Name: Sub-nanômetros de imagem resolução com Amplitude modulação Microscopia de Força Atômica no líquido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a obter imagens de alta resolução sub-nanométrica em líquido usando microscopia de força atômica com modulação de amplitude. Este método otimiza parâmetros para microscópios AFM comerciais sem equipamento especializado.

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Financiamento da Engenharia e Ciências Físicas Research Council (subvenções 1.452.230 e EP / M023915 / 1), a Biotecnologia e Biological Science Research Council (concessão de BB / M024830 / 1) e do Conselho Europeu (FP7 CIG 631.186) são reconhecido agradecimento.

1. Limpeza das Ferramentas e outras superfícies NOTA: Quando o seu objectivo em alta resolução, qualquer forma de contaminação pode ter consequências prejudiciais. É portanto necessário assegurar que todas as ferramentas usadas para manipular a amostra, substrato ou AFM dicas são cuidadosamente limpos. O que se segue aplica-se a qualquer superfície ou instrumento (por exemplo, uma pinça) que pode entrar em contacto com a amostra, cantilever, ou célula de AFM, incluindo a própria fase da amostra. <ol><li> Banho-sonicar os instrumentos em água ultrapura (18,2 mohms, &lt;5 ppm orgânicos), seguido de isopropanol (99,7% de pureza), seguido de água ultrapura novamente, cada um durante 10 min. Quando possível, use isopropanol sob um exaustor para reduzir a inalação de fumos. </li><li> Seca-se sob um fluxo de azoto. </li><li> Se imersão completa não é possível (por exemplo, para o suporte cantilever / eletrônica), fisicamente limpa a superfície, limpando com single-ply, tecidos low-lint (tecidos leves limpadores) embebido em ultrapure água, isopropanol e água ultrapura, sequencialmente. Permitir que a superfície a secar ao ar (usualmente dentro de 15 a 30 min). </li></ol> 2. Preparação do Substrato NOTA: O substrato designa a superfície sólida apoiar directamente as amostras, normalmente em contato físico com ambos o scanner AFM ea amostra. A maioria das AFM tem um suporte magnético e discos de aço pode ser utilizado, mas o mesmo protocolo é também adequado para substratos, tais como lâminas de vidro. Aqui assumimos um disco de aço no qual um disco mica está afixada. O objetivo deste procedimento é a de limitar, tanto quanto possíveis fontes de contaminação que podem afetar a imagem. Luvas deve ser usado em todos os momentos. <ol><li> Banho-sonicar o disco de amostra de aço em água ultrapura (18,2 mohms), seguido de isopropanol, e finalmente por água ultrapura novamente, cada um durante 10 min. </li><li> Secam-se os discos sob um fluxo de azoto. </li><li> Prepare uma pequena quantidade de cola epóxi com reagentes misturados completamente e lugar ~ 1081; l no disco de aço. </li><li> Apor o substrato (mica moscovite, SiO2 cristal, vidro, etc.) para o disco de aço através da aplicação de pressão sobre o substrato. Permitir que o epoxi curar durante várias horas a uma temperatura elevada (ver as especificações do fabricante). </li><li> Assegure-se que não epoxi está directamente exposta ao ar, em torno das bordas do substrato. Isso acontecerá se quantidade excessiva de epóxi é usado e pode se tornar uma fonte de contaminação. <ol><li> Para um substrato de mica, pressione firmemente ~ fita adesiva com 2,5 cm de largura sobre o substrato, de modo que todo o rosto está coberto, e suavemente retire-a. Use fita ligeiramente adesiva, e descascar a mica puxando paralela à superfície. O material removido é visível na fita. Repetir este processo 2-3 vezes, até que a mica é espelho-lisa para o olho. </li><li> Para o vidro / SiO 2, se uma nova alteração químicos de superfície é necessário, repita a rotina do banho-sonicação de passos 2.1-2.2. Em alternativa, usar Lunidade de exposição V (18 W lâmpadas UV-C germicida) para 30-60 min, dependendo da potência) para pirolizar quaisquer compostos orgânicos que podem ser deixados na superfície. Este procedimento também torna a superfície mais hidrofílica, sem aumentar de forma significativa a rugosidade. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de cantilever e Tip <ol><li> Mergulha-se o chip de cantilever num banho de isopropanol, seguido de água ultrapura, cada durante 60 min. </li><li> Se o cantilever / ponta requer limpeza extensiva (por exemplo, depois de um armazenamento prolongado na caixa gel), adicionar um 30 min de imersão em acetona (&gt; 99,5% de pureza) antes do passo 1 (ver também a contaminação seção de endereçamento). O armazenamento de dicas em caixas de gel é, em nossa experiência, um de a principal fonte de contaminação que pode ocorrer muito rapidamente 59. </li><li> Expor a ponta ao UV luz brevemente (&lt;5 minutos), a fim de favorecer a formação de sítios de hidratação 60 estáveis. Evitar tempos de superexposição mais longos, uma vez que podem danificar a ponta ou incRease o seu raio de curvatura. </li><li> Inserir o braço de suporte para o suporte em consola da AFM e pipeta ~ 50 ul de solução de imagem (a natureza da solução dependerá da amostra a ser investigada, mas, neste caso, usar uma solução de 10 mM de cloreto de rubídio em água ultrapura) para o braço de suporte e ponta de pré-wet-lo; isso vai limitar o aparecimento de bolhas de ar quando se aproxima da amostra. </li></ol> 4. Set-up da AFM celular <ol><li> Monte o disco de amostra e substrato para o palco da amostra e adicionar uma gota de líquido de imagem (líquido tipicamente 2-3 mm de espessura no seu ponto mais alto). </li><li> Conecte o suporte do cantilever com o AFM. </li><li> Traga o braço de suporte e de amostra em proximidade de modo a formar uma ponte entre os fluidos capilar sobre o braço de suporte / ponta e a amostra. </li></ol> 5. Inicializar Medição e Calibração do Cantilever <ol><li> Alinhar o laser de medição (normalmente vermelho) perto de ponta-end do cantilever. Dependendo do modelo AFM, fazê-lo quer através de controles de software ou através de ajuste manual da posição do laser. Adquirir espectro térmica do braço de suporte no estado líquido (ver Figura 1A). O processo regista as flutuações térmicas do cantilever usando o laser, a fim de encontrar a frequência de ressonância do braço de suporte principal (modo próprio fundamental). Na maioria AFM moderna, isto é feito através de procedimentos automatizados nos controlos de software, mas os detalhes podem variar a partir de AFM para AFM. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig1.jpg" /> Figura 1: Ajustamento e calibrar o cantilever. A: espectro de ruído térmico de deflexão vertical do braço de suporte (preto) com um ajuste simples oscilador harmónico (SHO) do modo próprio fundamental (vermelho). Aqui, a ressonância é de 18,7 kHz em água. Os primeiros três frequências de ressonância, que correspondem aos três primeiros modos próprios flexão são highlighted com setas azuis. B: Calibração do cantilever Inverse Optical Lever Sensibilidade. A deformação do cantilever linear pressionado contra uma superfície rígida (não deformável) é utilizado para medir o factor de conversão (InvOLS) entre a deflexão medida em volts e o valor correspondente em nanómetros. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="2"><li> Grave uma deflexão vs a curva do raio com o braço de suporte sobre um substrato rígido (por exemplo, de mica ou de vidro) e calibrar a deflexão através da imposição de que a inclinação da curva na região de deflexão linear (como mostrado na Figura 1B) é a unidade 61-63. NOTA: Este processo localiza o factor de conversão entre a deflexão medida no fotodetector (em volts) e a deformação real do braço de suporte (em nanómetros) - known como o inverso Optical Lever sensibilidade (InvOLS). A calibração pode danificar a ponta, por isso é melhor para a sua realização depois de todas as medições são concluídas. Utilizar o valor InvOLS derivado para outro braço de suporte do mesmo tipo durante uma experiência anterior para obter uma estimativa (tipicamente&gt; 90% exacta) da verdadeira amplitude antes da calibragem. </li><li> Montar o pico de ressonância no espectro térmico com um simples modelo de oscilador harmônico 64-66 para produzir o constante do cantilever primavera. Este procedimento é automatizado na maioria dos softwares AFM e, normalmente, não requer conhecimentos específicos do modelo em questão. </li><li> Sintonize o cantilever. Localizar a resposta de amplitude do cantilever quando comandado do exterior (por exemplo, acusticamente ou por excitação fototérmico) ao longo de uma gama de frequências próximas à sua frequência de ressonância nominal. Defina a frequência de condução para o próximo do máximo neste espectro, ligeiramente para a esquerda. Se o braço de suporte é Acoustically impulsionado, muitos maxima espúria pode aparecer quando tuning. <ol><li> Seleccionar um pico de ressonância tão perto quanto possível (e dentro do envelope) a ressonância identificados no espectro térmico usando o software da AFM mas especificidades de controlo pode depender do tipo e versão do software que controla a AFM. </li></ol></li></ol> 6. Abordagem e Verificação Inicial da Amostra <ol><li> Definir a amplitude de condução de modo que a amplitude de oscilação livre é de aproximadamente 5 nm. Isto corresponde tipicamente a 0,2-0,8 V na maioria dos MFAs (no caso de os InvOLS não está calibrado). Ajuste o ponto de ajuste de amplitude de ~ 80% da amplitude livre. </li><li> Defina os ganhos de realimentação relativamente elevado (o valor absoluto depende do AFM), mas garantir que nenhuma instabilidade ou zumbido ocorre. </li><li> Definir a taxa de varredura inicial e tamanho da digitalização para valores pequenos (por exemplo, a ~ 1 Hz e 10 nm, respectivamente). Isso ajuda a preservar a ponta em caso de alguns parâmetros de feedback são mal ajustadasevitando varredura ao longo de grandes distâncias. O tamanho da tela pode ser posteriormente aumentada para um valor maior (por exemplo, 100 nm) se as condições de digitalização aparecer adequado. </li><li> Determinar a altura aproximada da superfície (em alguns casos, isto deve ser feito opticamente) antes da abordagem. </li><li> Iniciar a abordagem da ponta para a superfície usando o software de controle de AFM. Os detalhes desse processo vai depender do modelo de AFM e software usado. <ol><li> Se houver problemas com a abordagem ao usar um cantilever macio, realizar a abordagem no modo de contato. Neste caso, assegurar que os ganhos são mais baixos do que no modo AM, e definir o ponto de ajuste para um valor relativamente baixo (0,1-0,2 V depois de centrar a laser sobre o fotodetector) para preservar a ponta. </li><li> Avaliar se a ponta atingiu a superfície sem começar a