Name: Micro-Mecânica Caracterização do tecido pulmonar Usando Microscopia de Força Atômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprenda a caracterizar a rigidez do tecido pulmonar normal e fibrosico usando microindentação por microscopia de força atômica. Esta técnica oferece resolução espacial sem precedentes para mapear variações mecânicas locais.

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Agradecemos a A. e B. Shea Tager por sua colaboração em curso, e para fornecer o tecido pulmonar utilizado para fins de demonstração aqui. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health conceder HL-092961. Este trabalho foi realizado em parte do Centro de Sistemas em nanoescala (CNS), um membro da Rede Nacional de Nanotecnologia Infra-estrutura, que é apoiado pela National Science Foundation sob NSF prêmio ECS-0335765. CNS é parte da Faculdade de Artes e Ciências da Universidade de Harvard.

1. Faixa de tecido de pulmão Preparação <ol><li> Tecido pulmonar é altamente compatível e difícil de cortar em tiras para a caracterização AFM. Para transitoriamente estabilizar a estrutura do pulmão para o corte, inflar os pulmões do rato isolado intratraqueal com 50 ml / kg de peso corporal de 2% gel baixo ponto de agarose (preparado em PBS) aquecido a 37 ° C. Amarrar a traquéia e os pulmões inflados fresco em um banho de PBS a 4 ° C por 60 minutos. O gel de agarose vai endurecer e nos espaços gentilmente estabilizar a estrutura do pulmão durante este intervalo de 5. Maiores concentrações de agarose, de 3-4%, ou seja, podem ser usados ​​para aumentar ainda mais a estabilização de tecidos para o corte. </li><li> Corte a agarose estabilizado tecido pulmonar do rato com uma navalha ou lâmina de bisturi em tiras de 5 x 5 mm de comprimento e largura e 400 m de espessura, em seguida, lavar as tiras em um banho de PBS pré-aquecido a 37 ° C usando um de 100 ml copo de vidro em uma bancada placa aquecida mexa por 5 minutos para remover agarose residual. Para excluir grandes vias aéreas e vasos, cortar tiras de regiões distantes dos principais subpleural-tronco brônquios. Se as vias aéreas e navios de grande porte estão a ser trabalhada, cortar tiras de tecido pulmonar mais proximal ao tronco principal brônquios. </li></ol> 2. AFM Microindentation e imagens de fluorescência <ol><li> Para isolar áreas de interesse para microindentation AFM, o tecido pode ser visualizado por microscopia de contraste de fase, ou imunocoradas e visualizados por microscopia de fluorescência. Para a imunocoloração, bloco tiras de tecido com 5% de soro a partir da fonte do anticorpo secundário desejado (em PBS) por 2 horas sem fixação ou permeabilização à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as tiras de tecido com o anticorpo primário apropriado (por exemplo, de coelho anti-colágeno-I para visualizar colágeno intersticial (1:250 diluição), de coelho anti-laminina (1:250 diluição) para visualizar membrana basal) em um poço de uma placa de 12 poços em um rocker, agitando suavemente por 1 hora, lave amostra 3 vezes por 5 minutos cada com PBS, seguido pelo anticorpo secundário apropriado conjugado com etiqueta fluorescente (por exemplo, Alexa Fluor 546 cabra anticorpo anti-coelho secundário (1:250 diluição)) para 1 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lave as tiras de tecido extensivamente com PBS e armazene em PBS a 4 ° C </li><li> Imediatamente antes da caracterização AFM, anexar a tira de tecido para um poli-l-lisina revestido lamínula de 15 mm, levantando as lamelas de baixo do tecido flutuante, certificando-se a tira de tecido se espalha uniformemente sobre a superfície lamela, se necessário sanduíche, a faixa com um pano limpo segundo, não revestido lamela e aplicar pressão suave para auxiliar na fixação de tecidos para a lamela poli-l-lisina-revestido. </li><li> Calibrar o sistema de AFM seguir instruções do fabricante antes de cada rodada de experimentos microindentation. Determinar dois parâmetros críticos: 1) Primavera do cantilever constante utilizando o método de flutuação térmica no ar 6, e, 2) a sensibilidade de deflexão do cantilever, que é um parâmetro usado para dimensionar o sinal de saída fotodiodo para a distância real cantilever deflexão, Δd. Calibrar a sensibilidade de deflexão pela obtenção de uma curva de força-deslocamento padrão em PBS numa lâmina de vidro limpo, então calcular a inclinação da curva