaio Virochip do início ao fim (~ o ​​tempo de resposta 24 horas), incluindo amostras de extração de ácidos nucléicos, amplificação por PCR usando primers aleatórios, incorporação de corantes fluorescentes, e hibridação microarray, digitalização e análise.

O Virochip é um microarray pan-viral projetado para detectar simultaneamente todos os vírus conhecidos, bem como novos vírus, com base em homologia de seqüência conservada. Aqui demonstramos como executar um ensaio Virochip para analisar amostras clínicas para a presença de vírus conhecidos e desconhecidos.

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

O diagnóstico de causas virais de muitas doenças infecciosas é difícil devido à diversidade de sequência inerente aos vírus, bem como à emergência contínua...

Este procedimento utiliza o Viro chip, um ensaio de microarranjo viral abrangente para analisar amostras clínicas em busca de vírus conhecidos e desconhecidos. Primeiro, os ácidos nucleicos são extraídos de amostras clínicas. Em seguida, o RNA extraído é transcrito reversamente utilizando primers aleatórios.A síntese do segundo filamento de CD NA é realizada e a biblioteca de CD NA é amplificada por PCR aleatória. Em seguida, o CD NA amplificado é marcado com corantes fluorescentes e hibridizado em um microarranjo de chip viral. O passo final consiste em escanear e analisar o microarranjo.No fim, podem ser obtidos resultados que mostram a presença ou ausência de um vírus ou de vários vírus por meio da análise do microarranjo do chip. Métodos de detecção de amplo espectro, como o microarranjo viral por chip, são necessários na microbiologia diagnóstica porque síndromes clínicas comuns, como pneumonia, não são específicas a qualquer patógeno individual, e devido à constante ameaça emergente de novos patógenos virais, como o Coronavírus da SARS e o vírus da gripe H1N1 de 2009. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da microbiologia diagnóstica, como qual porcentagem das infecções não diagnosticadas no ambiente clínico pode ser causada por vírus novos ainda não identificados. As implicações desta técnica estendem-se para um diagnóstico melhor de doenças clínicas agudas no hospital, pois estamos testando centenas a milhares de patógenos potenciais simultaneamente.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método em 2002, quando decidimos aplicar a tecnologia recém-desenvolvida de microarranjos, pioneira no laboratório do Dr. Joseph DeRisi na UCSF, na detecção de vírus. Nosso primeiro caso de teste no mundo real foi utilizar o chip viral para identificar um coronavírus novo responsável pela SARS em 2003. Demonstrar o procedimento do início ao fim será um técnico do meu laboratório, que mostrará o uso do ensaio com o chip viral em uma amostra de swab nasal de uma criança para diagnosticar a causa de sua doença respiratória aguda. As amostras de swab nasofaríngeo são coletadas em recipientes estéreis contendo meio líquido de transporte viral e armazenadas congeladas em freezers a menos 80 graus Celsius.Em uma capela de biossegurança, deixe o tubo contendo a amostra descongelar e agite brevemente o swab no meio antes de descartar o swab em um recipiente para resíduos biológicos perigosos. Em seguida, alíquota 200 microlitros da amostra em um tubo de 1,5 mililitro. Passe a amostra por um filtro de centrifugação de 0,22 mícron para purificar as partículas virais e colete em um tubo novo de 1,5 mililitro.Em seguida, utilize o kit Turbo DNA da Ambien conforme as instruções do fabricante para degradar o DNA genômico do hospedeiro e purificar o ácido nucleico viral encapsulado protegido. Prossiga com a extração de RNA, utilizando o kit de extração de RNA viral XMO ZR ou o kit de vírus da Qiagen ultrasound, conforme as instruções do fabricante. Meça a concentração do RNA extraído utilizando um espectrofotômetro de ácidos nucleicos NanoDrop.A concentração de RNA deve preferencialmente ser de pelo menos 10 nanogramas por microlitro, mas pode variar de amostra para amostra, utilizando um tubo de parede fina de 200 microlitros. Adicione um microlitro do