imagem, alterando ligeiramente o valor de ajuste (aumento no modo de contato ou diminuição no modo AM). Se a ponta está na superfície, o efeito em tele extensão do Z-piezo deve ser insignificante. Os movimentos ao vivo do Z-piezo geralmente são exibidos graficamente no software da maioria AFM controle. Se a alteração do valor nominal desencadeia um movimento visível do piezo, isso indica uma falsa envolver. Neste último caso, de re-iniciar a abordagem da posição da ponta de corrente, utilizando uma ligeiramente mais elevada (contacto) ou menor valor nominal (AM). </li></ol></li><li> Uma vez que a ponta atingiu a superfície, retraia o Z-piezo (geralmente, simplesmente pressionando &quot;Stop&quot;) e sintonizar o cantilever (repita o passo 5.4.); a frequência de ressonância provavelmente vai ter deslocado para um valor mais baixo devido às interações ponta-amostra. </li><li> Alterar o ponto de ajuste para ~ 80% da amplitude livre recém sintonizado (a esta distância ponta-sample). </li><li> Envolver o cantilever e conduzir um 10 × 10 nm 2 varredura da superfície em modo AM para verificar se os parâmetros de imagem são adequados. <ol><li> Verifique se o trace (digitalização esquerda para a direita) e refazer (direita digitalização para a esquerda)perfis sobrepor. Se não reduzir ainda mais o valor nominal e tentar aumentar o ganho. </li><li> Reduzir os ganhos se a imagem se torna barulhento. </li></ol></li><li> Repita a operação com um grande - 1 × 1 mm 2 a 5 × 5 m 2 - verificação da amostra desde que tal seja possível. Nas amostras biológicas ou macias, isto pode resultar uma contaminação da ponta. </li></ol> Imagem 7. De alta resolução <ol><li> Reduzir o tamanho da digitalização para um valor adequado para a visualização das características (por exemplo, 100 × 100 nm 2 por cristais de proteínas ou 20 × 20 nm 2 para mica ou calcita). </li><li> Reduzir a amplitude de accionamento do braço de suporte suficiente para o circuito fechado de realimentação para retrair automaticamente a Z-piezo e, consequentemente, a ponta a partir da superfície. Enquanto o braço de suporte está afastado a partir da superfície, ajustar a amplitude da unidade de modo que a amplitude do braço de suporte é ~ 1-2 nm (pico-a-pico). </li><li> Usando o software de controle de AFM, progressivamente reduzir o ponto de ajuste algumas dezenas de VM de cada vez até que o Z-piezo estende-se outra vez na direcção da superfície e a imagem original é recuperado. Manter a amplitude do valor nominal compreendido entre 75% e 95% da nova amplitude livre. </li><li> Reajustar os ganhos usando o software de controle AFM; ganhos mais elevados pode ser utilizado em amplitudes inferiores sem introduzir ruído significativo. <ol><li> Repita a 7,2-7,4 passos de forma a determinar a melhor combinação de livre amplitude, valor nominal e ganhar para alta resolução. As condições óptimas dependem da amostra (paisagem solvatação e molhantes propriedades do líquido) mas também o braço de suporte (constante de mola, rigidez). </li><li> Explorar diferentes combinações de amplitudes para optimizar as condições de imagem. Pode ser necessário para aumentar a amplitude de novo livre 42. Em tal caso, ajustar primeiro o ponto de ajuste para um valor mais alto e, em seguida, aumentar a unidade (por exemplo, procedimento inverso do que utilizado para diminuir a amplitude). </li><li> Mantenha o setpoiNT amplitude compreendida no intervalo de 0,5 nM - 1,5 nM (pico a pico) com proporções nominais mantido acima de 0,7 (tipicamente 0,75-0,95). Para interfaces solvophilic, use consolas com uma constante de 0,5 primavera - 2 N / m. Isto é suficiente para a ponta para remover a maior parte do líquido interfacial sem bater na superfície. Uma regra de ouro é proposto em eq. 4 de referência 29. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Assumindo que o líquido de imagem e a rigidez cantilever foram seleccionados adequadamente, os passos mais críticos para a realização bem sucedida de alta resolução são o ajuste da amplitude de imagem, e a limpeza geral do sistema investigado. Amplitudes comparáveis à espessura da região interfacial líquido (tipicamente inferior a 2 nm) investiga variação principalmente nas propriedades do solvente interfacial 42. Se a amplitude de oscilação é muito grande, a ponta vibrando irá percorrer longo alcance, campos de força não-lineares 52 que impedem a estabilidade do movimento cantilever, e inevitavelmente torna a amostra, independentemente das condições de imagem 29, resultando na deterioração da resolução. Além da perda de resolução, harmônicos mais altos começam a aparecer no movimento da ponta e o sistema torna-se mais complicado para modelar 55. Alternativamente, se a amplitude de imagem é demasiado pequena óparte nly da interface é sondado (tipicamente camadas específicas do líquido interfacial) e imagiologia estável só pode ser conseguido com braços de suporte rígidos (&gt; 10 N / m de água 53) para uma relação sinal-para-ruído satisfatória, com o risco de amostras macias prejudiciais sobre grandes variações de altura. A necessidade de vigas rígidas é superar o ruído térmico que pode tornar-se mais significativo que o sinal medido Quando se trabalha com pequenas amplitudes, as interacções de longo alcance entre a ponta e a amostra ainda está presente, mas são amplamente constante e não afecta a contraste de alta resolução nas imagens obtidas. Limpeza do ambiente de imagem é de extrema importância quando se trata de AFM de alta resolução. compostos indesejados no sistema pode interferir tanto com a imagem e a espectroscopia de força. Existem duas categorias principais de contaminações que tendem a afetar os experimentos: (i) os contaminantes diretamente visíveis quando imagiologia ( <strong&gt; Figura 4B, 4C) e (ii) inexplicada falta geral de alta resolução. Caso (i) tende a ocorrer apenas em sistemas altamente idealizados, como na interface água-mica em que os agregados moleculares adsorvidas que interferem com as interações ponta-amostra são claramente contrastado contra a superfície mica atomicamente plana (Figura 4A). Antes de alterar a ponta ea amostra, vale a pena adquirir curvas espectroscópicas com um grande desvio, efetivamente pressionando duramente a ponta contra a amostra repetidamente. Isso normalmente danificar uma nova dica, mas ocasionalmente pode limpar uma ponta suja ou induzir locais de hidratação estáveis ​​adequados para a imagem latente. Esta ponta vai, no entanto, inevitavelmente, ser tornado rombo e, por conseguinte, ser apenas adequada para a amostra plana mesmo que a imagem melhora. Em caso de suspeita de contaminação e sobre as amostras duras, pode valer a pena tentar imagem com o segundo modo próprio do cantilever antes de tentar o procedimento um tanto destrutiva descrito acima. Isto simplesmente requer swcoçando a frequência de condução para o segundo modo próprio e reajustar a amplitude / setpoint (veja a discussão solução de problemas abaixo). A rigidez efetiva dos cantilever aumenta consideravelmente quando operados no segundo modo próprio e quaisquer contaminantes fracamente adsorvido pode ser empurrado para longe pela ponta, enquanto imagem. Esta estratégia não substitui a necessidade de uma amostra limpa e ponta, mas oferece algumas novas vias para adquirir imagens satisfatórios quando uma dica / amostra não é claramente ideal. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig4.jpg" /> Figura 4: Exemplos de contaminação observados quando imagiologia mica moscovite que inibem a imagem de alta resolução. A: Mica trabalhada em RbCl 5 mM - sem partículas contaminantes são visíveis. B: Contaminação tomando a forma de agregados da ordem de dezenas de nm através enquanto imagiologia em água nominalmente ultrapura. C: estruturas auto-organizadas formadas por contaminaçãopartículas nant presumivelmente anfifílicos na natureza. A visualização foi realizada novamente em água ultrapura nominalmente. D: desviado verticalmente secções correspondentes às linhas tracejadas em A, B e C ilustram o desvio a partir da superfície atomicamente plana de mica. As barras de escala em A, B e C correspondem a 300 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Processo (ii) é mais comum e principalmente caracterizada pelo facto de que as características frustrante sub-nanômetros simplesmente não podem ser resolvidos, independentemente das condições de imagem. A assinatura deste tipo de situação é normalmente visível na medição de espectroscopia de força que tendem a mostrar algumas inconsistências. Estes podem incluir curvas mal reprodutíveis e amplitude vs curvas distância que se afastam significativamente de uma forma sigmoidal típica 42. Se contaminantes, iônicos ou não, são DISPERSed forma homogénea em todo o líquido, eles não podem aparecer na imagem topográfica, mas poderia romper a estrutura hidratação da amostra 69, que é crucial para a manutenção de uma interação regular ponta-amostra de 29 e obtenção de alta resolução 70. Também pode haver efeitos directos dos contaminantes na amostra, especialmente em experiências com refrigerantes, biológicos. Por exemplo, sabe-se bem que a presença de álcoois (a partir do procedimento de limpeza) podem fluidificação bicamadas lipídicas de fase de gel de 71-73, tornando resolução a nível de sub-nanométrica impossível. Se de alta resolução não for possível, o cuidado deve ser tomado primeiro no processo de limpeza, focando especialmente em qualquer equipamento que entra em contacto com a solução de imagem. Mesmo os compostos aparentemente estáveis, tais como a resina epoxi pode solvato no fluido, em certa medida, se não completamente curada. imagens de alta resolução com AM-AFM é exigente, requer paciência emuitas vezes vários ensaios antes de alcançar as melhores condições possíveis de imagem. questões experimentais pequenas podem facilmente tornar-se importante o suficiente para evitar habilidades de alta resolução e resolução de problemas são essenciais. A partir de agora, listamos alguns dos problemas mais comuns que encontramos com a nossa solução proposta. ajuste cantilever A maioria dos AFMs comerciais usam excitação acústica para dirigir o cantilever. Em tal caso, o ajuste do raio de acção, tal como descrito na etapa 5.4, próximo à sua frequência de ressonância frequentemente fornece um desempenho suficiente para a operação em ar. Em meios líquidos, o líquido tende a induzir algum acoplamento entre os diferentes componentes mecânicos do AFM tais como chips cantilever e o suporte. Isto pode afectar a aparente de ressonância do braço de suporte, geralmente ilustrada pelo espectro de frequências de um braço de suporte que apresenta muitos picos e vales afiados vulgarmente descritos