força-deslocamento (Fig.1b). Na medição da curva força-deslocamento, a ponta do AFM é estendida e retraída em direção da superfície da amostra em um único local (sem rastering em direções XY), com a deflexão do cantilever, Δd, monitorizada como uma função de ponta de deslocamento, Δz . </li></ol> Recomendamos a utilização de um silício cantilever triângulo nitreto com a 5 mícrons de diâmetro esférico borosilicato ponta (Novascan). Usando sondas AFM com uma fonte constante de 0,06 N / m, temos mecanicamente caracterizada materiais macios, com módulos de cisalhamento que mede de 100 a 50.000 Pa. <ol start="6"><li> Limpe a superfície inferior da lamela amostra com papel de tecido, prenda-a com uma lâmina de vidro padrão com graxa de vácuo, montar a lâmina de vidro no palco amostra AFM, e cobrir o tecido com 500 mL de PBS (temperatura ambiente). </li><li> Definir o microscópio para visualização olho peças para alinhar a ponta do AFM no centro do campo de visão, ajustando o estágio da amostra do microscópio. Escolha uma área de interesse no tecido movendo o estágio amostra AFM, em seguida, mudar para o CCD de câmera para gravar imagens de contraste de fase e / ou imagens de fluorescência do tecido, como desejado. </li><li> Realizar operação padrão engajamento AFM, movendo a ponta do AFM lentamente para baixo até que esteja em contato com a amostra. </li><li> Caracterização precisa microindentation AFM de amostras moles requer profundidades recuo pequeno para evitar grandes cepas locais que invalida o modelo de Hertz utilizado para o cálculo módulo de elasticidade. Para evitar grandes deformações, execute o recuo no modo de disparo, definindo a deflexão máxima cantilever (ponto gatilho) a 500 nm. Este limite de deflexão irá conter oforça de recuo máximo para menos de 30 nN (F = primavera cantilever deslocamento * constante, ou F max = 0,06 nN / nm * 500 nm = 30 nN). </li></ol> A velocidade de recuo deve ser selecionado para ser suficientemente lento para explorar as propriedades elásticas em vez viscoelástico da amostra macio 7. A faixa de velocidade de 2-20 mM por segundo é adequado para o tecido pulmonar. <ol start="10"><li> Para uma única medição de uma área de interesse, mover a sonda de AFM para o local de interesse e realizar um recorte único para coletar uma curva força-deslocamento padrão (a sonda se move apenas na direção Z, sem varredura XY). </li><li> Para mapeamento automatizado de uma região de interesse, mude para Força-mode Map, selecione o tamanho da digitalização e pontos de amostra dentro da área selecionada. Em Força-Map modo, o rasters ponta do AFM em toda a superfície da amostra entre os movimentos de recuo, e coleta individuais curvas força-deslocamento em cada ponto em uma grade de amostragem definida. Mais pontos de amostragem irá proporcionar maior resolução espacial, mas prolongar o tempo necessário para o mapeamento. Nós achamos prático usar uma grade de 16 x amostra de 16 para mapear uma área de 80 x 80 mícrons a uma velocidade de recuo de 20 mM por segundo, que pode ser concluído em aproximadamente 10 minutos. </li></ol> 3. AFM extração de dados <ol><li> Para calcular o módulo de Young, o traçado da curva força-deslocamento para o modelo de Hertz indentação esférica utilizando mínimos quadrados não-linear montagem curva 8 (Fig.1 A, C): <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="Equação 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 1"> onde F = k c * Δ d, é a força para dobrar o cantilever, k c é a mola cantilever constante, R é raio da ponta esfera, δ = Δ z - Δ d é de recuo e υ é a proporção da amostra Poisson (υ = 0,4 para o tecido pulmonar 9). </li><li> Para avaliar a qualidade do ajuste, calcule o valor SSR, ou a soma dos quadrados da diferença entre os dados e os valores de ajuste, durante o ajuste de curva não-linear. Eliminar as medições não confiáveis ​​ou não-interpretável, descartando dados "ruins" as curvas com valores de SSR grande. </li><li> Se desejar, converter módulo de elasticidade (E) para módulo de cisalhamento (G), usando a relação E = 2 x (1 + υ) x G. Para visualizar padrões espaciais de rigidez coletados em Força-mode Map, os dados do gráfico de módulo no contorno mapas (por exemplo, 16 x 16 grade de amostragem cobrindo uma área de 80 x 80 mm). </li><li> Para processar uma grande quantidade de dados da curva de força, um algoritmo personalizado pode ser escrito para ajustar automaticamente as curvas força-deslocamento, o extrato de módulos e / ou elastographs trama usando os mesmos procedimentos e parâmetros, conforme descrito em 3.2 e 3.3 (por exemplo, Matlab). