Sub-nanômetros de imagem resolução com Amplitude modulação Microscopia de Força Atômica no líquido

O objetivo geral deste procedimento é alcançar a imagem de imagem mais alta possível da definição no líquido, com um AFM comercial operado e a amplitude-modulação, igualmente conhecida como a modalidade de batida. Este método ajuda a empurrar o limite da operação padrão do AFM no líquido, usando a melhor combinação de parâmetros para a alta resolução. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada com a maioria dos AFMs comerciais e, como tal, não requer nenhum equipamento especializado.

O método apresentado aqui é destinado a cientistas e técnicos que já possuem algum conhecimento básico de AFM, mas gostariam de tirar mais proveito da técnica. Este método não se destina a nenhum tipo específico de amostra e pode ser amplamente aplicado a amostras de física, biologia, química, materiais e ciências de serviço. Geralmente, indivíduos novos nessa técnica terão dificuldades, porque requer um pouco de paciência para encontrar os melhores parâmetros para uma determinada amostra.

O banho sonicate os instrumentos, e o disco que sustenta a carcaça na água ultra pura. Seguido de isopropanol e novamente água ultrapura, cada um por 10 minutos. Ao buscar alta resolução, qualquer contaminação pode ter consequências prejudiciais.

Use luvas o tempo todo e certifique-se de que todas as superfícies ou instrumentos que entrem em contato com a amostra, balanço ou célula AFM sejam completamente limpos. Após a sonicação, secar cada um dos instrumentos e o disco de recolha sob um fluxo de azoto. Use um disco de aço como suporte para mica, para obter imagens de íons metálicos absorvidos únicos.

Limpe fisicamente as superfícies que não podem ser limpas por sonicação, limpando-as com lenços de papel de baixa emissão de fiapos embebidos em água ultrapura, isopropanol e água ultrapura sequencialmente. Deixe a superfície secar ao ar por até 30 minutos. Em seguida, prepare uma pequena quantidade de cola epóxi misturando bem os reagentes e coloque cerca de 10 microlitros de epóxi no disco de amostra de aço limpo.

Coloque o substrato de mica no epóxi e fixe-o no disco de aço aplicando pressão no substrato. Deixe o epóxi curar por várias horas a uma temperatura elevada de acordo com as especificações do fabricante. Em seguida, pressione firmemente um pedaço de fita adesiva de 2,5 centímetros de largura no substrato, de modo que todo o rosto fique coberto, e retire suavemente a camada superior.

Repita esse processo duas a três vezes até que a mica fique lisa aos olhos. Mergulhe o cavaco cantilever em um banho de isapropanol seguido de água ultrapura por 60 minutos. Em seguida, exponha a ponta à luz ultravioleta por até cinco minutos para favorecer a formação de locais de hidratação estáveis.

Tempos de superexposição mais longos podem danificar a ponta ou aumentar seu raio de curvatura. Introduza o modilhão no suporte do modilhão do AFM, e pipete 25 microlitros do líquido da imagem latente no modilhão e na ponta para pre molhar a superfície. Isso reduzirá a aparência de bolhas de ar ao se aproximar da amostra.

Derreta o disco de amostra e o substrato no estágio de amostra e adicione uma gota do líquido de imagem à amostra. Em seguida, conecte o suporte cantilever ao AFM. Aproxime o cantilever e a amostra, de modo a formar uma ponte capilar entre os fluidos da ponta do cantilever e os da amostra.

Use o software do AFM para alinhar o laser de medição perto da extremidade da ponta do cantilever. Em seguida, encontre a frequência de residência do cantilever a partir do pico principal em seu espectro térmico. Se a deflexão do cantilever for calibrada, o ajuste do pico de residência com um modelo de oscilador harmônico simples produz a constante de mola do cantilever.

Em seguida, ajuste o cantilever encontrando sua resposta de amplitude quando conduzido externamente em uma faixa de frequências próxima à frequência de ressonância identificada no espectro térmico. Ajuste a amplitude de condução para que a amplitude de oscilação livre seja de aproximadamente cinco nanômetros. Isto corresponde tipicamente com 0.2-0.8 volts na maioria de AFM.

Em seguida, ajuste o ponto de ajuste de amplitude para cerca de 80% da amplitude livre. Em seguida, defina os ganhos de feedback relativamente altos. Depois de garantir que não ocorra instabilidade ou toque, defina a taxa de varredura inicial para cerca de um hertz e o tamanho da varredura para 10 nanômetros.