como &quot;floresta de picos&quot;. Como resultado, muitas vezes é difícil encontrar o correfrequência de ct. Estes picos também existir em ambientes de gás, mas, devido ao elevado valor do factor de qualidade do braço de suporte, a amplitude de ressonância é consideravelmente maior 74,75. Em líquido seleccionando o pico apropriado para accionar o braço de suporte não pode ser fácil e pode exigir tentativa e erro. Na prática, o pico de frequência com variação mais acentuada na amplitude na &quot;floresta de picos&quot; em torno da frequência de ressonância é geralmente a melhor aposta, apesar de ser não necessariamente exatamente na ressonância e muitas vezes fornece uma frequência de condução adequada para obter imagens de alta resolução. a distorção da imagem Imagiologia deriva muitas vezes é um problema quando se busca de alta resolução e faz com que as imagens pareçam distorcidas (normalmente esticado). Sua origem é geralmente térmica, ou porque o scanner / AFM não atingiu a sua temperatura operacional de equilíbrio, ou porque parte da amostra de líquido está evaporando rapidamente (por exemplo, a imagem latente em álcoois<html> ). Em todos os casos, a deriva torna-se insignificante no estado de equilíbrio térmico. Por conseguinte, é útil para fixar a temperatura da amostra, se possível. Caso contrário, vale a pena sair do AFM para digitalizar uma amostra em branco (varredura de tamanho grande na taxa de varredura lenta) durante várias horas antes de realizar o experimento. Se a evaporação não é um problema, este procedimento é melhor realizado depois do passo 6 do procedimento, tendo o cuidado de retirar em primeiro lugar a ponta de uma curta distância (por exemplo, 20 mm) a partir da superfície. Ocasionalmente, a deriva permanecerá mesmo após extensa de estabilização térmica. Isso geralmente indica que o cantilever ou seu chip é parcialmente arrastando a amostra, enquanto imagem, algo que pode acontecer em amostras coesivos macios tais como filmes finos ou se a ponta / cantilever / chip não é adequadamente colocado. Em chips que hospedam mais de um cantilever / ponta, muitas vezes é útil para quebrar o cantilever que não estão em uso, em vez de deixá-los arrastar sobre a superfície. Força iônica ntent &quot;&gt; Uma vez que a imagem é dominado pelo líquido interfacial, por vezes é útil adicionar algum sal para imagens de alta resolução da superfície carregada na água. O papel do sal é duplo. Em primeiro lugar, ele modifica a paisagem hidratação do superfície trabalhada sobre a adsorção, que frequentemente melhora o contraste. em segundo lugar, ajuda a tela fortes interacções electrostáticas entre a ponta e a amostra (por exemplo, em mica). Geralmente, os iões maiores, potássio, rubídio e césio permitir melhores imagens, devido às suas propriedades de hidratação específicos 76, eo fato de que muitas vezes eles adsorver principalmente em um estado de hidratação única 77. Bad cantilever / tip Se se suspeitar que o braço de suporte é uma fonte de contaminação (ver os sintomas descritos acima), ele deve ser em primeiro lugar examinadas sob um microscópio óptico. Se armazenado em uma caixa de gel, o cantilever pode pegar traços de polímeros de gel ou óleo de silicone 59 que pode aparecer, Em casos extremos, como manchas mais escuras, na parte traseira do braço de suporte (tal como na Figura 5A). Fototérmica oscilação do braço de suporte podem induzir pontos semelhantes, mas eles são devidos à degradação / sobreaquecimento do revestimento cantilever pelo laser de condução. Contaminação tende a aparecer aleatoriamente na cantilever. A (12 horas) a limpeza por mais tempo com isopropanol e, em seguida, com água ultrapura pode remover todas as partículas indesejáveis ​​do cantilever. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig5.jpg" /> Figura 5: Comparação entre um novo braço de suporte e um idêntico que tem sido amplamente utilizado em superfícies duras e deixado em uma caixa de gel por um período prolongado. A: Top; óptico de imagem de cantilever novinho em folha que foi limpa (veja o procedimento). Inferior; óptico de imagem demonstrando a aparência de contaminação visível (seta azul) da caixa de gel. B: Comparação dos respectivos espectros térmica &#39;consolas.Ampliação do primeiro pico de ressonância do velho cantilever é clara (seta verde) e em alguns modos de ordem superior são reforçadas (seta azul). Spectra foram verticalmente compensados ​​e apresentados em uma escala log-log para maior clareza. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Se a resolução sub-nanométrica necessária não é conseguida, apesar de imagens aceitáveis ​​com baixa resolução, é possível que a ponta de AFM tornou-se quimicamente modificada durante o seu ambiente de armazenamento. Este pode ser tratado por exposição do chip cantilever para um oxidante ultravioleta, durante 120 segundos, o que auxilia a criação de grupos superficiais hidrófilos na ponta 60. Deve ser tomado cuidado no entanto, como a hora exacta necessária pode variar em função da geometria da ponta e do poder de UV, e o excesso de exposição pode resultar em embotamento da ponta e resolução reduzida. O ruído térmico &lt;/ P&gt; Imagens de alta resolução exige grande sensibilidade às variações de força e distâncias (tipicamente forças sub-PN e sub-Ångström distâncias 78). Para consolas mais suaves, o movimento termo-mecânica do braço de suporte, devido ao seu movimento Browniano intrínseca (vibração térmica) pode ser um problema. Em primeira aproximação, com um braço de suporte de rigidez k, que não é possível medir características menores do <img alt="equação1" src="/files/ftp_upload/54924/54924equation1.jpg" /> , A amplitude do ruído térmico, onde k B é constante de Boltzmann e T é a temperatura. Praticamente, usando cantilever com frequências de ressonância superiores espalha o ruído sobre uma faixa de freqüência maior, e reduz o nível de ruído global na largura de banda de medição 79. imagiologia modo próprio Superior Por vezes, pode ser útil para operar o braço de suporte no seu segundo modo própriodevido ao aumento da rigidez efetiva (ver discussão de contaminação). Na prática, isto é feito simplesmente por condução do cantilever no seu segundo modo próprio (o segundo pico de ressonância na frequência mais elevada, ver Figura 1A). Ao ajustar o cantilever, basta selecionar o segundo modo próprio, em vez de a ressonância principal e vá para a etapa 5.4. Note-se que os InvOLS será diferente quando o braço de suporte é impulsionada no segundo modo próprio; tipicamente ~ 1/3 dos InvOLS medida no passo 5.2 para um cantilever rectangular. A principal limitação da técnica é que ela exige uma paisagem solvatação estável na superfície da amostra. A amostra deve ser suficientemente robustos para permitir que perturbando o líquido interfacial sem induzir uma deformação significativa da própria amostra. Este pode ser um desafio em muito macio e amostras instáveis ​​tais grandes biomoléculas. Além disso, AFM de pequena amplitude, conforme descrito aqui não pode obter informações sobre a mecânica pROPRIEDADES de uma amostra, como a ponta cantilever passa a maior parte de seu tempo no líquido interfacial. Para isso, pode ser benéfico utilizar outras abordagens, tais como quantitativa nanomechanical Mapeamento 80 ou fazer uso de harmónicos mais elevados de movimento cantilever. Harmônicas mais elevadas são geralmente reforçada quando imagiologia no líquido (com qualidade-fatores baixos) 29,81 - 83 e pode proporcionar, simultaneamente, topografia e rigidez de amostras 25,81 - 84, mas eles são geralmente prejudiciais para o alta resolução. Outras limitações inerentes a todas as técnicas de microscopia de varredura da sonda ainda são válidas aqui, em particular, o facto de os resultados inevitavelmente conter informações sobre a ponta de medição. A utilização de pequenas amplitudes também não é ideal para amostras com grandes variações de altura; o ciclo de feedback, inevitavelmente reagir mais lentamente quando variações de altura são maiores do que a amplitude de imagem, portanto, correr o risco de amostra e ponta danos. O uso oF mais suave cantilever atenua este problema em certa medida. A principal vantagem do método aqui apresentado é o facto de proporcionar a maior resolução de imagem possível com a AFM em líquido, mas pode ser implementado em qualquer AFM comercial, desde que os níveis de ruído da máquina são suficientemente baixas. Comparável resolução sobre instrumentos comerciais é geralmente obtida no modo de contato, ou ocasionalmente em FM-AFM com vigas rígidas. Trabalhando em AM-modo e com consolas relativamente macios permite uma escolha mais ampla de amostras, e é mais fácil de implementar do que FM-AFM na maioria dos sistemas. A abordagem baseia-se na exploração das forças de solvatação existentes na interface entre qualquer sólido e líquido para melhorar a resolução e obter informações química local. Ele pode, em princípio, ser utilizado em condições ambientais, contando apenas com as camadas de água (tipicamente alguns nanômetros de espessura) que se acumulam na maioria das superfícies, devido à umidade do ar. Os princípios subjacentes àestratégia de alta resolução permanecem inalterados, mas a maior parte da ponta é em ar, com apenas uma ponte capilar entre o vértice da ponta e a amostra 85. De alta resolução foi demonstrada em amostras rígidas nestas condições 86,87. As condições de imagiologia são no entanto diferente do que aqueles de líquido imersa devido a um factor Q mais elevado de oscilação do braço de suporte. Praticamente, achamos difícil atingir o funcionamento estável ao longo amostras suaves ou irregulares, presumivelmente devido a mudanças temporais da ponte capilar e aumento da Q-fatores para uma determinada rigidez cantilever. O protocolo aqui descrito oferece uma metodologia para obtenção de imagens de alta resolução a nível molecular de amostras no estado líquido com a maioria comerciais AM-MFAs modernos. Nós fornecemos a razão científica por trás da nossa escolha de parâmetros de imagem e enfatizar o papel das forças de solvatação. Nós também discutir problemas comuns e na contaminação particular. As interações específicas ponta-amostra caN variar dramaticamente dependendo do conteúdo da solução de imagem, a geometria do braço de suporte e o material, e a composição química da amostra. A compreensão prática da natureza das forças dominantes presentes durante a digitalização é, portanto, essencial para se adaptar este protocolo para novos sistemas e garantir resultados confiáveis. Quando optimizado, a abordagem experimental é poderoso para obter in situ percepções nível molecular locais de amostras em solução.