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 (A) Esquema de AFM microindentation de uma amostra suave em um substrato rígido usando uma sonda esférica (Reproduzido com permissão de Dimitriadis E., et al. 2002 Biophys J 8). (B) Representante curva força-deslocamento coletados a partir de uma lâmina de vidro limpa em PBS para determinar a sensibilidade de deflexão do cantilever. (C) Representante curvas força-deslocamento coletados de moles (azul) e rígida (vermelho) amostras mostrando os parâmetros correspondentes a partir de (A). 4. Resultados representativos: Figura 2A mostra uma faixa parênquima pulmonar anexado em poli-l-lisina lamela revestido em PBS com uma sonda de AFM no lugar diretamente acima da região de interesse e pronto para o mapeamento microindentation. Figura 2B mostra que no tecido adequadamente cortadas e coradas, a micro-arquitetura alveolar do parênquima pulmonar está bem preservada, como pode ser observado através da coloração de imunofluorescência para laminina componente da membrana do porão sem fixação ou de permeabilização. A Figura 2 mostra a coloração CD de imunofluorescência para colágeno I em fresco nos pulmões de camundongos unfixed colhidas previamente tratados com PBS (Fig. 2C), ou tratados com bleomicina (Fig. 2D) para induzir a fibrose 10. Figura 3A mostra amostragem às forças de deslocamento de parcelas obtidas microindentation AFM. Com a mesma força aplicada, AFM ponta gera um grande recuo em uma região moles (linha azul), resultando em um relativamente "flat" curva de força-deslocamento versus um recuo pequeno e um "steep" curva de força-deslocamento para uma região mais aguerrida ( linha vermelha). A fim de obter curvas força limpo, depois de cada reentrância a ponta do AFM precisa ser retraído completamente da superfície da amostra e livre de contato antes do recuo seguinte. Este estado contato livre corresponde à região plana da curva na Figura 3A, onde a ponta traduz sem deflexão cantilever. Figura 3B mostra uma curva típica falsa sem uma região plana que ocorre quando a ponta não está completamente retraído a partir da superfície da amostra (amostra macio por exemplo, umttaches a ponta) o que torna impossível determinar o ponto de contato. Se a ponta é completamente preso em amostra suave, a curva pode parecer como mostrado na Figura 3C, sem deflexão clara, mas o ruído pequeno. A Figura 4 mostra dados de módulo de cisalhamento extraído de força-deslocamento curvas exibidas espacialmente como mapas rigidez (elastographs), as escalas onde a cor com o módulo de cisalhamento. Elastographs demonstram diferenças marcantes na faixa e distribuição de módulo de cisalhamento no tecido normal (Fig. 4A) e fibrose (Fig. 4B) parênquima pulmonar, e grandes variações espaciais no módulo de cisalhamento, especialmente dentro da amostra de pulmão fibrótico. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. (A) Micrografia contraste de fase mostrando uma sonda de AFM com um rato strip parênquima pulmonar. Barra de escala, 50 mm. (B) imunocoloração de laminina no tecido normal do mouse pulmão mostrando a micro-arquitetura alveolar de parênquima pulmonar normal. Caixa branca indica típico 80-by-80μm área de mapeamento elasticidade. Barra de escala: 20 mM. (C e D) imunocoloração de colágeno I em solução salina (C) e bleomicina (D) tratados rato parênquima pulmonar. Barras de escala, 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. (A) Representante interpretável curvas força-deslocamento coletados de solução salina (azul) e tratados com bleomicina (vermelho) do mouse parênquima pulmonar, respectivamente. Linhas pretas são o melhor ajuste resultante do modelo Hertz esférica e são rotulados com os seus correspondentes calculados Young moduli. (B, C) Representante un-interpretável curvas força-deslocamento. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Elastographs Representante coletados de solução salina (A) e tratados com bleomicina (B) do mouse parênquima pulmonar. As barras coloridas indicam módulo de cisalhamento em kilopascals. Rótulos dos eixos indicam escala espacial em micrômetros. Barra de escala: 20 mM

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Não há conflitos de interesse declarados.

