Microscopia TIRF para visualizar a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos

Os monômeros de actina polimerizam da cabeça à cauda para formar fibras finas, chamadas microfilamentos. Da mesma forma, os dímeros de tubulina polimerizam em microtúbulos cilíndricos ocos mais longos. Esses componentes do citoesqueleto mantêm a forma celular e facilitam a motilidade celular.

Para visualizar a dinâmica do acoplamento actina-microtúbulo por microscopia de reflexão interna total, TIRF, faça um conjunto de imagem personalizado.

O conjunto de imagem consiste em duas lamínulas: uma lamínula superior revestida com silano m-PEG e uma lamínula inferior revestida com biotina-PEG silano. As duas lamínulas são espaçadas longitudinalmente com fita adesiva dupla face e seladas em ambas as extremidades para criar um canal de fluxo.

Pipete BSA no canal de fluxo para preparar a câmara. Adicione a solução de estreptavidina e incuba. As moléculas de estreptavidina se ligam às moléculas de biotina ligadas ao PEG-silano da lamínula inferior.

Flua o buffer TIRF para o canal. Adicione uma solução de mistura de citoesqueleto contendo dímeros de tubulina não marcados e marcados com fluoróforo verde, juntamente com monômeros de actina marcados com fluoróforo não marcados, marcados com biot