Desde sua invenção, há três décadas, microscopia de força atômica (AFM) 1 estabeleceu-se como uma técnica de escolha para a investigação de amostras em escala nanométrica, especialmente onde a média sobre áreas de superfície macroscópicas não é possível e informação local é necessária. Em uma medição típica de AFM, a deflexão de um braço de suporte flexível é utilizado para quantificar a força de interacção entre um pequeno número de moléculas, e uma ponta ultrasharp montado na extremidade do braço de suporte. Dependendo do tipo de interacções e as escalas de tempo considerado, uma vasta gama de informações podem ser derivados, incluindo as propriedades viscoelásticas das membranas biológicas moles 2,3, a força de uma única química ou ligação molecular 4,5, os detalhes de um atomísticas superfície 6-8, o magnético 9, capacitivo 10, a realização de 11, térmicas e químicas 12,13 14 propriedades de amostras <sup&gt; 15. Parte do sucesso da AFM é a sua capacidade para trabalhar em uma ampla gama de materiais 16 e em vários ambientes, tais como vácuo 17, gás ou líquido 11,18 19,20, porque não depende de uma força específica entre a sonda ea amostra . Na prática, no entanto, operando a AFM do que em outras condições de ambiente podem ser difíceis e muitos resultados publicados são ainda obtidos no ar. Uma dificuldade adicional provém do facto de que geralmente é necessário para operar a AFM em modo dinâmico (ponta de vibração), a fim de preservar a ponta e amostra, evitando grandes forças de atrito. Embora mais desafiador, operação dinâmica pode, em princípio, fornecer mais informações sobre a amostra analisada, e sem perda de resolução espacial. Durante a última década, o campo da AFM dinâmico em líquido tem visto desenvolvimentos importantes, a partir do advento da AFM-rate de vídeo 21-23, para medições multifrequência <sup&gt; 24,25 e sub-nanométrica imagiologia de estruturas de hidratação nas interfaces 26 - 31. Operação AFM enquanto imerso no líquido agora é rotineiramente usado na biologia e biofísica 32-36, pesquisa de polímeros 37, eletroquímica 38-40 e sólido-líquido interfaces de caracterização 41-44. A presença de líquido em torno do braço de suporte oscilante altera consideravelmente a sua dinâmica 45, bem como a interacção entre a ponta e a amostra de 29,42. Quando utilizados de forma adequada, o líquido pode ser explorada para aumentar a resolução de imagem 26,29, com uma melhoria típico de quase uma ordem de grandeza em comparação com a melhor resolução conseguida em condições ambientais de 46. Em AFM, a mais alta resolução espacial possível para uma medição particular depende tanto da qualidade do próprio AFM e a natureza de tele interacção sondado 20,47,48. No presente momento, o mais high-end, AFMS disponíveis comercialmente apresentam níveis de ruído que estão próximos ao do limite térmico 12 para o fator determinante para a resolução é normalmente a interacção ponta-amostra. É efetivamente o gradiente espacial desta interação que determina a resolução: medições baseadas em curto alcance, em rápida decomposição interação produzir resultados resolução maior do que quando as interações de longo alcance estão em jogo. No estado líquido, as forças de solvatação pode melhorar a resolução de imagem, porque eles tendem a desaparecer sobre apenas alguns diâmetros moleculares de o líquido (tipicamente &lt;1 nm) quando se desloca para fora da superfície da amostra 49. Estas forças têm origem a partir da interacção entre as moléculas do líquido e a superfície da amostra. Um líquido com uma forte afinidade para a superfície tenderá a ser mais ordenada e menos móvel que grandes quantidades de líquido, na interface com a amostra 29,42,50. Como um resultado,vai demorar mais energia para a ponta do AFM vibrando para deslocar moléculas do líquido interfacial de granéis líquidos 42, tornando a medição altamente sensíveis a variações locais nas propriedades líquido interfacial em nanoescala -a paisagem solvatação. A fim de explorar as forças de solvatação, vários aspectos práticos têm de ser tomadas em consideração. Em primeiro lugar, a amplitude da oscilação da ponta tem de ser comparável à gama de forças de solvatação, tipicamente &lt;1 nm. Em segundo lugar, o líquido utilizado deve formar uma paisagem solvatação bem definida na superfície da amostra. Macroscopicamente, isto é equivalente a necessidade de um líquido &quot;molhagem&quot; da amostra considerada. Por exemplo, em água, é mais fácil de conseguir resolução a nível molecular em mica hidrófilo do que em 42,51 grafite hidrofóbico. Finalmente, a constante do cantilever apoiar a ponta da mola deve ser seleccionado de forma adequada 52,53. Ao trabalhar nestes concondições, a AFM não só fornecem imagens a nível molecular da interface, mas também deriva informação sobre a afinidade da amostra de líquido local, que pode ser usada para obter informação sobre a química da superfície da amostra 54. Os modos dinâmicos mais comuns de operação para AFM em líquido são amplitude modulação (AM, também &quot;modo de tocar &#39;) AFM e frequência modulação AFM (FM). No primeiro caso 55, a ponta quadriculação-digitaliza a amostra enquanto a sua amplitude de vibração é mantido constante por um ciclo de feedback que continuamente re-ajusta a distância da ponta-amostra. Uma imagem topográfica da amostra é obtida a partir de a correcção aplicada pelo circuito fechado de realimentação. Em FM-AFM 28,41,56, é a frequência de oscilação do braço de suporte / dica que é mantido constante, enquanto a ponta varre a amostra. Ambas as técnicas fornecer resolução topográfico comparável em líquido 36,57. Quantificação da interacção ponta-amostra tende a ser mais straightforward e precisas em FM-AFM, mas AM-AFM é mais fácil de implementar, mais robusto e permite trabalhar com consolas mais suaves, algo útil para estudar amostras facilmente deformáveis ​​ou delicados. Significativamente, AM-AFM é mais difundido entre os usuários AFM, em parte por razões históricas, mas também devido ao fato de que é tecnicamente mais fácil de controlar. Embora a amplitude é mantida constante por o ciclo de feedback durante o exame AM-AFM, a fase de tempo entre a oscilação da ponta e da oscilação de condução é permitido alterar livremente. A fase-lag pode fornecer informações úteis sobre as interações ponta-amostra, estando relacionado com a energia dissipada durante a oscilação da ponta na interface com a amostra 58. Daí fase de formação de imagens pode ser adquirida simultaneamente a imagem topográfica, e muitas vezes é complementar em destacar a heterogeneidade da superfície de uma amostra. imagiologia de fase tem sido utilizada para uma variedade de interacções mapeamento, incluindo o dimapeamento rect de energia de adesão 42, 58 propriedades viscoelásticas ea paisagem hidratação de uma interface 44. Na prática, a obtenção de imagens de alta resolução em líquido continua a ser não-trivial, devido ao grande número de parâmetros de controlo, e a ausência de um protocolo simples, sistemático que funciona em todas as situações. A qualidade da imagem, tipicamente depende da geometria do braço de suporte e elasticidade, a química da ponta, a amplitude de oscilação, e a rigidez da amostra, entre outros 55. AFM medições são também, por definição, Perturbativa para o sistema. Como resultado, a alteração das variáveis ​​de imagem e as condições ambientais, sem considerações adequados pode levar a dificuldades na reprodutibilidade e / ou observações misrepresentative e resultados espúrios. Aqui, apresentamos o nosso protocolo para conseguir imagens de alta resolução de amostras moles e duros em solução, utilizando instrumentos comerciais operados em amplitude-modulação. Nosso objetivo é oferecer um procedimento prático para otimização dos principais parâmetros susceptíveis de influenciar a resolução sobre as amostras diferentes, explicando em cada caso, a justificativa para as nossas escolhas a partir dos princípios físicos subjacentes ao processo de imagem. Detalhamos uma abordagem passo-a-passo, desde a limpeza e preparação do substrato, a escolha de cantilever, o ajuste dos parâmetros de imagem e solução de problemas comuns. Explicando a razão científica por trás de nossas escolhas e procedimentos para a alta resolução deve ajudar a fazer escolhas racionais quando adaptar a metodologia, e servir como um ponto de partida para sistemas novos de imagem. Ao longo deste texto, usamos AM para referir-se ao modo de funcionamento da amplitude da modulação de um AFM. Referimo-nos ao parâmetro de feedback mantido constante durante tanto a deflexão cantilever (modo contato) ou amplitude de oscilação (modo AM) como o valor nominal. No modo de AM, o braço de suporte é impulsionada externamentequer por uma oscilação acústicas ou por um laser pulsado focalizado na base do braço de suporte. A amplitude unidade é a intensidade do sinal oscilatório externo. O valor absoluto da amplitude unidade necessária para atingir uma determinada amplitude de oscilação do braço de suporte depende de muitos parâmetros, tais como o método de condução (acústico, fototérmico ou magneticamente), fixação do braço de suporte e parâmetros (rigidez, a geometria) e alinhamento do laser. O valor exacto da amplitude da unidade não é, portanto, relevante, mas é ajustada em cada experiência de modo a proporcionar uma apropriada (e quantificável) amplitude de oscilação do braço de suporte. Quando o braço de suporte é impulsionada longe a partir da amostra e sem amortecimento da sua vibração ocorre através de interacções ponta de amostra, a sua amplitude de oscilação é chamado a amplitude de oscilação livre. À medida que a ponta vibratória se aproxima da superfície da amostra, a sua amplitude começa a diminuir. Se o feedback for ativada, o z-piezo vai constantly reajustar sua extensão para que a quilha, a amplitude do valor nominal selecionado, constante. O valor nominal é normalmente sempre menor do que a amplitude livre. É comum referir-se a relação do valor nominal, a razão entre a amplitude do valor nominal (amplitude de imagem) sobre a amplitude livre. Quanto menor a proporção de valor nominal, a mais dura das condições de imagem são.