Caracterização mecânica de tecido pulmonar usando microindentation AFM oferece resolução espacial sem precedentes (Fig. 4), proporcionando uma perspectiva única sobre as variações microescala na rigidez do tecido. Como exemplo de sua utilidade, anterior macro-escala medidas em tiras de tecido normal e fibrótica pulmonar indicaram um aumento de 2 a 3 vezes aproximado em elastância com fibrose 11,12. Em contraste, microindentation AFM revela que enrijecimento dos tecidos é extremamente localizada, com algumas regiões apresentando até ~ aumenta 30 vezes no módulo de cisalhamento acima da média observada no tecido pulmonar normal 10. Como a rigidez da matriz é agora conhecido por influenciam criticamente a função das células, estas medições locais fornecem parâmetros de valor inestimável para melhorar a biofidelity de estudo de cultura celular de células do pulmão. Várias questões práticas surgem com o uso de finas tiras de tecido pulmonar. As superfícies das tiras não são perfeitamente planas, como o perfil do tecido segue a arquitetura dos alvéolos subjacentes. O sistema ajusta automaticamente a posição AFM ponta na direção Z, durante o recuo quando a amostra variação da altura da superfície é menor do que 15 mícrons para ajudar a superar este desafio. As medições são feitas em temperatura ambiente, e não 37 ° C, por isso os desvios nas propriedades mecânicas causadas por essa variação de temperatura não pode ser avaliado, ainda que seria esperado a ser menor. A influência da arquitetura da parede alveolar subjacente sobre observado propriedades mecânicas é difícil determinar com a configuração atual microscopia de luz. Por exemplo, seria desejável para determinar se as paredes alveolares apresentam anisotropia e diferentes propriedades mecânicas quando recuado em direções alinhadas com ou transversal ao plano da parede. No entanto, os espécimes atuais são grossas e do sistema de imagem não tem capacidades 3D, portanto, não é possível determinar a orientação da parede alveolar locais em cada ponto de contato. Finalmente, a influência de constituintes celulares na medida propriedades mecânicas continua a ser totalmente elucidado. Nos métodos detalhados aqui, não são feitos esforços para remover especificamente constituintes celulares do tecido. No entanto, as células presentes na superfície disponível para o recuo é pouco provável que seja viável, dado o tempo decorrido desde a colheita de tecidos e da necessidade de cortar o tecido para ter acesso aos alvéolos. Experimentos específicos para remover as células, ou matrizes de repovoar com células viáveis, e avaliar as alterações resultantes da rigidez do tecido parece garantido. Porque o tecido unfixed fresca é necessária para estas medições, o tempo decorrido desde a colheita de tecidos para a medição deve ser minimizado e as amostras devem ser armazenadas a 4 ° C para evitar alterações nas propriedades mecânicas. Atenção especial deve ser dada sempre que tiras de tecido são transferidos entre recipientes durante a lavagem ou coloração de modo que um mínimo de distorção ou dano é gerado. AFM para aplicação no estado líquido, é um passo crucial para cortar o tecido o mais plano possível e imobilizar a amostra sobre a lamínula de apoio. Se disponível, uma máquina automática de corte tal como um cortador de tecidos vibratome ou pode ser usado para cortar fatias de espessura altamente uniforme. É importante anexar tiras de tecido imediatamente antes das medidas AFM e minimizar o tempo decorrido para medições AFM como a amostra acabará por retirar do lamínulas. Uma observação útil é que tiras maiores parecem atribuir mais estável para cobrir escorrega e permanecer no local por períodos mais longos do que em PBS tiras menores. Microindentation AFM pode caracterizar amostras que abrangem uma ampla gama de 100 Pa a 50 kPa (módulo de cisalhamento) ao usar um padrão de 0,06 N / m cantilever com uma ponta de 5 mm de diâmetro esférico. Esse intervalo pode ser expandida usando sondas com constantes primavera diferente; sondas AFM com pontas de vidro esférico variando 0,6-12 m de diâmetro e primavera constantes variando de 0,01 e 0,58 N / m estão comercialmente disponíveis (por exemplo, Novascan) e comumente utilizado 3. Com uma ponta esférica 5 mm, a área de contato entre a ponta teórica e tecido é de cerca de 5-9 mM 2 para o recuo 400-700 nm (Fig. 1A). Dicas menores ou maiores podem ser usados ​​para fornecer escalas menores ou maiores de resolução espacial. Dicas piramidal também têm sido utilizados na AFM microindentation 13-16, fornecendo áreas menores contato e assim aumentar a resolução espacial no mapeamento, embora ajuste dos dados é mais complexo para esta geometria da ponta. Várias limitações