iniciador A numa concentração de 40 pico-mols por microlitro a quatro microlitros de RNA extraído. Aqueça a amostra a 65 graus Celsius por cinco minutos em um termociclador e, em seguida, deixe o tubo esfriar à temperatura ambiente por cinco minutos.Em seguida, adicione cinco microlitros de uma mistura-mestra contendo dois microlitros de tampão RT 5X, um microlitro de dNTP 12,5 milimolar, um microlitro de água, 0,5 microlitros de DTT 0,1 molar e 0,5 microlitros de transcriptase reversa superscript três em um termociclador. Incube o tubo a 42 graus Celsius por 60 minutos. Em seguida, aqueça a amostra a 94 graus Celsius por dois minutos.Para interromper a reação de transcriptase reversa, mantenha a 10 graus Celsius por dois minutos e centrifugue brevemente por cinco segundos. Em seguida, adicione cinco microlitros da mistura de quease, composta por um microlitro de tampão de quease cinco vezes, 3,8 microlitros de água e 0,15 microlitros de quease para a síntese da segunda fita. Aumente a temperatura do termociclador de 10 graus Celsius para 37 graus Celsius ao longo de oito minutos.Mantenha a 37 graus Celsius por oito minutos. Em seguida, aqueça a 94 graus Celsius por dois minutos para inativar a enzima e reduza a 10 graus Celsius neste ponto. Se desejado, armazene a amostra contendo 15 microlitros de cDNA a menos 20 graus Celsius.Primeiro, adicione cinco microlitros da amostra de CD NA a 45 microlitros de uma mistura mestra contendo cinco microlitros de tampão PCR 10 vezes, um microlitro de DNTP 12,5 milimolar, um microlitro de iniciador a 100 pomo por microlitro, B um microlitro de cleantech LA e 37 microlitros de água. Em seguida, execute o protocolo de PCR conforme a seguir: 94 °C por dois minutos, seguido por 25 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 50 °C por 45 segundos e 72 °C por um minuto.Em seguida, um passo de alongamento a 72 graus Celsius por cinco minutos, seguido por uma etapa de espera a 10 graus Celsius após a PCR. Verifique o produto da PCR em um gel de eletroforese de 1,5% AOSE. Deve-se visualizar uma faixa difusa com tamanho aproximado de 200 a 1000 pares de bases.Para incorporar o dNTP AAD, adicione cinco microlitros do produto da PCR viral a 45 microlitros de uma mistura-mestra contendo cinco microlitros de tampão PCR 10 vezes, um microlitro de A-A-D-N-T-P 12,5 milimolar, um microlitro de 100 p de múltiplos microlitros do iniciador B, um microlitro de ClinTech LA e 37 microlitros de água. Execute o protocolo de PCR conforme a seguir: 94 graus Celsius por dois minutos, 15 ciclos de 94 graus Celsius por 30 segundos, 50 graus Celsius por 45 segundos.72 graus Celsius por um minuto e uma etapa de alongamento de 72 graus Celsius por cinco minutos, mantendo a 10 graus Celsius. Em seguida, purifique o novo produto de PCR com o kit DNA Clean and Concentrator-3 conforme as instruções do fabricante e elua em 10 microlitros de tampão de eluição. Adicione um microlitro de bicarbonato de sódio um molar e um microlitro de si três aos 10 microlitros de produto de PCR e incube por uma hora no escuro.Em seguida, limpe novamente a amostra marcada com S utilizando o kit DNA Clean and Concentrator-5 e elua em 12 microlitros de tampão de eluição. Use 1,5 microlitro da amostra para verificar a concentração de cDNA e a quantidade de corante incorporado em um espectrofotômetro NanoDrop, em um tubo de tira para PCR, com um microlitro, tampão de fragmentação 25 vezes, cinco microlitros de tampão de bloqueio 5 vezes, 9,5 microlitros ou quantidade necessária para uma concentração final normalizada de 10 picomols ou moles por microlitro da amostra marcada com SI3 e água até um volume total de 25 microlitros. Em seguida, adicione 25 microlitros de tampão de hibridização GX 2 vezes e centrifugue brevemente para remover bolhas.Coloque um novo lâmina com junta na câmara de hibridização. Adicione 40 microlitros da amostra sobre a lâmina com junta. Em seguida, posicione o arranjo viral impresso pela Agilent com o lado marcado Agilent voltado para baixo sobre a lâmina com junta e aperte firmemente o parafuso.Coloque a câmara