Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

O objetivo geral do experimento a seguir é medir o módulo de elasticidade de células vivas utilizando um microscópio de força atômica. Isso é alcançado primeiramente realizando medições de espectroscopia de força em modo FM em várias localizações na célula. Como segundo passo, cada curva força-distância é analisada para determinar o ponto em que a ponteira do microscópio de força atômica entra em contato inicial com a célula.

Em seguida, a partir do ponto de contato, os primeiros 200 a 300 nanômetros de dados de indentação são ajustados ao modelo de Hertz. Para extrair o módulo elástico, os resultados fornecem um mapa 2D da rigidez celular obtido por meio do modo de mapeamento de força, no qual cada pixel representa uma curva individual de distância-força. Demonstrando o procedimento estará Guen Thomas, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, limpe o suporte da ponteira com etanol a 70% e deixe secar.

Em seguida, carregue um cantiléver bru DNP 10 no A FM de acordo com as instruções do fabricante. Depois, calibre a sensibilidade inversa do alavanca óptica. Este parâmetro descreve a quantidade de resposta do fotodiodo em volts por nanômetro de deflexão do cantiléver.

Para realizar isso, carregue inicialmente uma lâmina de vidro limpa na platina da amostra. Instale a cabeça de FM e ajuste o feixe a laser e o alinhamento de acordo com as instruções do fabricante. Após o alinhamento, posicione a ponta de FM sobre a lâmina de vidro com o P oito O recolhido.

Reposicione o espelho para uma leitura do fotodiodo de menos dois volts. Em seguida, realize uma medição de espectroscopia de força com uma resposta máxima do fotodiodo ou ponto de gatilho de mais dois volts. Após a aquisição de dados ser concluída, amplie a região de contato firme da curva de força e realize um ajuste linear a essa região.

Para encontrar a inclinação em volts por nanômetro, em seguida redefina o alinhamento do espelho para uma deflexão livre de zero volts. A seguir, calibre a constante da mola do cantiléver utilizando o método de ajuste térmico descrito por Levy e Malam. Para começar, eleve o scanner afastando-o da platina da amostra, de modo que não haja interações entre a ponta e a amostra.

Em seguida, capture os dados térm游戏副本

Para preparar o microscópio de força atômica (FM) para as placas de cultura, instale um acessório aquecedor de placa na platina do FM e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius. Aguarde 20 minutos para que o sistema atinja um equilíbrio térmico estável. Após o pré-aquecimento, coloque uma placa de cultura na platina do FM e fixe-a utilizando o grampo fornecido com o aquecedor de placa; para medições superiores a 30 minutos, deve-se utilizar meio independente de dióxido de carbono em substituição ao meio de cultura normal.

Em seguida, aplique uma pequena gota de meio de cultura a 37 graus Celsius na ponta do cantilever de FM-a e abaixe a cabeça de FM-a até que a ponta fique levemente submersa no líquido. Utilizando uma câmera CCD com vista superior, realinhe o feixe de laser sobre o cantilever. O alinhamento no líquido será diferente do que no ar, devido à mudança no índice de refração do meio.

Uma vez alinhado, posicione a ponta AFM em uma área livre de células da placa de cultura e realize a calibração da sensibilidade inversa da alavanca óptica no ambiente líquido. Para iniciar as medições das propriedades mecânicas das células, posicione a ponta do cantiléver acima da região do olho de perla de uma célula com a ajuda de um microscópio óptico. Ajustes precisos da posição do cantiléver são realizados aplicando deslocamentos aos scanners X e Y.

Em seguida, altere o microscópio de força atômica para o modo espectroscopia em quatro pontos e defina a taxa de indentação em cinco micrômetros por segundo, o que é suficientemente baixo para evitar efeitos hidrodinâmicos. A seguir, defina o ponto de gatilho de deflexão em dois nano newtons. Para evitar danificar as células, ajuste esse valor de acordo com a rigidez da amostra.

Além disso, selecione a opção de disparo relativo, que corrigirá qualquer deriva no sinal de deflexão. Em seguida, defina a distância de força em cinco micrômetros para garantir que a ponta esteja completamente destacada da célula entre as medições de força. Colete três curvas de força em locais diferentes na região do núcleo de pelo menos 30 células para cada condição.

Embora seja benéfico obter múltiplas curvas em cada célula, para dados estatísticos confiáveis, obter um número excessivo pode provocar alterações na rigidez celular devido ao estresse causado pela sonda de microscopia de força atômica (AFM). Caracterize ainda mais a distribuição das propriedades mecânicas em toda uma única célula utilizando o modo de mapa de força.

No modo de mapa de força, defina o tamanho de varredura como 30 micrômetros, a resolução como 32 por 32 e os parâmetros de indentação iguais aos selecionados para curvas de força individuais. O MF-A então registrará curvas de força individuais em cada pixel da região da amostra e fornecerá um mapa de rigidez de toda a região. Em seguida, analise as curvas de força registradas usando MATLAB para calcular a rigidez celular.

Comece adotando um algoritmo publicado inicialmente por Lynette Al, que calcula um ajuste linear e um ajuste de Hertz a partir de cada ponto usando o Matlab. Calcule o erro RMS relativo de ambos os ajustes e some esses valores em cada ponto. O ponto que apresenta o erro de ajuste total mínimo é selecionado como o ponto inicial de contato; a localização desse ponto é crucial para a medição precisa do módulo de Young das células.

Em seguida, calcule a deformação da amostra delta. Utilize as equações a seguir, considerando que a deformação é igual a zero antes do contato com a célula, onde Z é menor que Z zero, e é igual à diferença entre a deflexão da alavanca D e a distância total Z após o ponto de contato. Em seguida, calcule a força de indentação F utilizando as equações a seguir, onde a força é igual a zero antes do contato com a célula, onde Z é menor que Z zero, e é igual à constante elástica K da alavanca multiplicada pela deflexão da alavanca após o ponto de contato.

Ajusta-se então o quadrado de Elise aos dados de deformação da amostra versus força de indentação na região pós-contato do modelo de Hertz, a fim de extrair o módulo de Young da célula com base na forma da ponta utilizada, conforme mostrado. Abaixo, há curvas de força representativas obtidas de três células de fibroblasto T3 cultivadas sobre três superfícies diferentes. Como é possível observar aqui, diferentes superfícies podem influenciar grandemente a rigidez do citoesqueleto celular.

A deformação média de células cultivadas em uma superfície plástica dura é mostrada em vermelho. As cultivadas em um gel de poliacrilamida rígido são mostradas em roxo, e as cultivadas em um gel de poliacrilamida elástico são mostradas em azul. Após identificar cuidadosamente os pontos de contato nas curvas, as forças de indentação em função da deformação celular podem ser precisamente representadas.

Além disso, seu módulo de Young pode ser calculado com precisão a partir dos primeiros 300 nanômetros de indentação após o contato. É mostrado aqui um fibroblasto que foi transfectado com proteína verde fluorescente marcada com mentona, um tipo de filamento intermediário. Quanto mais brilhante a imagem, maior a quantidade de mentona nessa região.

Isso pode estar relacionado à rigidez do citoesqueleto celular. Utilizando a técnica de mapeamento de força por MF-A apresentada aqui, é possível obter um mapa de rigidez semelhante de um fibroblasto, com resolução de 32 por 32 pixels, em que cada pixel representa 2,5 por 2,5 micrômetros de área superficial celular. Após assistir a este vídeo, você terá uma boa ideia de como usar a microscopia de força atômica para medir a elasticidade de células de tecidos vivos.