para este método deve ser observado. O pulmão tem sido tradicionalmente caracterizada mecanicamente não-invasiva, por exemplo, usando análise de pressão-volume 17 ou soco recuo de toda pulmões 19,20. Métodos invasivos, como a descrita aqui alterar a arquitetura pulmonar em aspectos importantes, devido à perda da int ar-líquidoerface que normalmente existe no pulmão cheio de ar ea perda de pré-esforço que mantém a inflação pulmonar parcial sobre o relaxamento dos músculos respiratórios. Estas limitações são comuns a todas as medições feitas em tiras de tecido pulmonar 18. Notavelmente, entretanto, a rigidez média medida no parênquima do tecido pulmonar normal (módulo de cisalhamento ~ 0,5 kPa) não diferem substancialmente das estimativas com base no soco recuo de pulmões intactos em volumes descansando 19,20. Enquanto o tecido pulmonar é conhecido por apresentar não-linear com rigidez a deformação crescente, não é possível testar de forma rigorosa se esta propriedade persistir até a escala micro, com os métodos empregados aqui. O modelo de Hertz assume homogeneidade da amostra. No entanto, a maioria dos materiais biológicos, incluindo parênquima pulmonar, são cada vez mais heterogénea a diminuir escalas espaciais. Heterogeneidade da amostra pode resultar em artefatos como variação do módulo de Young, dependendo da profundidade de indentação, ou seja, dependendo da camada ou componente que está deformando. A heterogeneidade no plano xy pode ser limitada por escolher cuidadosamente o tamanho da ponta esférica apropriado, dependendo da microestrutura do biomaterial, tal como proposto por Dimitriadis EK et al. 8 É muito mais difícil de prever ou corrigir o erro do modelo Hertz devido ao material heterogeneidade na direção z. Azeloglu et al. propôs recentemente um modelo híbrido computacional para caracterizar as propriedades elásticas do substrato heterogêneo com discreta inclusões embutidos 21. A nova técnica fornece um meio potencial para calcular propriedades inclusão de materiais heterogêneos superar as limitações da análise hertzianas. O modelo de Hertz também assume comportamento elástico absoluto, enquanto que materiais biológicos normalmente exibem comportamentos dependentes do tempo viscoelástico. A caracterização viscoelástica cheio de tecido pode ser obtida através da variação da velocidade de recuo usadas. Importante, testes de macro-escala anterior mecânicas do tecido pulmonar normal e fibrótico demonstra a dependência fraca frequência das propriedades mecânicas do tecido pulmonar e preservação das diferenças entre as propriedades do tecido normal e fibrótica mecânica em todas as freqüências testadas 11. Estas descobertas sugerem fortemente que a medição de propriedades mecânicas utilizando uma velocidade única, com recuo AFM capta um aspecto essencial das mudanças nas propriedades mecânicas do tecido que acompanham fibrose. O coeficiente de Poisson de 0,4 para tecido pulmonar utilizado neste trabalho é de uma medida macroscópica 9. Infelizmente, o coeficiente de Poisson em micro-escala e as alterações sob condição da doença não estão disponíveis na literatura. Como alternativas para E, E / (1-υ 2) ou (1-υ 2) / πE (indicado a constante elástica k) 22 pode ser calculado a partir microindentation AFM e relatados quando o coeficiente de Poisson é desconhecida. Para a maioria dos biomateriais coeficiente de Poisson está na faixa de 0,4-0,5 devido ao seu alto teor de água. Dentro da faixa de 0,3-0,5, o fator 1 / (1-υ 2) varia apenas 1,10-1,33, de modo que variações razoáveis ​​em relação ao de Poisson exercem apenas efeitos modestos sobre o módulo relatados. O aumento no módulo de cisalhamento que relatório para relação tecido fibrótico ao tecido normal é várias vezes em magnitude, o que implica que os erros associados a variações no coeficiente de Poisson são relativos menores para as mudanças nas propriedades mecânicas observadas. O algoritmo de reais e código que pode ser utilizado para a análise da força-deslocamento de dados está sujeito à condição de aplicação específica e as características subseqüentes das diversas populações de força-deslocamento curvas. Se uma análise mais sofisticada é de interesse, pode-se consultar o trabalho de Lin et al. 23. Os autores compilaram uma série de estratégias sinérgicas em um algoritmo que supera muitas das complicações que já impedido os esforços para automatizar a montagem de modelos de dados Hertz recuo. Várias outras áreas estão disponíveis para desenvolvimento e exploração deste método. Nos casos em que alguém está interessado em visualizar as paredes alveolares sem rotulagem de anticorpos, ambos elastina e colágeno pode ser visualizado a partir de seu sinal autofluorescent no