Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

Este procedimento usa o chip Viro, um ensaio de microarray panviral para analisar amostras clínicas de vírus conhecidos e desconhecidos. Primeiro, os ácidos nucléicos são extraídos de amostras clínicas. Em seguida, o RNA extraído é transcrito reversamente usando primers aleatórios.

A síntese de CD NA da segunda fita é realizada e a biblioteca de CD NA é amplificada com PCR aleatória. Em seguida, o cd amplificado NA é marcado com corantes fluorescentes e hibridizado em um microarray de chip viral. A etapa final é digitalizar e analisar o microarray.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a presença ou ausência de um vírus ou vários vírus por meio da análise do microarray do chip. Métodos de detecção de amplo espectro, como um microarray de chip viral, são necessários em microbiologia diagnóstica porque as síndromes clínicas comuns, como pneumonia, não são específicas de nenhum patógeno individual e devido à ameaça emergente contínua de novos patógenos virais, como o SARS Coronavirus e o novo vírus da gripe H one N one de 2009, Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da microbiologia diagnóstica, como a porcentagem de infecções não diagnosticadas no ambiente clínico que podem ser causadas por novos vírus ainda não identificados. As implicações dessa técnica se estendem para um melhor diagnóstico de doenças clínicas agudas no hospital, porque estamos testando centenas a milhares de patógenos em potencial simultaneamente.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez em 2002, quando decidimos aplicar a tecnologia recém-desenvolvida de microarrays pioneira no laboratório do Dr. Joseph DeRisi na UCSF para a detecção de vírus. Nosso primeiro caso de teste no mundo real foi usar o chip viral para identificar um novo coronavírus responsável pela SARS em 2003, demonstrando o procedimento do início ao fim por um técnico do meu laboratório que demonstrará o uso do ensaio do chip viral em uma amostra de swab nasal de uma criança para diagnosticar a causa de sua doença respiratória aguda. As amostras de swab nasofaríngeo são coletadas em recipientes estéreis contendo transporte viral, meio líquido e armazenadas congeladas em um freezer de 80 graus Celsius negativos.

Em uma capa de biossegurança, deixe o tubo contendo a amostra descongelar e mexa brevemente o cotonete no meio antes de descartá-lo em uma lixeira de risco biológico. Em seguida, alíquota de 200 microlitros da amostra em um tubo de 1,5 mililitro. Passe a amostra por um filtro de centrifugação de 0,22 mícron para purificar as partículas virais e em um tubo novo de 1,5 mililitro.

Em seguida, use o kit Turbo DNA da Ambien de acordo com as instruções do fabricante para degradar o DNA genômico do hospedeiro e purificar o ácido nucleico viral encapsulado protegido. Siga isso com a extração de RNA, usando o kit de extração de RNA viral XMO ZR ou o kit de vírus do ultrassom Qiagen de acordo com as instruções do fabricante. Meça a concentração do RNA extraído usando um espectrofotômetro de ácido nucleico NanoDrop.

A concentração de RNA é preferencialmente de pelo menos 10 nanogramas por microlitro, mas varia de amostra para amostra usando um tubo de parede fina de 200 microlitros. Adicione um microlitro de primer A a uma concentração de 40 moles de PAICA por microlitro a quatro microlitros de RNA extraído. Aqueça a amostra a 65 graus Celsius por cinco minutos em um termociclador e, em seguida, deixe o tubo esfriar até a temperatura ambiente por cinco minutos.

Em seguida, adicione cinco microlitros de uma mistura master contendo dois microlitros cinco vezes o tampão RT, um microlitro 12,5 milimolar, DNTP um microlitro de água 0,5 microlitros, 0,1 molar DTT e 0,5 microlitros sobrescrito três, transcriptase reversa em um termociclador. Incube o tubo a 42 graus Celsius por 60 minutos. Em seguida, aqueça a amostra a 94 graus Celsius por dois minutos.

Para abortar a reação de transcriptase reversa, ligue para 10 graus Celsius por dois minutos e pulse a centrífuga por cinco segundos. Em seguida, adicione cinco microlitros de mistura de quease consistindo em um microlitro cinco vezes o tampão quease, 3,8 microlitros de água e 0,15 microlitros quease a síntese da segunda fita. Aumente o termociclador de 10 graus Celsius para 37 graus Celsius em oito minutos.

Segure a 37 graus Celsius por oito minutos. Em seguida, aqueça a 94 graus Celsius por dois minutos para desativar o engasgo e chame para 10 graus Celsius neste momento. Se desejar, armazene a amostra contendo 15 microlitros de CDNA a menos 20 graus Celsius.

Primeiro, adicione cinco microlitros de amostra de CD NA a 45 microlitros de uma mistura principal que consiste em cinco microlitros 10 vezes o tampão PCR, um microlitro 12,5 milimolar, DNTP um microlitro 100 pomo por microlitro primer, B um microlitro cleantech LA e 37 microlitros de água. Em seguida, execute o protocolo de PCR da seguinte forma, 94 graus Celsius por dois minutos, seguido por 25 ciclos de 94 graus Celsius por 30 segundos. 50 graus Celsius por 45 segundos e 72 graus Celsius por um minuto.

Em seguida, um passo ajoelhado de 72 graus Celsius por cinco minutos, seguido por uma espera a 10 graus Celsius após a PCR. Verifique o produto de PCR e um gel de eletroforese a 1,5% AOSE. Um esfregaço de aproximadamente 200 a 1000 pares de bases deve ser visualizado.

