Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

Este procedimento utiliza o Viro chip, um ensaio de microarranjo viral abrangente para analisar amostras clínicas em busca de vírus conhecidos e desconhecidos. Primeiro, os ácidos nucleicos são extraídos de amostras clínicas. Em seguida, o RNA extraído é transcrito reversamente utilizando primers aleatórios.

A síntese do segundo filamento de CD NA é realizada e a biblioteca de CD NA é amplificada por PCR aleatória. Em seguida, o CD NA amplificado é marcado com corantes fluorescentes e hibridizado em um microarranjo de chip viral. O passo final consiste em escanear e analisar o microarranjo.

No fim, podem ser obtidos resultados que mostram a presença ou ausência de um vírus ou de vários vírus por meio da análise do microarranjo do chip. Métodos de detecção de amplo espectro, como o microarranjo viral por chip, são necessários na microbiologia diagnóstica porque síndromes clínicas comuns, como pneumonia, não são específicas a qualquer patógeno individual, e devido à constante ameaça emergente de novos patógenos virais, como o Coronavírus da SARS e o vírus da gripe H1N1 de 2009. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da microbiologia diagnóstica, como qual porcentagem das infecções não diagnosticadas no ambiente clínico pode ser causada por vírus novos ainda não identificados. As implicações desta técnica estendem-se para um diagnóstico melhor de doenças clínicas agudas no hospital, pois estamos testando centenas a milhares de patógenos potenciais simultaneamente.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método em 2002, quando decidimos aplicar a tecnologia recém-desenvolvida de microarranjos, pioneira no laboratório do Dr. Joseph DeRisi na UCSF, na detecção de vírus. Nosso primeiro caso de teste no mundo real foi utilizar o chip viral para identificar um coronavírus novo responsável pela SARS em 2003. Demonstrar o procedimento do início ao fim será um técnico do meu laboratório, que mostrará o uso do ensaio com o chip viral em uma amostra de swab nasal de uma criança para diagnosticar a causa de sua doença respiratória aguda. As amostras de swab nasofaríngeo são coletadas em recipientes estéreis contendo meio líquido de transporte viral e armazenadas congeladas em freezers a menos 80 graus Celsius.

Em uma capela de biossegurança, deixe o tubo contendo a amostra descongelar e agite brevemente o swab no meio antes de descartar o swab em um recipiente para resíduos biológicos perigosos. Em seguida, alíquota 200 microlitros da amostra em um tubo de 1,5 mililitro. Passe a amostra por um filtro de centrifugação de 0,22 mícron para purificar as partículas virais e colete em um tubo novo de 1,5 mililitro.

Em seguida, utilize o kit Turbo DNA da Ambien conforme as instruções do fabricante para degradar o DNA genômico do hospedeiro e purificar o ácido nucleico viral encapsulado protegido. Prossiga com a extração de RNA, utilizando o kit de extração de RNA viral XMO ZR ou o kit de vírus da Qiagen ultrasound, conforme as instruções do fabricante. Meça a concentração do RNA extraído utilizando um espectrofotômetro de ácidos nucleicos NanoDrop.

A concentração de RNA deve preferencialmente ser de pelo menos 10 nanogramas por microlitro, mas pode variar de amostra para amostra, utilizando um tubo de parede fina de 200 microlitros. Adicione um microlitro do iniciador A numa concentração de 40 pico-mols por microlitro a quatro microlitros de RNA extraído. Aqueça a amostra a 65 graus Celsius por cinco minutos em um termociclador e, em seguida, deixe o tubo esfriar à temperatura ambiente por cinco minutos.

Em seguida, adicione cinco microlitros de uma mistura-mestra contendo dois microlitros de tampão RT 5X, um microlitro de dNTP 12,5 milimolar, um microlitro de água, 0,5 microlitros de DTT 0,1 molar e 0,5 microlitros de transcriptase reversa superscript três em um termociclador. Incube o tubo a 42 graus Celsius por 60 minutos. Em seguida, aqueça a amostra a 94 graus Celsius por dois minutos.