espectro verde. Por outro lado, uma melhor imagem, usando cortes mais finos tecidos, técnicas de imagem 3D, ou ambos, poderão aumentar a capacidade de correlacionar arquitetura do tecido subjacente com propriedades mecânicas. Embora os métodos atuais permitem coloração e visualização de componentes da matriz extracelular, como colágeno e laminina, esforços adicionais poderiam ser destinadas a coloração marcadores de superfície celular para identificar populações de células específicas e de caracterizar o microambiente mecânica nas proximidades dessas populações. Alternatively, o tecido poderia ser colhida a partir de camundongos expressando-fluorescente etiquetados marcadores de linhagem de células ou proteínas específicas para perseguir o mesmo objetivo. Finalmente, o método detalhado aqui aparece bem colocada para caracterizar outras características anatômicas do pulmão, tais como vasos que remodelar na hipertensão, e das vias aéreas que remodelar na asma. Com base em seu estado atual de desenvolvimento e potencial para reforçar ainda mais, microindentation AFM aparece pronta para produzir insights valiosos sobre as mudanças na rigidez do tecido que acompanham a progressão da doença no pulmão, e será sem dúvida de valor na caracterização de alterações espaciais e temporais na rigidez de uma variedade de outros tecidos moles.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> AFM ponta </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 micron borosilicato talão, 0,06 N / m </td></tr><tr><td> Poli-L-Lisina lamínulas </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 milímetros rodada No.1 de vidro </td></tr><tr><td> Agarose, Temperatura Gelificação Baixo </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Coelho anti-colágeno I (Rb PAB) de anticorpos </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 cabra anticorpo anti-coelho </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> Coelho anti-laminina </td><td> Sigma </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mecânica caracterização do tecido pulmonar usando microscopia de força atômica

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Rigidez da matriz influencia fortemente o crescimento, diferenciação e função de células aderentes 1-3. Na escala macro a rigidez dos tecidos e órgãos dentro do corpo humano vão várias ordens de magnitude 4. Muito menos se sabe sobre como a rigidez varia espacialmente dentro dos tecidos, e que o escopo ea escala espacial de mudanças nos processos de rigidez são doenças que resultam na remodelação do tecido. Para entender melhor como as mudanças na matriz de rigidez contribuem para a fisiologia celular na saúde e na doença, a medida da rigidez do tecido obtido em uma escala espaciais relevantes para células residentes são necessários. Isto é particularmente verdadeiro para o pulmão, um tecido altamente compatível e elástica em que a remodelação da matriz é uma característica proeminente em doenças como asma, enfisema, hipertensão e fibrose. Para caracterizar o ambiente local mecânica do parênquima pulmonar em uma escala espaciais relevantes para células residentes, temos desenvolvido métodos para medir diretamente as propriedades locais elástica do tecido pulmonar fresco murino usando microscopia de força atômica microindentation (AFM). Com a escolha adequada de AFM indentor, cantilever, e profundidade de indentação, estes métodos permitem medições do módulo de cisalhamento locais tecido em paralelo com contraste de fase e imagens de fluorescência da região de interesse. Amostragem sistemática de tiras de tecido fornece mapas das propriedades mecânicas dos tecidos que revelam locais variações espaciais no módulo de cisalhamento. Correlações entre propriedades mecânicas e características anatômicas subjacentes e patológicos ilustrar como a rigidez varia de acordo com deposição de matriz na fibrose. Estes métodos podem ser alargada a outros tecidos moles e processos da doença para revelar como as propriedades mecânicas dos tecidos locais variam no espaço e progressão da doença.

A rigidez da matriz extracelular influencia fortemente os comportamentos múltiplo de células aderentes. Rigidez da matriz varia espacialmente ao longo de um tecido, e sofre modificação nas condições de várias doenças. Aqui nós desenvolvemos métodos para caracterizar as variações espaciais na rigidez do tecido normal e pulmão fibrótico do mouse usando microindentation microscopia de força atômica.

Micro-Mecânica Caracterização do tecido pulmonar Usando Microscopia de Força Atômica

A rigidez da matriz influencia fortemente o crescimento, a diferenciação e a função de células aderentes1-3. Em escala macroscópica, a rigidez de tecidos e órgãos...