de hibridização em uma estufa a 65 graus Celsius e hibridize durante a noite usando uma rotação lenta de 10 rotações por minuto para lavar as matrizes. Primeiro, aqueça previamente o tampão dois a 37 graus Celsius durante o aquecimento. Encha um recipiente plástico de 500 mililitros com aproximadamente 250 mililitros do tampão um.Remova a matriz da câmara de hibridização, submerja a matriz e separe-a do lâmina de vedação. Transfira a matriz para o recipiente limpo e lave no tampão um por um minuto. Em seguida, utilizando um recipiente plástico separado de 500 mililitros.Lave a matriz no tampão dois pré-aquecido por um minuto. Após a lavagem, remova lentamente a matriz do tampão dois, tomando cuidado para evitar bolhas.Use um lenço de papel para remover o excesso de umidade, tomando cuidado para evitar tocar diretamente o lado ativo do arranjo. Por fim, coloque a lâmina no suporte com o lado Agilent voltado para cima e insira no escâner de arranjo. Neste procedimento, utilizamos um escâner de microarranjo de DNA Agilent de dois mícrons.Analise o microarranjo SI com três matrizes rotuladas em cinco mícrons ou dois mícrons, de acordo com o protocolo-padrão de digitalização do instrumento. Analise os microarranjos viral chipp por meio de análise de agrupamento ou pelo programa automatizado de análise RO chipp e unpredic. Utilizando o microarranjo Viro Chipp, o vírus da gripe nova H um N um de 2009 é facilmente detectado na amostra de swab nasal obtida de uma criança com quadro semelhante à gripe.Além disso, demonstramos que o chip viral é capaz de identificar não apenas vírus respiratórios, mas também uma ampla variedade de vírus provenientes de diferentes tecidos e fluidos corporais. Alguns exemplos de detecção de vírus em sangue total e soro utilizando o vichi são mostrados aqui. Essas são chamadas ere correspondentes ao microrrevestimento viro chip a partir de amostras de sangue, seja sangue total ou soro, coletadas de quatro pacientes; para cada amostra, as duas primeiras previsões virais são apresentadas, sendo que a previsão principal corresponde ao menor valor de P.Por exemplo, na amostra destacada em azul claro, a previsão principal para essa amostra é o vírus da dengue tipo um. Embora a segunda previsão em ordem seja o vírus da dengue tipo dois, o vírus real presente nessa amostra de sangue total foi confirmado como sendo realmente o vírus da dengue tipo um, em concordância com os resultados do dict. Outra aplicação do viro chip é na descoberta de patógenos novos.Alguns exemplos incluem as descobertas do coronavírus SARS X-M-R-V-A, do retrovírus OME associado ao câncer de próstata e à síndrome da fadiga crônica em humanos e do HTCV, um novo cardiovírus humano associado a infecções respiratórias e diarreia em crianças. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 12 horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir a disponibilidade de todos os equipamentos e reagentes necessários seguindo este procedimento.Outros métodos, como amplificação viral específica por PCR e sequenciamento profundo, podem ser realizados para confirmar e acompanhar padrões incomuns de hibridização em chips virais ou resultados de chips virais que sugiram a presença de um vírus novo após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de oncologia explorarem a associação de vírus novos com o câncer, nas áreas de biodefesa e microbiologia clínica para desenvolver ensaios microscópicos condensados para diagnóstico rápido de patógenos, e na área de virologia para a caracterização de vírus novos e sua associação com doenças. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar todas as etapas do ensaio de microrrede viral, um teste de vigilância de amplo espectro para detecção de patógenos virais em amostras clínicas, desde a extração de ácidos nucleicos de amostras clínicas até a hibridização e análise na microrrede.Não se esqueça de que o trabalho com amostras clínicas é considerado um risco biológico e a extração de ácidos nucleicos deve ser realizada em laboratórios classificados no nível de biossegurança dois ou superior.

