Sub-nanômetros de imagem resolução com Amplitude modulação Microscopia de Força Atômica no líquido

O objetivo geral deste procedimento é obter a imagem com a mais alta resolução possível em líquido, utilizando um AFM comercial operado em modo de modulação de amplitude, também conhecido como modo tapping. Este método auxilia na ampliação dos limites da operação padrão de AFM em líquido, utilizando a melhor combinação de parâmetros para alta resolução. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada com a maioria dos AFMs comerciais, não exigindo, portanto, equipamentos especializados.

O método apresentado aqui destina-se a cientistas e técnicos que já possuem algum conhecimento básico de AFM, mas que desejam obter melhores resultados com a técnica. Este método não é voltado para nenhum tipo específico de amostra e pode ser amplamente aplicado a amostras das áreas de física, biologia, química, materiais e ciências aplicadas. Em geral, indivíduos novos nesta técnica enfrentarão dificuldades, pois é necessário ter paciência para encontrar os melhores parâmetros para uma determinada amostra.

Sonicar os instrumentos e o disco que sustenta o substrato em água ultrapura. Em seguida, com isopropanol e novamente com água ultrapura, por 10 minutos cada. Ao buscar alta resolução, qualquer contaminação pode ter consequências prejudiciais.

Use luvas em todo o momento e certifique-se de que todas as superfícies ou instrumentos que entrem em contato com a amostra, o cantiléver ou a célula de AFM sejam limpos completamente. Após a sonicação, seque cada um dos instrumentos e o disco da amostra sob fluxo de nitrogênio. Utilize um disco de aço como suporte para a mica, para imagens de íons metálicos absorvidos individualmente.

Limpe fisicamente as superfícies que não podem ser limpas por ultrassom, limpando-as com tecidos de baixa pelugem de uma única camada, umedecidos sequencialmente com água ultra pura, isopropanol e água ultra pura. Deixe a superfície secar ao ar por até 30 minutos. Em seguida, prepare uma pequena quantidade de cola epóxi misturando completamente os reagentes e coloque cerca de 10 microlitros da epóxi sobre o disco de amostra de aço limpo.

Coloque o substrato de mica sobre a resina epóxi e fixe-o ao disco de aço aplicando pressão sobre o substrato. Deixe a epóxi curar por várias horas em temperatura elevada, conforme as especificações do fabricante. Em seguida, pressione firmemente um pedaço de fita adesiva com 2,5 centímetros de largura sobre o substrato, de modo que toda a superfície fique coberta, e remova suavemente a camada superior.

Repita este processo duas a três vezes até que a mica fique visualmente espelhada. Mergulhe o chip do cantiléver em um banho de isopropanol, seguido por água ultra pura, durante 60 minutos cada. Em seguida, exponha a ponta à luz ultravioleta por até cinco minutos, a fim de favorecer a formação de sítios estáveis de hidratação.

Tempos mais longos de superexposição podem danificar a ponta ou aumentar seu raio de curvatura. Insira a alavanca no suporte de alavancas do AFM e pipete 25 microlitros do líquido de imagem sobre a alavanca e a ponta para pré-umedecer a superfície. Isso reduzirá o aparecimento de bolhas de ar ao se aproximar da amostra.

Derreta o disco da amostra e o substrato na platina da amostra e adicione uma gota do líquido de imagem à amostra. Em seguida, conecte o suporte do cantiléver ao AFM. Aproxime o cantiléver e a amostra o suficiente para formar uma ponte capilar entre os fluidos na ponta do cantiléver e os da amostra.

Utilize o software do AFM para alinhar o laser de medição próximo à extremidade da ponteira da alavanca. Em seguida, encontre a frequência de ressonância da alavanca a partir do pico principal em seu espectro térmico. Se a deflexão da alavanca estiver calibrada, o ajuste do pico de ressonância com um modelo de oscilador harmônico simples fornece a constante elástica da alavanca.

Em seguida, ajuste o microbalance ao encontrar sua resposta de amplitude quando excitado externamente por uma faixa de frequências próxima à frequência de ressonância identificada no espectro térmico. Ajuste a amplitude de excitação de modo que a amplitude de oscilação livre seja aproximadamente cinco nanômetros. Isso geralmente corresponde a 0,2–0,8 volts na maioria dos AFMs.

Em seguida, ajuste o ponto de amplitude para cerca de 80% da amplitude livre. Depois, configure os ganhos de realimentação relativamente altos. Após garantir que não ocorra instabilidade ou oscilação, defina a taxa de varredura inicial em aproximadamente um hertz e o tamanho da varredura em 10 nanômetros.