<table><tbody><tr><td>Multimodo IIIA AFM</td><td>Brucker</td><td>NA</td><td>Uma das máquinas usou</td></tr><tr><td>Cypher ES AFM</td><td>Asylum Resarch</td><td>NA</td><td>Uma das máquinas usou</td></tr><tr><td>o cantilever do AFM/ponta</td><td>Nanoworld</td><td>Seta UHF-AUD</td><td>melhor para alta freqüência</td></tr><tr><td>AFM cantilever/ponta</td><td>Olympus</td><td>RC800-PSA</td><td>versátil e barato</td></tr><tr><td>água ultrapura</td><td>Milipore</td><td>NA</td><td>sistemas de filtragem de laboratório podem induzir contaminação</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td>200-664-3&nbsp;</td><td>produto químico padrão, sem purificação adicional</td></tr><tr><td>Sais monovalentes</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td></td><td>produto químico padrão, sem purificação adicional</td></tr><tr><td>Lipídios</td><td>Avanti Lipídios polares</td><td></td><td>bicamadas lipídicas formadas usando protocolos padrão</td></tr><tr><td>Cristais</td><td>MTI</td><td></td><td>cristais polidos</td></tr><tr><td>Fita adesiva</td><td>3M</td><td>Fita adesiva</td><td>translúcida funciona melhor. Adere com muita força</td></tr></tbody></table>