Para interromper a reação de transcriptase reversa, mantenha a 10 graus Celsius por dois minutos e centrifugue brevemente por cinco segundos. Em seguida, adicione cinco microlitros da mistura de quease, composta por um microlitro de tampão de quease cinco vezes, 3,8 microlitros de água e 0,15 microlitros de quease para a síntese da segunda fita. Aumente a temperatura do termociclador de 10 graus Celsius para 37 graus Celsius ao longo de oito minutos.

Mantenha a 37 graus Celsius por oito minutos. Em seguida, aqueça a 94 graus Celsius por dois minutos para inativar a enzima e reduza a 10 graus Celsius neste ponto. Se desejado, armazene a amostra contendo 15 microlitros de cDNA a menos 20 graus Celsius.

Primeiro, adicione cinco microlitros da amostra de CD NA a 45 microlitros de uma mistura mestra contendo cinco microlitros de tampão PCR 10 vezes, um microlitro de DNTP 12,5 milimolar, um microlitro de iniciador a 100 pomo por microlitro, B um microlitro de cleantech LA e 37 microlitros de água. Em seguida, execute o protocolo de PCR conforme a seguir: 94 °C por dois minutos, seguido por 25 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 50 °C por 45 segundos e 72 °C por um minuto.

Em seguida, um passo de alongamento a 72 graus Celsius por cinco minutos, seguido por uma etapa de espera a 10 graus Celsius após a PCR. Verifique o produto da PCR em um gel de eletroforese de 1,5% AOSE. Deve-se visualizar uma faixa difusa com tamanho aproximado de 200 a 1000 pares de bases.

Para incorporar o dNTP AAD, adicione cinco microlitros do produto da PCR viral a 45 microlitros de uma mistura-mestra contendo cinco microlitros de tampão PCR 10 vezes, um microlitro de A-A-D-N-T-P 12,5 milimolar, um microlitro de 100 p de múltiplos microlitros do iniciador B, um microlitro de ClinTech LA e 37 microlitros de água. Execute o protocolo de PCR conforme a seguir: 94 graus Celsius por dois minutos, 15 ciclos de 94 graus Celsius por 30 segundos, 50 graus Celsius por 45 segundos.

72 graus Celsius por um minuto e uma etapa de alongamento de 72 graus Celsius por cinco minutos, mantendo a 10 graus Celsius. Em seguida, purifique o novo produto de PCR com o kit DNA Clean and Concentrator-3 conforme as instruções do fabricante e elua em 10 microlitros de tampão de eluição. Adicione um microlitro de bicarbonato de sódio um molar e um microlitro de si três aos 10 microlitros de produto de PCR e incube por uma hora no escuro.

Em seguida, limpe novamente a amostra marcada com S utilizando o kit DNA Clean and Concentrator-5 e elua em 12 microlitros de tampão de eluição. Use 1,5 microlitro da amostra para verificar a concentração de cDNA e a quantidade de corante incorporado em um espectrofotômetro NanoDrop, em um tubo de tira para PCR, com um microlitro, tampão de fragmentação 25 vezes, cinco microlitros de tampão de bloqueio 5 vezes, 9,5 microlitros ou quantidade necessária para uma concentração final normalizada de 10 picomols ou moles por microlitro da amostra marcada com SI3 e água até um volume total de 25 microlitros. Em seguida, adicione 25 microlitros de tampão de hibridização GX 2 vezes e centrifugue brevemente para remover bolhas.

Coloque um novo lâmina com junta na câmara de hibridização. Adicione 40 microlitros da amostra sobre a lâmina com junta. Em seguida, posicione o arranjo viral impresso pela Agilent com o lado marcado Agilent voltado para baixo sobre a lâmina com junta e aperte firmemente o parafuso.