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar o ambiente mecânico local do parênquima pulmonar em uma escala espacial relevante para as células residentes, mediante a medição direta das propriedades elásticas locais de tecido pulmonar fresco espelhado utilizando microindentação por microscopia de força atômica. Isso é alcançado cortando o tecido pulmonar de camundongo inflado com agarro com lâmina de barbear ou bisturi, para preparar tiras de parênquima pulmonar de cinco por cinco milímetros de comprimento e largura, e 400 micrômetros de espessura. Em seguida, tiras de tecido pulmonar não fixadas e não permeabilizadas são imunomarcadas, o que identifica áreas de interesse para a microindentação por MF.Em seguida, é realizada uma microindentação por FM em tiras de tecido em PBS à temperatura ambiente. Para medir diretamente as propriedades elásticas locais do tecido pulmonar fresco, são obtidos resultados. Esses resultados mostram diferenças acentuadas na amplitude e distribuição da rigidez tecidual no parênquima pulmonar normal e fibrotizado, além de grandes variações espaciais na rigidez, particularmente dentro da amostra de pulmão fibrotizado.Com base em mapas de rigidez extraídos de curvas de deslocamento forçado obtidas por meio de microindentação com microscópio de força. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o estiramento de tiras de tecido, é que ela oferece uma resolução espacial sem precedentes, proporcionando uma perspectiva única sobre as variações em escala microscópica da rigidez tecidual. Essa medida pode ajudar a responder perguntas fundamentais, como a forma como a rigidez varia espacialmente dentro do tecido e qual a extensão e a escala espacial das alterações de rigidez na doença.Processos que resultam na remodelação tecidual Para preparar tiras de tecido pulmonar, comece estabilizando a estrutura pulmonar para o corte, insuflando pulmões isolados de camundongo. Intratraquealmente com 50 mililitros por quilograma de peso corporal de agarose morna a 2%, de baixo ponto de gelificação, preparada em PBS, amarre a traqueia e resfrie os pulmões insuflados em um banho de PBS a quatro graus Celsius por 60 minutos. A agarose gelificará e endurecerá nos espaços aéreos, estabilizando suavemente a estrutura pulmonar. Durante este intervalo, utilizando uma lâmina ou bisturi, corte o tecido pulmonar de camundongo estabilizado com agarose em tiras de aproximadamente cinco por cinco milímetros de comprimento e largura, e 400 micrômetros de espessura.Em seguida, lave as tiras em PBS a 37 graus Celsius por cinco minutos para remover resíduos de aros, a fim de excluir vias aéreas e vasos grandes. Corte tiras das regiões subpleurais distantes dos brônquios principais se as vias aéreas e vasos grandes devem ser visualizados; corte tiras do tecido pulmonar mais próximo dos brônquios principais para isolar áreas de interesse para microindentação por MF. Visualize o tecido por microscopia de contraste de fase ou imunomarcação e visualize por microscopia de fluorescência.Consulte a parte escrita deste protocolo para o procedimento. Imediatamente antes de uma caracterização por FM, fixe as tiras de tecido em lamínulas de 15 milímetros revestidas com poli-L-lisina elevando a lamínula a partir de baixo do tecido flutuante, certificando-se de que a tira de tecido se espalhe uniformemente sobre a superfície da lamínula. Se necessário, coloque a tira entre uma segunda lamínula limpa e não revestida e aplique pressão suave para auxiliar na adesão do tecido à lamínula revestida com poli-L-lisina.Calibre o sistema de FM-A seguindo as instruções do fabricante imediatamente antes de cada rodada de experimentos de microindentação. Para isso, determine dois parâmetros críticos: a constante elástica da alavanca, utilizando o método de flutuação térmica no ar, e a sensibilidade de deflexão da alavanca, que é um parâmetro usado para converter o sinal de saída do fotodiodo na distância real de deflexão da alavanca.Calibre a sensibilidade de deflexão obtendo uma curva padrão de deslocamento forçado em PBS sobre uma lâmina de vidro limpa. Em seguida, calcule a inclinação da curva de deslocamento forçado na medição da curva de deslocamento forçado. A ponta de FM é estendida e retratada em relação à superfície da amostra em uma única localização, com a deflexão da alavanca delta D monitorada como função do deslocamento da ponta delta Z. Recomenda-se o uso de uma alavanca triangular de nitreto de silício com uma ponta esférica de borossilicato de cinco micrômetros de diâmetro, utilizando sondas de FM com uma constante elástica de 0,06 newtons por metro.Caracterizamos mecanicamente materiais moles com módulo de cisalhamento variando de 100 a 50.000 pascals. Limpe a superfície inferior da lamínula da amostra com papel de tecido, em seguida fixe-a a uma lâmina de vidro comum usando graxa de vácuo. Monte a lâmina de vidro no estágio da amostra do microscópio de força atômica (AFM) e cubra o papel de tecido com 500 microlitros de PBS à temperatura ambiente.Em seguida, posicione a cabeça de varredura de FM sobre a amostra. Ajuste o estágio da amostra do microscópio para configurar o microscópio para visualização pela ocular, alinhando a ponta de FM no centro do campo de visão. Mova o estágio da amostra de FM para escolher uma área de interesse no tecido.Em seguida, mude para a visualização com câmera CCD para registrar imagens de contraste de fase e/ou imagens de fluorescência do tecido