sub-nanômetros de imagem resolução com amplitude modulação microscopia de força atômica no líquido

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

A microscopia de força atômica (AFM) tornou-se uma técnica bem estabelecida para imagens em nanoescala de amostras no ar e no líquido. Estudos recentes mostraram que, quando operadas no modo de modulação de amplitude (tapping), imagens de resolução em nível atômico ou molecular podem ser obtidas em uma ampla gama de amostras macias e duras em líquido. Nessas situações, pequenas amplitudes de oscilação (SAM-AFM) aumentam a resolução explorando o líquido solvatado na superfície da amostra. Embora a técnica tenha sido aplicada com sucesso em campos tão diversos quanto ciência dos materiais, biologia e biofísica e química de superfície, a obtenção de imagens de alta resolução em líquido ainda pode ser um desafio para usuários iniciantes. Isso se deve em parte ao grande número de variáveis a serem controladas e otimizadas, como a escolha do cantilever, a preparação da amostra e a manipulação correta dos parâmetros de imagem. Aqui, apresentamos um protocolo para obter imagens de alta resolução de amostras duras e moles em fluido usando SAM-AFM em um instrumento comercial. Nosso objetivo é fornecer um guia prático passo a passo para obter imagens de alta resolução, incluindo a limpeza e preparação do aparelho e da amostra, a escolha do cantilever e a otimização dos parâmetros de imagem. Para cada etapa, explicamos a lógica científica por trás de nossas escolhas para facilitar a adaptação da metodologia ao sistema específico de cada usuário.