Coloque a câmara de hibridização em uma estufa a 65 graus Celsius e hibridize durante a noite usando uma rotação lenta de 10 rotações por minuto para lavar as matrizes. Primeiro, aqueça previamente o tampão dois a 37 graus Celsius durante o aquecimento. Encha um recipiente plástico de 500 mililitros com aproximadamente 250 mililitros do tampão um.

Remova a matriz da câmara de hibridização, submerja a matriz e separe-a do lâmina de vedação. Transfira a matriz para o recipiente limpo e lave no tampão um por um minuto. Em seguida, utilizando um recipiente plástico separado de 500 mililitros.

Lave a matriz no tampão dois pré-aquecido por um minuto. Após a lavagem, remova lentamente a matriz do tampão dois, tomando cuidado para evitar bolhas.

Use um lenço de papel para remover o excesso de umidade, tomando cuidado para evitar tocar diretamente o lado ativo do arranjo. Por fim, coloque a lâmina no suporte com o lado Agilent voltado para cima e insira no escâner de arranjo. Neste procedimento, utilizamos um escâner de microarranjo de DNA Agilent de dois mícrons.

Analise o microarranjo SI com três matrizes rotuladas em cinco mícrons ou dois mícrons, de acordo com o protocolo-padrão de digitalização do instrumento. Analise os microarranjos viral chipp por meio de análise de agrupamento ou pelo programa automatizado de análise RO chipp e unpredic. Utilizando o microarranjo Viro Chipp, o vírus da gripe nova H um N um de 2009 é facilmente detectado na amostra de swab nasal obtida de uma criança com quadro semelhante à gripe.

Além disso, demonstramos que o chip viral é capaz de identificar não apenas vírus respiratórios, mas também uma ampla variedade de vírus provenientes de diferentes tecidos e fluidos corporais. Alguns exemplos de detecção de vírus em sangue total e soro utilizando o vichi são mostrados aqui. Essas são chamadas ere correspondentes ao microrrevestimento viro chip a partir de amostras de sangue, seja sangue total ou soro, coletadas de quatro pacientes; para cada amostra, as duas primeiras previsões virais são apresentadas, sendo que a previsão principal corresponde ao menor valor de P.

Por exemplo, na amostra destacada em azul claro, a previsão principal para essa amostra é o vírus da dengue tipo um. Embora a segunda previsão em ordem seja o vírus da dengue tipo dois, o vírus real presente nessa amostra de sangue total foi confirmado como sendo realmente o vírus da dengue tipo um, em concordância com os resultados do dict. Outra aplicação do viro chip é na descoberta de patógenos novos.

Alguns exemplos incluem as descobertas do coronavírus SARS X-M-R-V-A, do retrovírus OME associado ao câncer de próstata e à síndrome da fadiga crônica em humanos e do HTCV, um novo cardiovírus humano associado a infecções respiratórias e diarreia em crianças. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 12 horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir a disponibilidade de todos os equipamentos e reagentes necessários seguindo este procedimento.

Outros métodos, como amplificação viral específica por PCR e sequenciamento profundo, podem ser realizados para confirmar e acompanhar padrões incomuns de hibridização em chips virais ou resultados de chips virais que sugiram a presença de um vírus novo após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de oncologia explorarem a associação de vírus novos com o câncer, nas áreas de biodefesa e microbiologia clínica para desenvolver ensaios microscópicos condensados para diagnóstico rápido de patógenos, e na área de virologia para a caracterização de vírus novos e sua associação com doenças. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar todas as etapas do ensaio de microrrede viral, um teste de vigilância de amplo espectro para detecção de patógenos virais em amostras clínicas, desde a extração de ácidos nucleicos de amostras clínicas até a hibridização e análise na microrrede.

Não se esqueça de que o trabalho com amostras clínicas é considerado um risco biológico e a extração de ácidos nucleicos deve ser realizada em laboratórios classificados no nível de biossegurança dois ou superior.