conforme desejado. Mova lentamente a ponta do AFM para baixo até que entre em contato preciso com a amostra. A caracterização por microindentação com AFM de amostras macias exige pequenas profundidades de indentação para evitar grandes deformações locais, o que inviabiliza o modelo de Hertz utilizado para o cálculo do módulo elástico; para evitar grandes deformações, realize a indentação no modo de disparo (trigger) ajustando a deflexão máxima da alavanca a 500 nanômetros.Este limite de deflexão restringirá a força máxima de indentação a menos de 30 nano newtons. A velocidade de indentação deve ser selecionada suficientemente lenta para explorar as propriedades elásticas em vez das propriedades viscoelásticas da amostra macia. Selecione uma faixa de velocidade de dois a 20 micrômetros por segundo para tecido pulmonar em uma única medição a partir de uma área de interesse.Mova a sonda A FM até a localização de interesse e realize uma única indentação para coletar uma curva padrão de força-deslocamento. A sonda se moverá apenas na direção Z. Para mapeamento automatizado de uma região de interesse, mude para o modo de mapa de força, selecione o tamanho da varredura e os pontos de amostragem dentro da área selecionada.A ponta de FM varre a superfície da amostra entre os movimentos de indentação e coleta curvas individuais de força versus deslocamento em cada ponto de uma grade definida de amostra. Achamos prático usar uma grade de amostra de 16 por 16 para mapear uma área de 80 micrômetros por 80 micrômetros com uma velocidade de indentação de 20 micrômetros por segundo, o que pode ser concluído em cerca de 10 minutos. Para calcular o módulo de Young, ajuste a curva de força versus deslocamento ao modelo de indentação esférica de Hertz usando o método de ajuste não linear de mínimos quadrados, conforme mostrado aqui, onde F é igual a K sub C vezes delta D, sendo a força necessária para flexionar a alavanca.K sub C é a constante elástica da alavanca. R é o raio da ponta esférica, delta igual a delta Z menos delta D é a indentação, e ν é a razão de Poisson da amostra, que equivale a 0,4 para tecido pulmonar. Para avaliar a qualidade do ajuste, calcule o valor SSR ou a soma dos quadrados da diferença entre os dados e os valores ajustados durante o ajuste não linear da curva.Elimine medições pouco confiáveis ou não interpretáveis descartando dados de curvas ruins com valores elevados de SSR. Se desejado, converta o módulo elástico ou E em módulo de cisalhamento G, utilizando a relação E igual a duas vezes a soma de um mais ν vezes G. Para visualizar os padrões espaciais de rigidez coletados no modo de mapa de força, plote os dados do módulo e mapas de contorno, por exemplo, em uma grade 16 por 16 que cubra uma área de 80 micrômetros por 80 micrômetros.Para processar uma grande quantidade de dados de curvas de força, pode-se escrever um algoritmo personalizado para ajustar automaticamente as curvas de força versus deslocamento, extrair módulos e/ou plotar mapas de contorno ou enxertos ELA. Usando os mesmos procedimentos e parâmetros descritos acima, esta figura mostra que o tecido foi corretamente cortado e corado. A microestrutura alveolar do parênquima pulmonar está bem preservada, conforme observado por coloração de imunofluorescência para o componente da membrana basal, laminina, sem fixação ou permeabilização.Estes painéis mostram a coloração por imunofluorescência para colágeno, uma em pulmões frescos não fixados obtidos de camundongos previamente tratados com PBS ou com bleomicina para induzir fibrose. Gráficos de força-deslocamento obtidos a partir de uma microindentação por FM são mostrados aqui com a mesma força aplicada. A ponteira de FM gera uma grande indentação em uma região macia, resultando em uma curva de força-deslocamento relativamente plana, mostrada em azul, versus uma pequena indentação e uma curva de força-deslocamento acentuada para uma região mais rígida, mostrada em vermelho.Para obter curvas de força limpas após cada indentação, a ponta do microscópio de força atômica (AFM) precisa ser recolhida completamente da superfície da amostra e ficar livre de contato antes da próxima indentação. Esse estado sem contato corresponde à região plana da curva, onde a ponta se desloca sem deflexão do cantiléver. Esta figura mostra uma curva típica incorreta, sem uma região plana, que ocorre quando a ponta não é completamente recolhida da superfície da amostra, como no caso em que uma amostra mole adere à ponta, tornando impossível determinar o ponto de contato se a ponta ficar completamente presa na amostra mole.A curva pode parecer assim, sem desvio claro, mas com pequeno ruído. Esta figura mostra a rigidez. Os dados extraídos de curvas de deslocamento forçado exibidos espacialmente como mapas de rigidez referem-se ao enxerto de ELAs, onde a escala de cores varia conforme a rigidez. Os enxertos de ELAs demonstram diferenças acentuadas na amplitude e distribuição da rigidez tecidual no parênquima pulmonar normal e fibrotico, além de grandes variações espaciais na rigidez, particularmente dentro da amostra pulmonar fibrotica.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como caracterizar o ambiente mecânico local do parênquima pulmonar mediante a medição direta das propriedades elásticas locais de tecido pulmonar fresco utilizando microscopia de força atômica.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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