Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

O objetivo geral do experimento a seguir é medir o módulo de elasticidade de células vivas usando um microscópio de força atômica. Isso é conseguido realizando primeiro medições de espectroscopia de força FM em vários locais da célula. Como segundo passo, cada curva de distância forçada é analisada para determinar o ponto onde a ponta A FM inicialmente faz contato com a célula.

Em seguida, começando no ponto de contato, os primeiros 200 a 300 nanômetros de dados de indentação são ajustados ao modelo hertz. Para extrair o módulo de elasticidade, os resultados produzem um mapa 2D da rigidez celular obtido usando o modo de mapeamento de força, onde cada pixel representa uma única curva de distância forçada. Para iniciar este procedimento, limpe o suporte do cantilever com etanol 70% e deixe secar.

Em seguida, carregue um cantilever bru DNP 10 no A FM de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, calibre a sensibilidade inversa da alavanca óptica. Este parâmetro descreve a quantidade de resposta do fotodiodo em volts por nanômetro de deflexão do cantilever.

Para realizar isso, primeiro carregue um vidro limpo deslize para o estágio de amostra. Instale o cabeçote FM e ajuste o feixe de laser e o alinhamento de acordo com as instruções do fabricante. Uma vez alinhada, engate a ponta A FM na corrediça de vidro com o P oito O retirado.

Realinhe o espelho para uma leitura de fotodiodo de dois volts negativos. Em seguida, execute uma medição de espectroscopia de força com uma resposta máxima de fotodiodo ou ponto de disparo de dois volts positivos. Após a conclusão da aquisição de dados, amplie a região de contato firme da curva de força e execute um ajuste linear a essa região.

Para encontrar a inclinação em volts por nanômetro, redefina o alinhamento do espelho para uma deflexão livre de zero volts. Em seguida, calibre a constante da mola cantilever usando o método de ajuste térmico descrito por levy e Malam. Para começar, afaste o scanner do estágio de amostra para que não haja interações entre a ponta e a amostra.

Em seguida, capture os dados térmicos registrando a vibração térmica do feixe cantilever. O software A FM analisa um espectro de potência de tal vibração térmica e o plota em uma janela de dados. Em seguida, execute um ajuste ao segmento de dados centralizado na frequência mais baixa, também conhecido como pico de ressonância fundamental, para determinar a constante da mola.

Para preparar o a FM para as placas de cultura, instale um acessório aquecedor de louça no estágio de FM e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius. Aguarde 20 minutos para que o sistema atinja um equilíbrio térmico estável. Uma vez pré-aquecido, coloque uma placa de cultura no estágio FM e prenda-a usando o clamp fornecido com o aquecedor de louça para medições superiores a 30 minutos, o meio independente de dióxido de carbono deve ser usado para substituir o meio de cultura normal.

Em seguida, aplique uma pequena gota de meio de cultura de 37 graus Celsius na ponta do cantilever A FM e abaixe a cabeça de um FM até que a ponta esteja submersa em líquido. Usando uma câmera CCD de visão superior, realinhe o feixe de laser no cantilever. O alinhamento no líquido será diferente de um ar devido à mudança no índice de refração do meio.

Uma vez alinhada, engate a ponta A FM em uma área livre de células da placa de cultura e execute a calibração da sensibilidade da alavanca óptica inversa no ambiente líquido. Para iniciar as medições das propriedades mecânicas das células, posicione a ponta do cantilever acima da região do olho perle de uma célula com o auxílio de um microscópio óptico. Ajustes precisos da posição dos cantilevers são realizados aplicando deslocamentos aos scanners X e Y.

Em seguida, mude o FM para o modo de quatro espectroscopias e defina a taxa de indentação em cinco micrômetros por segundo, o que é baixo o suficiente para evitar efeitos hidrodinâmicos. Em seguida, defina o ponto de disparo de deflexão para dois nano newtons. Para evitar danos às células, ajuste este valor de acordo com a rigidez da amostra.

Além disso, selecione a opção de disparo relativa, que corrigirá qualquer desvio no sinal de deflexão. Em seguida, defina a distância de força em cinco micrômetros para garantir que a ponta seja totalmente separada da célula entre as medições de força. Colete três curvas de força em diferentes locais na região dos núcleos de pelo menos 30 células para cada condição.

Embora seja benéfico fazer várias curvas em cada célula. Para dados estatísticos confiáveis, tomar muitos pode levar a alterações na rigidez celular para o desgaste da sonda A FM. Caracterize ainda mais a distribuição das propriedades mecânicas em uma única célula usando o modo de mapa de força.

No modo de mapa de força, defina o tamanho da varredura para 30 micrômetros, a resolução para 32 por 32 e os parâmetros de recuo são os mesmos selecionados para curvas de força única. O A FM então fará curvas de força única em cada pixel na região da amostra e fornecerá um mapa de rigidez de toda a região. Em seguida, analise as curvas de força registradas usando o MATLAB para calcular a rigidez da célula.

Comece adotando um algoritmo publicado pela primeira vez por Lynette Al, que calcula um ajuste linear e um ajuste hertz de cada ponto usando o matlab. Calcule o erro RMS relativo de ambos os ajustes e some esses valores em cada ponto. O ponto que atinge o erro total mínimo de ajuste é selecionado como o ponto inicial de contato, a localização desse ponto é crucial para a medição precisa do módulo de adaptação das células jovens.

Em seguida, calcule o delta de deformação da amostra. Usando as seguintes equações, com a deformação é igual a zero antes do contato com a célula, onde Z é menor que Z zero e é igual à diferença entre a deflexão do balanço D e a distância total Z além do ponto de contato. Em seguida, calcule a força de recuo F usando as seguintes equações, onde a força é igual a zero antes do contato da célula, onde Z é menor que Z zero e é igual à constante de mola K do cantilever multiplicada pela deflexão do cantilever além do ponto de contato.

O ajuste do quadrado de Elise é então aplicado aos dados de deformação da amostra versus força de recuo na região pós-contato do modelo hertz, a fim de extrair o módulo de Young da célula com base na forma da ponta usada mostrada. Aqui estão as curvas de força representativas retiradas de três células T três de fibra cultivadas em três superfícies diferentes. Como você pode ver aqui, diferentes superfícies podem influenciar muito a rigidez do citoesqueleto celular.

A deformação média das células cultivadas em uma superfície de plástico duro é mostrada em vermelho. Aqueles cultivados em um gel de poliacrilamida rígida são mostrados em roxo, e aqueles cultivados em um gel elástico de poliacrilamida são mostrados em azul. Depois de identificar cuidadosamente os pontos de contato nas curvas, as forças de recuo em função da deformação celular podem ser mostradas com precisão.

Além disso, o modular de Young, I pode ser calculado com precisão a partir dos primeiros 300 nanômetros de recuo após o contato. Aqui é mostrado um fibroblasto que foi transfectado com proteína fluorescente verde marcada com menton, um tipo de filamento intermediário. Quanto mais brilhante a imagem, mais menção está nessa região.

Isso pode estar relacionado à rigidez do citoesqueleto celular. Usando a técnica de mapeamento de força A FM apresentada aqui, é possível mostrar um mapa de rigidez semelhante de um fibroblasto com uma resolução de 32 por 32 pixels, onde cada pixel representa 2,5 por 2,5 mícrons de área de superfície celular. Depois de assistir a este vídeo, ele terá uma boa ideia de como usar a microscopia de força atômica para medir a elasticidade das células vivas dos tecidos.