O protocolo descrito na secção anterior tem sido aplicado com êxito com vários MFAs comerciais para obter imagens ou molecular-nível atómico. Todas as imagens foram obtidas com amplitudes de trabalho entre 0,5 nm e 1,5 nm ajustados seguinte individualmente o procedimento passos 7,1-7,4. Os resultados podem ser obtidos sobre uma ampla gama de macio (Figura 2) e (3) Figura amostras rígidas. Em cada caso, as características de interesse são realçados. Uma das grandes vantagens da técnica é que as pequenas amplitudes de oscilação e altos pontos de ajuste minimizar a força exercida pela ponta sobre a amostra, permitindo que auto-agrupamentos frágeis de lípidos (Figura 2A), proteínas (Figura 2B e D), e moléculas anfifílicas (Figura 2C) a ser trabalhada sem danos em solução. Materiais mais duros, tais como minerais cristalinos (Figuras 3A, B, D) eiões de metal único adsorvido sobre a superfície (Figura 3C) pode ser fotografada usando a abordagem porque em todos os casos, é o líquido interfacial que é trabalhada de forma eficaz com o protocolo descrito. As forças de solvatação são comparáveis nos exemplos mostrados Figuras 2 e 3: todas as amostras são hidrofílicos (mais geralmente, &quot;solvophilic&quot; no caso das Figuras 2C, 3B, 3D) com respeito à solução de imagem. Consistentemente, consolas com rigidez comparável (0,2-0,8 N / m) foram usadas em todos os casos. Tanto a amostra e a ponta deve ser solvophilic para assegurar que as moléculas de líquidos formar uma estrutura de solvatação bem definida, que pode ser trabalhada. Isto nem sempre é uma condição suficiente, mas na maioria dos casos e para moléculas líquidas relativamente pequenas, o próprio líquido re-estruturas de uma forma que imita a simetria amostra. O principal motor da alta-resolução é a variação local na afinidade das moléculas de solvente adsorvidopara as superfícies (Ångström escala, no caso das Figuras 2A, 3A, 3C). A técnica é, portanto, mais adequada para materiais em que a estrutura de solvente varia em grande medida em toda a superfície. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig2.jpg" /> Figura 2: as interfaces macias fotografada pela AFM-AM em soluções aquosas. A: dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) bicamada lipídica em fase de gel fotografado na em KCl a 150 mM. Os headgroups lipídicas-embalados hexagonal são distinguíveis em ambos os topografia e fase, juntamente com o contraste local indicando variações específicas do local na hidratação. B: membranas roxos de Halobacterium salinarum fotografada em KCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7,4. Vários trï¿½eros proteína bacteriorhodopsin são realçados. A fase apresenta um contraste diferente da topografia devido aos locais de hidratação locais sobre as proteínas. trímeros individuais de proteínas<html> pode ser feita (linhas tracejadas). C: corantes moléculas anfifílicas (Z907) adsorvidos na superfície de uma nanopartícula de TiO 2 em uma célula solar sensibilizada por corante. A imagem foi adquirida em sulfona etil-isopropilo. A aparência semelhante a esponja é criado pelas moléculas de corante adsorvido. D: cristal Aquaporin em membranas de lente bovina nativas fotografada no mesmo tampão como B. Um tetrâmero aquaporina é realçado. Sub-estrutura correspondente a laços inter-helicoidais são visíveis na topografia enquanto a fase mostra um contraste impressionante diferente devido ao comportamento incomum água perto da proteína. As imagens são adaptadas de refs 36 (B), Ref 38 (C) e ref 67 (D). A barra de escala é de 5 nm (A), de 10 nm (B), 3 nM em (C), e 15 nm (D) A escala de cor indica, respectivamente, uma variação da altura e fase de 200 pm e 15 ° (A), 600 pm e 4 ° (B), de 2,5 nm e 2,5 ° (C), e 1,6 nm e 9,5 ° (D).carga / 54924 / 54924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig3.jpg" /> Figura 3: Imagens representativas AM-AFM de amostras duras em soluções de fluido. A: A calcite cristal [ <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54924/54924equation2.jpg" /> ] Superfície fotografada em uma solução de água ultrapura equilibrada. B: titanato de estrôncio fotografada obtido em dimetil-sulfóxido (DMSO). De alta resolução não era possível na água. C: Muscovite mica trabalhada em RbCl 3 mm - íons individuais absorvidos Rb + são visíveis em sítios da rede da mica em ambos os scans de fase e altura. D: carboneto de silício em fotografada em DMSO. Os arranjos de cristalografia esperados são mostrados nas imagens B e D. As imagens são adaptadas de Ref 68 (a), referência 42 (B e D),e ref 44 (C). A barra de escala é de 3 nm (A, B, D) e 5 nm (C). A escala de cor indica, respectivamente, uma variação da altura e fase de 250 pm e 14 ° (A), 600 pm e 5,5 ° (B), 800 pm e 15 ° (C), e 500 pm e 3,5 ° (D). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Nós apresentamos um método para conseguir imagens com resolução sub-nanométrica com (modo tapping) amplitude da modulação de microscopia de força atômica em líquido. O método é demonstrado em microscópios de força atómica comerciais. Nós explicar a lógica por trás de nossas escolhas de parâmetros e sugerir estratégias para otimização resolução.

Sub-nanômetros de imagem resolução com Amplitude modulação Microscopia de Força Atômica no líquido