using-pan-viral-microarray-assay-virochip-to-screen-clinical-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

Neste vídeo, demonstramos o processo de detecção de isotipos de anticorpos em várias amostras de soro humano usando uma lâmina de microarray impressa com subtipos antigênicos de cepas do vírus influenza.

Ensaio de microarranjo de antígeno viral para detectar isotipos de anticorpos no soro contra o antígeno viral

Este vídeo demonstra um ensaio de fixação viral para triagem de compostos antivirais. Usando o vírus da hepatite C geneticamente modificado e a luciferase, ele avalia os efeitos inibitórios na fixação viral, conforme indicado pela menor intensidade de luz em poços co-tratados em comparação com poços tratados apenas com o vírus.

Um ensaio de fixação viral para triagem de compostos antivirais

Um chip microfluídico integrado termoplástico tem sido desenvolvido para utilização como um diagnóstico molecular. O chip realiza a extracção dos ácidos nucleicos, a transcriptase reversa, e PCR. Os métodos para fabricar e executando o chip encontram-se descritos.

Fabricação de chips microfluídicos e método para detectar a gripe

Retrovírus humanos endógenos (HERV), que ocupam a 8% do genoma humano, manter reduzidas capacidades de codificação, mas a centenas de milhares de repetições terminais longas (LTRs). Um costume microarray Affymetrix foi desenhado para identificar indivíduo expressão HERV lugar e foi usado em tecidos de câncer de próstata como uma prova de conceito para futuros estudos clínicos.

Identificação baseada em Microarray de Individual HERV Loci Expressão: Aplicação a descoberta de biomarcadores em câncer de próstata

Três ensaios, incluindo o efeito citopático (CPE) baseado em ensaio, o ensaio de dose-resposta e (TOA) ensaio de Tempo-de-adição ter sido desenvolvido, optimizado e validado e utilizado para identificar novos medicamentos antivirais contra o vírus da febre catarral (VFC), bem como para determinar o possível mecanismo de ação-de-(MOA) para antivirais recentemente identificados.

Ensaios para a identificação de novos antivirais contra a febre catarral ovina vírus

Os ensaios in vitro para medir a replicação do vírus tem sido melhorada pelo desenvolvimento de vírus de RNA recombinantes que expressam luciferase ou outras enzimas capazes de bioluminescência. Aqui detalhamos uma triagem gasoduto de alto rendimento, que combina essas linhagens recombinantes de sarampo e vírus chikungunya para isolar os antivirais de amplo espectro de bibliotecas químicas.

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

testes de alto rendimento de DNA e RNA patógenos base por nanoescala PCR é descrito usando um canino sindrômica e painel de PCR respiratória equina.

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Nós apresentamos um ensaio de fluxo de alto rendimento por citometria de determinar a atividade fagocítica de antígenos-anticorpos específicos a partir de amostras clínicas, utilizando antígenos fluorescentes revestido contas e uma linha celular monocítica expressar múltiplos receptores Fc-proporcionando o uso do receptor e determinações atividade fagocitária em um padronizados e forma reproduzível para qualquer antígeno de interesse.

Determinação da atividade fagocítica de amostras de anticorpos Clínica

Os resultados e conclusões deste relatório são de responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a opinião dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

Aprenda a usar o ensaio de microarray pan-viral Virochip para detectar patógenos virais em amostras clínicas. Este método amplifica e hibridiza ácidos nucleicos para identificar vírus conhecidos e novos.

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

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