Micro-Mecânica Caracterização do tecido pulmonar Usando Microscopia de Força Atômica

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar o ambiente mecânico local do parênquima pulmonar em uma escala espacial relevante para as células residentes, medindo diretamente as propriedades elásticas locais do tecido pulmonar espelhado fresco usando microscopia de força atômica micro recuo. Isso é conseguido cortando o tecido pulmonar de camundongo inflado com uma lâmina de barbear ou bisturi para preparar tiras de parênquima pulmonar de cinco por cinco milímetros de comprimento e largura e 400 micrômetros de espessura. Em seguida, as tiras de tecido pulmonar un perme não fixadas são imunocorantes, que identificam áreas de interesse para um micro recuo FM.

Em seguida, uma micro indentação FM é realizada em tiras de tecido em PBS à temperatura ambiente. Para medir diretamente as propriedades elásticas locais do tecido pulmonar fresco, os resultados são obtidos. Isso mostra diferenças marcantes na amplitude e distribuição da rigidez tecidual no parênquima pulmonar normal e fibrótico e grandes variações espaciais na rigidez, particularmente dentro da amostra de pulmão fibrótico.

Com base em mapas de rigidez extraídos de curvas de deslocamento forçado obtidas usando um micro recuo FM. A principal vantagem dessa técnica sobre as medidas existentes, como o alongamento de tiras de tecido, é que ela oferece uma resolução espacial sem precedentes, fornecendo uma perspectiva única sobre a variação em microescala na rigidez do tecido. Essa medida pode ajudar a responder a questões-chave, como como a rigidez varia espacialmente dentro do tecido e qual é o escopo e a escala espacial das mudanças de rigidez na doença.

Processos que resultam na remodelação do tecido Para preparar tiras de tecido pulmonar, comece estabilizando a estrutura pulmonar para corte, inflando pulmões isolados de camundongos. Por via intratraqueal com 50 mililitros por quilograma de peso corporal de aros quentes e de baixo ponto de gel a 2% preparados em PBS, amarre a traqueia e resfrie os pulmões inflados em um banho de PBS a quatro graus Celsius por 60 minutos. O aros irá gelificar e endurecer nos espaços aéreos para estabilizar suavemente a estrutura pulmonar Durante este intervalo, usando uma navalha ou bisturi, corte o tecido pulmonar de camundongo estabilizado com aros em tiras de aproximadamente cinco por cinco milímetros de comprimento e largura e 400 micrômetros de espessura.

Em seguida, lave as tiras em PBS a 37 graus Celsius por cinco minutos para remover os aros residuais para excluir grandes vias aéreas e vasos. Corte tiras de regiões subpleurais distantes dos brônquios da haste principal se as vias aéreas em grandes vasos forem visualizadas Corte as tiras do tecido pulmonar mais proximal aos brônquios da haste principal para isolar áreas de interesse para uma micro indentação FM. Visualize o tecido por microscopia de contraste facial ou imunocoloração e visualize por microscopia de fluorescência.

Consulte a parte escrita deste protocolo para o procedimento. Imediatamente antes de uma caracterização FM, prenda as tiras de tecido em lamínulas de 15 milímetros revestidas com poli L lisina, levantando a lamínula abaixo do tecido flutuante, certificando-se de que a tira de tecido se espalhe uniformemente na superfície da lamínula. Se necessário, coloque a tira em sanduíche com uma segunda lamínula limpa e não revestida e aplique uma leve pressão para ajudar na fixação do tecido à lamínula revestida com poli L lisina.

Calibre o sistema A FM seguindo as instruções do fabricante imediatamente antes de cada rodada de experimentos de micro indentação. Para isso, determine dois parâmetros críticos. A constante da mola do cantilever usando o método de flutuação térmica no ar e a sensibilidade à deflexão do cantilever, que é um parâmetro usado para dimensionar o sinal de saída do fotodiodo para a distância real de deflexão do cantilever.

Calibre a sensibilidade à deflexão obtendo uma curva de deslocamento forçado padrão em PBS em uma lâmina de vidro limpa. Em seguida, calcule a inclinação da curva de deslocamento forçado na medição da curva de deslocamento forçado. A ponta A FM é estendida e retraída da superfície da amostra em um único local com a deflexão do cantilever delta D monitorada em função do deslocamento da ponta delta Z.It recomenda-se o uso de um cantilever triangular de nitreto de silício com uma ponta esférica de silicato bo de cinco micrômetros de diâmetro usando sondas FM com uma constante de mola de 0,06 newton por metro.

Caracterizamos mecanicamente materiais macios com modulação pura abrangendo de 100 a 50.000 pascais. Limpe a superfície inferior da lamínula de cobertura da amostra com papel de seda e, em seguida, prenda-a a uma lâmina de vidro padrão com graxa a vácuo. Monte a lâmina de vidro no estágio de amostra A FM e cubra o tecido com 500 microlitros de PBS em temperatura ambiente.

Em seguida, coloque uma cabeça de varredura FM sobre a amostra. Ajuste o microscópio sample stage para definir o microscópio para ocular viewpara alinhar a ponta A FM no centro do campo de view. Mova o estágio de amostra A FM para escolher uma área de interesse no tecido.