Inicie a aproximação da ponta em direção à superfície utilizando o software de controle do AFM. Avalie se a ponta atingiu a superfície sem iniciar a imagem, alterando ligeiramente o valor do ponto de ajuste. Se a ponta estiver na superfície, o efeito sobre a extensão da zona ZPA deve ser desprezível.

Uma vez que a ponta tenha atingido a superfície, recolha a zona ZPA e reajuste o cantiléver. A frequência de ressonância provavelmente terá mudado para um valor mais baixo devido às interações entre a ponta e a amostra. Agora, altere o ponto de ajuste para cerca de 80% da amplitude livre recém-ajustada e aproxime o cantiléver para realizar uma varredura de 10 por 10 nanômetros quadrados da superfície no modo de modulação de amplitude, a fim de verificar se os parâmetros de imageamento são adequados.

Verifique se os perfis de avanço e retorno se sobrepõem. Caso contrário, reduza ainda mais o ponto de ajuste e tente aumentar os ganhos. Se a imagem ficar ruidosa, diminua os ganos.

Repita a operação com uma região grande do tamanho de um a cinco micrômetros quadrados da amostra, caso isso seja possível. Em amostras macias ou biológicas, isso pode resultar em contaminação da ponta. Reduza o tamanho da varredura para um valor adequado para visualizar as características de interesse.

Isso pode ser tão pequeno quanto 20 por 20 nanômetros. Em seguida, reduza a amplitude de excitação do cantiléver o suficiente para que o laço de realimentação recolha automaticamente a zona ZPA, afastando a ponta da superfície. Enquanto o cantiléver estiver afastado da superfície, ajuste a amplitude de excitação de modo que a amplitude do cantiléver seja de um a dois nanômetros, de pico a pico.

Reduza progressivamente o ponto de ajuste em pequenos passos, até que a zona ZPA se estenda novamente em direção à superfície e a imagem original seja recuperada. Mantenha a amplitude do ponto de ajuste entre 75% e 95% da nova amplitude livre. Em seguida, reajuste os ganhos, pois ganhos mais altos podem ser utilizados em amplitudes mais baixas sem introduzir ruído significativo.

Otimize o sistema para encontrar a melhor combinação de amplitude livre, ponto de ajuste e ganho para alta resolução. As condições ideais do sistema dependem da amostra, das propriedades de molhabilidade do líquido e também do cantiléver utilizado. Para interfaces solvofílicas, utilize cantiléveres com uma constante de mola de 0,5 a dois newtons por metro.

Utilizando esta técnica, foram obtidas imagens com resolução subnanométrica em uma ampla variedade de amostras. As amostras moles mostradas aqui incluem uma bicamada lipídica, membranas roxas de Halobacterium salinarum, uma monocamada auto-organizada de dimoléculas anfifílicas e cristais de aquaporina de uma membrana de cristalino bovino. Em cada caso, as características de interesse são destacadas.

As pequenas amplitudes de oscilação e os pontos de ajuste elevados minimizam a força exercida pela ponta sobre a amostra, permitindo que os frágeis arranjos auto-organizados de lipídios na bicamada, proteínas em biomembranas nativas e moléculas anfifílicas sejam imageados em solução sem danos. Materiais cristalinos mais duros, como calcita, titanato de estrôncio, carbeto de silício e íons metálicos individuais absorvidos em uma superfície de micaxa podem ser imageados usando esta abordagem, pois em todos os casos é o líquido interfacial que é efetivamente imageado, e não o cristal em si. Uma vez dominada, esta técnica fornece resolução em nível molecular ou atômico em meio líquido quase toda vez que é realizada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante ter em mente que a imagem é do líquido interfacial. Isso significa usar condições suaves de imageamento. A contaminação da ponta, da amostra ou do líquido geralmente é a principal causa de falha na obtenção de alta resolução.

Se houver qualquer dúvida, geralmente é uma boa ideia limpar todas as superfícies em contato com o líquido e reutilizar as soluções de imagem. O ruído externo também é prejudicial à alta resolução. Um piso com baixa vibração, longe de um duto de ventilação, é preferível.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como otimizar seus parâmetros de imagem para obter uma AFM de alta resolução. É claro que, como ocorre com qualquer técnica avançada, pode ser necessário realizar várias tentativas para descobrir a melhor forma de imagens uma amostra, sendo a paciência essencial.