Para incorporar o AAD DNTP, adicione cinco microlitros de produto de PCR viral a 45 microlitros de uma mistura principal que consiste em cinco microlitros 10 vezes o tampão PCR, um microlitro 12,5 milimolar, A-A-D-N-T-P um microlitro 100 p de primer de vários microlitros, B um microlitro ClinTech LA e 37 microlitros de água. Execute o protocolo de PCR da seguinte forma, 94 graus Celsius por dois minutos, 15 ciclos de 94 graus Celsius por 30 segundos. 50 graus Celsius por 45 segundos.

72 graus Celsius por um minuto e um passo ajoelhado de 72 graus Celsius por cinco minutos e mantenha a 10 graus Celsius. Em seguida, limpe o novo produto de PCR com o kit de limpeza e concentrador de DNA três de acordo com as instruções do fabricante e coloque 10 microlitros de tampão de eluição. Adicione um microlitro de um bicarbonato molar e um microlitro si três aos 10 microlitros de produto PCR e incube por uma hora no escuro.

Em seguida, novamente, limpe a amostra marcada com S com DNA clean e concentrador cinco kit e elua em 12 microlitros de tampão de eluição. Use 1,5 microlitros de amostra para verificar a concentração de CDNA e a quantidade de corante incorporada em um espectrofotômetro NanoDrop em um tubo de tira de PCR em um microlitro 25 vezes o tampão de fragmentação cinco microlitros cinco vezes o tampão de bloqueio 9,5 microlitros ou a quantidade necessária para uma concentração final normalizada de 10 picos ou moles por microlitro de SI três amostras marcadas e água para um volume total de 25 microlitros. Em seguida, adicione 25 microlitros de tampão de hibridização GX duas vezes e gire brevemente para remover as bolhas.

Coloque uma nova corrediça de junta na câmara de hibridização. Carregue 40 microlitros da amostra na lâmina da junta. Em seguida, coloque a matriz viral impressa Agilent com o lado marcado Agilent para baixo na parte superior da corrediça da gaxeta e aperte bem o parafuso.

Coloque a câmara de hibridização em um forno a 65 graus Celsius e hibridize durante a noite usando uma rotação lenta de 10 rotações por minuto para lavar as matrizes. Primeiro, pré-aqueça o tampão de dois a 37 graus Celsius durante o aquecimento. Encha um recipiente de plástico de 500 mililitros com aproximadamente 250 mililitros de tampão. Um.

Remova a matriz da câmara de hibridização, mergulhe a matriz e separe-a da corrediça da junta. Transfira a matriz para o recipiente limpo e lave no tampão um por um minuto. Em seguida, usando um recipiente de plástico separado de 500 mililitros.

Lave a matriz em tampão pré-aquecido dois por um minuto. Após a lavagem, remova lentamente a matriz do buffer. Dois, ter cuidado para evitar bolhas.

Use um lenço umedecido para absorver a umidade extra, tomando cuidado para evitar tocar diretamente no lado ativo da matriz. Por fim, coloque a lâmina no suporte da lâmina com o lado Agilent voltado para cima e insira no scanner de matriz. Neste procedimento, usamos um scanner de microarray de DNA de dois mícrons da Agilent.

Digitalize a matriz rotulada SI três a cinco mícrons ou dois mícrons de acordo com o protocolo de varredura padrão do instrumento. Analise microarrays de chips virais por análise de cluster ou pelo programa automatizado de análise de chips RO e sem precisão. Usando o microarray Viro Chipp 2009, o novo vírus influenza H one N one é prontamente detectado na amostra de swab nasal obtida de uma criança com doença semelhante à gripe.

Além disso, mostramos que o chip viral é capaz de identificar não apenas vírus respiratórios, mas também uma ampla gama de vírus de uma variedade de tecidos e fluidos corporais diferentes. Alguns exemplos de detecção de vírus em sangue total e soro usando o vichi, conforme mostrado aqui. Estas são chamadas correspondentes ao microraio do chip viro de amostras de sangue, sangue total ou soro retirado de quatro pacientes para cada amostra, as duas principais previsões de vírus são mostradas com a previsão de vírus superior tendo o menor valor de P.

Por exemplo, na amostra destacada em azul claro, a principal previsão para essa amostra é o vírus da dengue tipo um. Embora a segunda previsão classificada seja o vírus da dengue tipo dois, o vírus real naquela amostra de sangue total foi de fato confirmado como sendo o vírus da dengue tipo um, de acordo com os resultados do dict. Outra aplicação do chip viro é na descoberta de novos patógenos.

Alguns exemplos incluem as descobertas do coronavírus sars X-M-R-V-A, retrovírus OME ligado ao câncer de próstata e síndrome da fadiga crônica em humanos e HTCV, um novo vírus cardiovascular humano associado a infecções respiratórias e de diarreia em crianças Uma vez dominado. Esta técnica pode ser feita em 12 horas se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de garantir a disponibilidade de todos os equipamentos e reagentes necessários após este procedimento.

Outros métodos, como amplificação de PCR viral específica e sequenciamento profundo, podem ser realizados para confirmar e acompanhar padrões incomuns de hibridização de chips virais ou resultados de chips virais que sugerem a presença de um novo vírus após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da oncologia explorarem a associação de novos vírus com câncer nos campos de biodefesa e microbiologia clínica para desenvolver ensaios condensados de base micro para diagnóstico rápido de patógenos e no campo da virologia para caracterização de novos vírus e sua associação com doenças. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar todas as etapas do ensaio de microraios de chip viral, um teste de vigilância de amplo espectro para detectar patógenos virais em amostras clínicas, desde a extração de ácido nucleico, de amostras clínicas até a hibridização e análise de microraios.

Não se esqueça de que trabalhar com amostras clínicas é considerado de risco biológico e a extração de ácidos nucleicos deve ser realizada em laboratórios classificados no nível de biossegurança dois ou superior.