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

O objetivo geral deste procedimento é obter a imagem com a mais alta resolução possível em líquido, utilizando um AFM comercial operado em modo de modulação de amplitude, também conhecido como modo tapping. Este método auxilia na ampliação dos limites da operação padrão de AFM em líquido, utilizando a melhor combinação de parâmetros para alta resolução. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada com a maioria dos AFMs comerciais, não exigindo, portanto, equipamentos especializados.O método apresentado aqui destina-se a cientistas e técnicos que já possuem algum conhecimento básico de AFM, mas que desejam obter melhores resultados com a técnica. Este método não é voltado para nenhum tipo específico de amostra e pode ser amplamente aplicado a amostras das áreas de física, biologia, química, materiais e ciências aplicadas. Em geral, indivíduos novos nesta técnica enfrentarão dificuldades, pois é necessário ter paciência para encontrar os melhores parâmetros para uma determinada amostra.Sonicar os instrumentos e o disco que sustenta o substrato em água ultrapura. Em seguida, com isopropanol e novamente com água ultrapura, por 10 minutos cada. Ao buscar alta resolução, qualquer contaminação pode ter consequências prejudiciais.Use luvas em todo o momento e certifique-se de que todas as superfícies ou instrumentos que entrem em contato com a amostra, o cantiléver ou a célula de AFM sejam limpos completamente. Após a sonicação, seque cada um dos instrumentos e o disco da amostra sob fluxo de nitrogênio. Utilize um disco de aço como suporte para a mica, para imagens de íons metálicos absorvidos individualmente.Limpe fisicamente as superfícies que não podem ser limpas por ultrassom, limpando-as com tecidos de baixa pelugem de uma única camada, umedecidos sequencialmente com água ultra pura, isopropanol e água ultra pura. Deixe a superfície secar ao ar por até 30 minutos. Em seguida, prepare uma pequena quantidade de cola epóxi misturando completamente os reagentes e coloque cerca de 10 microlitros da epóxi sobre o disco de amostra de aço limpo.Coloque o substrato de mica sobre a resina epóxi e fixe-o ao disco de aço aplicando pressão sobre o substrato. Deixe a epóxi curar por várias horas em temperatura elevada, conforme as especificações do fabricante. Em seguida, pressione firmemente um pedaço de fita adesiva com 2,5 centímetros de largura sobre o substrato, de modo que toda a superfície fique coberta, e remova suavemente a camada superior.Repita este processo duas a três vezes até que a mica fique visualmente espelhada. Mergulhe o chip do cantiléver em um banho de isopropanol, seguido por água ultra pura, durante 60 minutos cada. Em seguida, exponha a ponta à luz ultravioleta por até cinco minutos, a fim de favorecer a formação de sítios estáveis de hidratação.Tempos mais longos de superexposição podem danificar a ponta ou aumentar seu raio de curvatura. Insira a alavanca no suporte de alavancas do AFM e pipete 25 microlitros do líquido de imagem sobre a alavanca e a ponta para pré-umedecer a superfície. Isso reduzirá o aparecimento de bolhas de ar ao se aproximar da amostra.Derreta o disco da amostra e o substrato na platina da amostra e adicione uma gota do líquido de imagem à amostra. Em seguida, conecte o suporte do cantiléver ao AFM. Aproxime o cantiléver e a amostra o suficiente para formar uma ponte capilar entre os fluidos na ponta do cantiléver e os da amostra.Utilize o software do AFM para alinhar o laser de medição próximo à extremidade da ponteira da alavanca. Em seguida, encontre a frequência de ressonância da alavanca a partir do pico principal em seu espectro térmico. Se a deflexão da alavanca estiver calibrada, o ajuste do pico de ressonância com um modelo de oscilador harmônico simples fornece a constante elástica da alavanca.Em seguida, ajuste o microbalance ao encontrar sua resposta de amplitude quando excitado externamente por uma faixa de frequências próxima à frequência de ressonância identificada no espectro térmico. Ajuste a amplitude de excitação de modo que a amplitude de oscilação livre seja aproximadamente cinco nanômetros. Isso geralmente corresponde a 0,2–0,8 volts na maioria dos AFMs.Em seguida, ajuste o ponto de amplitude para cerca de 80% da amplitude livre. Depois, configure os ganhos de realimentação relativamente altos. Após garantir que não ocorra instabilidade ou oscilação, defina a taxa de varredura inicial em aproximadamente um hertz e o tamanho da varredura em 10 nanômetros.Inicie a aproximação da ponta em direção à superfície utilizando o software de controle do AFM. Avalie se a ponta atingiu a superfície sem iniciar a imagem, alterando ligeiramente o valor do ponto de ajuste. Se a ponta estiver na superfície, o efeito sobre a extensão da zona ZPA deve ser desprezível.Uma vez que a ponta tenha atingido a superfície, recolha a zona ZPA e reajuste o cantiléver. A frequência de ressonância provavelmente terá mudado para um valor mais baixo devido às interações entre a ponta e a amostra. Agora, altere o ponto de ajuste para cerca de 80% da amplitude livre recém-ajustada e aproxime o cantiléver para realizar uma varredura de 10 por 10 nanômetros quadrados da superfície no modo de modulação de amplitude, a fim de verificar se os parâmetros de imageamento são adequados.Verifique se os perfis de avanço e retorno se sobrepõem. Caso contrário, reduza ainda mais o ponto de ajuste e tente aumentar os ganhos. Se a imagem ficar ruidosa, diminua os ganos.Repita a operação com uma região grande do tamanho de um a cinco micrômetros quadrados da amostra, caso isso seja possível. Em amostras macias ou biológicas, isso pode resultar em contaminação da ponta. Reduza o tamanho da varredura para um valor adequado para visualizar as características de interesse.Isso pode ser tão pequeno quanto 20 por 20 nanômetros. Em seguida, reduza a amplitude de excitação do cantiléver o suficiente para que o laço de realimentação recolha automaticamente a zona ZPA, afastando a ponta da superfície. Enquanto o cantiléver estiver afastado da superfície, ajuste a amplitude de excitação de modo que a amplitude do cantiléver seja de um a dois nanômetros, de pico a pico.Reduza progressivamente o ponto de ajuste em pequenos passos, até que a zona ZPA se estenda novamente em direção à superfície e a imagem original seja recuperada. Mantenha a amplitude do ponto de ajuste entre 75% e 95% da nova amplitude livre. Em seguida, reajuste os ganhos, pois ganhos mais altos podem ser utilizados em amplitudes mais baixas sem introduzir ruído significativo.Otimize o sistema para encontrar a melhor combinação de amplitude livre, ponto de ajuste e ganho para alta resolução. As condições ideais do sistema dependem da amostra, das propriedades de molhabilidade do líquido e também do cantiléver utilizado. Para interfaces solvofílicas, utilize cantiléveres com uma constante de mola de 0,5 a dois newtons por metro.Utilizando esta técnica, foram obtidas imagens com resolução subnanométrica em uma ampla variedade de amostras. As amostras moles mostradas aqui incluem uma bicamada lipídica, membranas roxas de Halobacterium salinarum, uma monocamada auto-organizada de dimoléculas anfifílicas e cristais de aquaporina de uma membrana de cristalino bovino. Em cada caso, as características de interesse são destacadas.As pequenas amplitudes de oscilação e os pontos de ajuste elevados minimizam a força exercida pela ponta sobre a amostra, permitindo que os frágeis arranjos auto-organizados de lipídios na bicamada, proteínas em biomembranas nativas e moléculas anfifílicas sejam imageados em solução sem danos. Materiais cristalinos mais duros, como calcita, titanato de estrôncio, carbeto de silício e íons metálicos individuais absorvidos em uma superfície de micaxa podem ser imageados usando esta abordagem, pois em todos os casos é o líquido interfacial que é efetivamente imageado, e não o cristal em si. Uma vez dominada, esta técnica fornece resolução em nível molecular ou atômico em meio líquido quase toda vez que é realizada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante ter em mente que a imagem é do líquido interfacial. Isso significa usar condições suaves de imageamento. A contaminação da ponta, da amostra ou do líquido geralmente é a principal causa de falha na obtenção de alta resolução.Se houver qualquer dúvida, geralmente é uma boa ideia limpar todas as superfícies em contato com o líquido e reutilizar as soluções de imagem. O ruído externo também é prejudicial à alta resolução. Um piso com baixa vibração, longe de um duto de ventilação, é preferível.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como otimizar seus parâmetros de imagem para obter uma AFM de alta resolução. É claro que, como ocorre com qualquer técnica avançada, pode ser necessário realizar várias tentativas para descobrir a melhor forma de imagens uma amostra, sendo a paciência essencial.

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Research

JoVE Journal

Engineering

Engenharia

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