Inicie a aproximação da ponta à superfície usando o software de controle AFM. Avalie se a ponta atingiu a superfície sem começar a criar imagens, alterando ligeiramente o valor do ponto de ajuste. Se a ponta estiver na superfície, o efeito na extensão da zona ZPA deve ser insignificante.

Assim que a ponta atingir a superfície, retraia a zona ZPA e reajuste o cantilever. A frequência de ressonância provavelmente terá mudado para um valor mais baixo devido às interações da amostra da ponta. Agora, altere o ponto de ajuste para cerca de 80% da amplitude livre recém-ajustada e acione o cantilever para realizar uma varredura quadrada de 10 por 10 nanômetros da superfície no modo de modulação de amplitude para verificar se os parâmetros de imagem são adequados.

Verifique se os perfis de rastreamento e retrocesso se sobrepõem. Caso contrário, reduza ainda mais o ponto de ajuste e tente aumentar os ganhos. Se a imagem ficar ruidosa, diminua os ganhos.

Repita a operação com uma grande região quadrada de um a cinco micrômetros da amostra, desde que isso seja possível. Em amostras moles ou biológicas, isso pode resultar em contaminação da ponta. Reduza o tamanho da digitalização para um valor adequado para visualizar os recursos de interesse.

Isso pode ser tão baixo quanto 20 por 20 nanômetros. Em seguida, reduza a amplitude de acionamento do cantilever o suficiente para que o loop de feedback retraia automaticamente a zona ZPA, aprimore a ponta da superfície. Enquanto o cantilever estiver longe da superfície, ajuste a amplitude do inversor para que a amplitude do cantilever seja de um a dois nanômetros pico a pico.

Reduza progressivamente o ponto de ajuste em pequenos passos, até que a zona ZPA se estenda novamente em direção à superfície e a imagem original seja recuperada. Mantenha a amplitude do ponto de ajuste entre 75% e 95% da nova amplitude livre. Em seguida, reajuste os ganhos, pois ganhos mais altos podem ser usados em amplitudes mais baixas sem introduzir ruído significativo.

Otimize o sistema para encontrar a melhor combinação de amplitude livre, ponto de ajuste e ganho para alta resolução. As condições ideais do sistema dependem da amostra, das propriedades de umedecimento do líquido e também do cantilever que está sendo usado. Para interfaces solvofílicas, use cantilevers com uma constante de mola de 0,5 a dois newtons por metro.

Usando esta técnica, imagens de resolução subnanométrica foram obtidas em uma ampla gama de amostras. As amostras macias mostradas aqui incluem uma bicamada lipídica, membranas roxas de halobacterium salinarum, uma monocamada automontada de dimoléculas anfofílicas e cristais de aquaporina de uma membrana de lente bovina. Em cada caso, as características de interesse são destacadas.

As pequenas amplitudes de oscilação e os altos pontos de ajuste minimizam a força exercida pela ponta na amostra, permitindo que as frágeis auto-montagens de lipídios na bicamada, proteínas em biomembranas nativas e moléculas anfofílicas sejam visualizadas em solução sem danos. Materiais cristalinos mais duros, como calcita, titanita de estrôncio, carboneto de silício e íons metálicos únicos absorvidos em uma superfície de mica, podem ser visualizados usando essa abordagem, porque em todos os casos, é o líquido interfacial que é efetivamente fotografado, não o próprio cristal. Uma vez dominada, essa técnica fornece resolução de nível molecular ou atômico em líquido quase todas as vezes que é executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente que é o líquido interfacial que está sendo fotografado. Isso significa usar condições de imagem suaves. A contaminação da ponta, da amostra ou do líquido geralmente é a principal causa de não atingir alta resolução.

Em caso de dúvida, muitas vezes é uma boa ideia limpar todas as superfícies em contato com o líquido e reutilizar as soluções de imagem. O ruído externo também é prejudicial à alta resolução. Um piso de baixa vibração, longe de um duto de ventilação, é melhor.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como otimizar seus parâmetros de imagem para obter AFM de alta resolução. É claro que, como para qualquer técnica de ponta, pode levar vários testes para descobrir a melhor forma de obter a imagem de uma amostra, portanto, a paciência é fundamental.