Em seguida, mude para a visualização da câmera CCD para gravar imagens de contraste de fase e/ou imagens de fluorescência do tecido, conforme desejado. Mova a ponta A FM lentamente para baixo até que esteja em contato com o sample preciso. Uma caracterização de micro indentação FM de amostras moles requer pequenas profundidades de indentação para evitar grandes deformações locais, que invalidam o modelo hertz usado para cálculo do módulo de elasticidade para evitar grandes deformações, realizar recuo no modo de disparo definindo a deflexão máxima do cantilever para 500 nanômetros.

Este limite de deflexão restringirá a força máxima de indentação a menos de 30 nano newtons. A velocidade de indentação deve ser selecionada para ser suficientemente lenta para explorar as propriedades elásticas em vez de viscoelásticas da amostra mole. Selecione uma faixa de velocidade de dois a 20 micrômetros por segundo para o tecido pulmonar para uma única medição de uma área de interesse.

Mova a sonda A FM para o local de interesse e execute um único recuo para coletar uma curva de deslocamento de força padrão. A sonda se moverá apenas na direção Z. Para mapeamento automatizado de uma região de interesse, alterne para o modo de mapa forçado, selecione o tamanho da varredura e os pontos de amostragem dentro da área selecionada.

O A FM inclina os RAs na superfície da amostra entre os movimentos de indentação e coleta curvas individuais de deslocamento forçado em cada ponto dentro de uma grade de amostra definida pela inde. Achamos prático usar uma grade de amostra de 16 por 16 para mapear uma área de 80 micrômetros por 80 micrômetros a uma velocidade de indentação de 20 micrômetros por segundo, que pode ser concluída em cerca de 10 minutos. Para calcular o módulo de Young, ajuste a curva de deslocamento de força ao modelo de recuo esférico de hertz usando o ajuste de curva não linear do quadrado de Lee, como mostrado aqui, onde F é igual a K sub C vezes delta, D é a força para dobrar o cantilever.

K sub C é a constante da mola do cantilever. R é o raio da ponta da esfera, delta é igual a delta Z menos delta D é recuo e novo é a razão de poisson das amostras, que é igual a 0,4 para o tecido pulmonar. Para avaliar a qualidade do ajuste, calcule o valor SSR ou a soma dos quadrados da diferença entre os dados e os valores de ajuste durante o ajuste de curva não linear.

Elimine medições não confiáveis ou não interpretáveis descartando dados de curvas ruins com grandes valores de SSR. Se desejar, converta o módulo de elasticidade ou E em módulo de totalidade. G. Usando a relação E igual a duas vezes a soma de um mais novos tempos G.To visualizar padrões espaciais de rigidez coletados no modo de mapa de força, traçar dados de módulo e mapas de contorno, por exemplo, em uma grade de 16 por 16 cobrindo uma área de 80 micrômetros por 80 micrômetros.

Para processar uma grande quantidade de dados de curva de força, um algoritmo personalizado pode ser escrito para ajustar automaticamente as curvas de deslocamento de força, extrair mapas de contorno modulares e/ou plotar ou enxerto de ELA. Usando os mesmos procedimentos e parâmetros que acabamos de descrever, esta figura mostra que estou cortando e manchando o tecido corretamente. O micro alveolar do parênquima pulmonar está bem preservado, como observado pela coloração imunofluorescente para o componente da membrana basal, laminina sem fixação ou permeação.

Esses painéis mostram coloração imunofluorescente para colágeno, uma em pulmões frescos não fixados colhidos de camundongos previamente tratados com PBS ou tratados com micina blio para induzir fibrose. Os gráficos de deslocamento da força amostral obtidos a partir de uma microindentação FM são mostrados aqui com a mesma força aplicada. A ponta A FM gera um grande recuo em uma região macia, resultando em uma curva de deslocamento de força relativamente plana mostrada em azul versus um pequeno recuo e uma curva de deslocamento de força acentuada para uma região mais rígida mostrada em vermelho.

Para obter curvas de força limpas após cada recuo, a ponta A FM precisa ser completamente retraída da superfície da amostra e livre de contato antes do próximo recuo. Este estado livre de contato corresponde à região plana da curva onde a ponta translada sem deflexão em balanço. Esta figura mostra uma curva falsa típica sem uma região plana, que ocorre quando a ponta não está completamente retraída da superfície da amostra, como quando a amostra macia se prende à ponta, tornando impossível determinar o ponto de contato se a ponta estiver completamente presa na amostra macia.

A curva pode ficar assim sem deflexão clara, mas com pouco ruído. Esta figura mostra rigidez. Os dados extraídos das curvas de deslocamento forçado foram exibidos espacialmente como mapas de rigidez chamados de enxerto de ELAs, onde as escalas de cores com enxerto de ELAs de rigidez demonstram diferenças marcantes na faixa e distribuição da rigidez do tecido no parênquima pulmonar normal e fibrótico e grandes variações espaciais na rigidez, particularmente dentro da amostra de pulmão fibrótico.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como caracterizar o ambiente mecânico local do parênquima pulmonar medindo diretamente as propriedades elásticas locais do tecido pulmonar fresco usando a cópia microscópica da Força Atômica.