Microscopia TIRF para visualizar a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos

Os monômeros de actina polimerizam da cabeça à cauda para formar fibras finas, chamadas microfilamentos. Da mesma forma, os dímeros de tubulina polimerizam em microtúbulos cilíndricos ocos mais longos. Esses componentes do citoesqueleto mantêm a forma celular e facilitam a motilidade celular.

Para visualizar a dinâmica do acoplamento actina-microtúbulo por microscopia de reflexão interna total, TIRF, faça um conjunto de imagem personalizado.

O conjunto de imagem consiste em duas lamínulas: uma lamínula superior revestida com silano m-PEG e uma lamínula inferior revestida com biotina-PEG silano. As duas lamínulas são espaçadas longitudinalmente com fita adesiva dupla face e seladas em ambas as extremidades para criar um canal de fluxo.

Pipete BSA no canal de fluxo para preparar a câmara. Adicione a solução de estreptavidina e incuba. As moléculas de estreptavidina se ligam às moléculas de biotina ligadas ao PEG-silano da lamínula inferior.

Flua o buffer TIRF para o canal. Adicione uma solução de mistura de citoesqueleto contendo dímeros de tubulina não marcados e marcados com fluoróforo verde, juntamente com monômeros de actina marcados com fluoróforo não marcados, marcados com biotina e marcados com fluoróforo roxo.

Em seguida, adicione uma solução de reação contendo ATP - agente promotor de polimerização de actina e GTP - agente promotor de polimerização de tubulina e proteína de acoplamento actina-microtúbulo. Incubar.

Os dímeros de tubulina se ligam às moléculas de GTP e polimerizam, enquanto os monômeros de actina se ligam às moléculas de ATP e polimerizam para formar microtúbulos e microfilamentos, respectivamente.

Coloque o conjunto de imagem sob um microscópio TIRF. Excite os fluoróforos com lasers de comprimentos de onda apropriados.

A luz de excitação reflete internamente e cria um campo de luz que ilumina seletivamente os fluoróforos em uma região limitada próxima à interface vidro-água, onde existem dois meios com diferentes índices de refração. Nesta região, os microfilamentos aparecem roxos e os microtúbulos aparecem verdes.

Corte 12 tiras de fita dupla face e dupla face, com um comprimento de 24 milímetros. Remova um lado do suporte da fita e fixe pedaços de fita adjacentes às seis ranhuras presentes em uma câmara de imagem limpa. Remova o segundo pedaço de fita adesiva, para expor o lado adesivo da fita ao longo de cada ranhura da câmara, e coloque a câmara, com a fita voltada para cima, em uma superfície limpa.

Misture as soluções de resina epóxi e endurecedor, uma a uma, em um pequeno barco de pesagem, e use uma ponta P1000 para colocar uma gota de epóxi misturado entre as tiras de fita no final de cada ranhura da câmara de imagem. Em seguida, coloque a fita da câmara, ou o lado epóxi para cima, em uma superfície limpa.

Remova uma lamínula revestida da incubadora de 70 graus Celsius e enxágue as superfícies revestidas e não revestidas das lamínulas com água bidestilada seis vezes. Seque com gás nitrogênio filtrado e, em seguida, fixe na câmara de imagem, com o lado do revestimento da lamínula voltado para a fita.

Use uma ponta de pipeta P200 ou P1000 para aplicar pressão na interface fita-vidro, para garantir uma boa vedação entre a fita e a lamínula. Incube as câmaras montadas em temperatura ambiente por pelo menos cinco a 10 minutos, para permitir que o epóxi sele totalmente as paredes da câmara antes do uso.

As câmaras de perfusão expiram dentro de 12 a 18 horas após a montagem. Use uma bomba de perfusão e troque sequencialmente as soluções de condicionamento na câmara de perfusão, fluindo 50 microlitros de BSA a 1% para preparar a câmara de imagem.

Remova o excesso de buffer do reservatório de encaixe Luer-lock. Em seguida, flua 50 microlitros de 0,005 miligramas por mililitro de estreptavidina e incube por um a dois minutos em temperatura ambiente. Remova o excesso de buffer do reservatório.

Fluxo de 50 microlitros de BSA a 1% para bloquear a ligação inespecífica e incubar por 10 a 30 segundos. Remova o excesso de buffer do reservatório. Em seguida, fluxo 50 microlitros de tampão TIRF 1x quente e, em seguida, 50 microlitros de sementes de microtúbulos estabilizados e 50% biotinilados, diluídos em tampão 1x TIRF.

Defina o stage ou dispositivo aquecedor objetivo para manter a temperatura de 35 a 37 graus Celsius por 30 minutos, antes de obter a imagem da primeira reação bioquímica. Em seguida, defina o intervalo de aquisição para a cada cinco segundos, por 15 a 20 minutos. Em seguida, defina as exposições de laser 488 e 647 para 50 a 100 milissegundos com 5% a 10% da potência, ajustando primeiro a reação de polimerização para iniciar o conjunto do filamento de actina.

Adquira as imagens em 647 nanômetros e faça os ajustes apropriados. Em seguida, ajuste a reação de polimerização em um segundo poço de perfusão condicionado, para iniciar a montagem dos microtúbulos. Visualize em 488 nanômetros e faça os ajustes apropriados.

Combine três microlitros de tubulina 488 micromolar de 10 com a alíquota de 7,2 microlitros de tubulina não marcada com fluorescência de 100 micromolares, não mais do que 15 minutos antes do uso. Em seguida, combine três microlitros de actina biotinilada diluída em volumes apropriados de actina fluorescente não marcada e marcada, de modo que a mistura final seja de 12,5 micromolares de actina total, com 10% a 30% de marcação fluorescente.

Prepare a mistura de citoesqueleto combinando dois microlitros do estoque de mistura de actina de 12,5 micromolares com a mistura de estoque de tubulina, não mais do que 15 minutos antes da imagem. Guarde no gelo até o uso.

Prepare a mistura de reação proteica combinando todos os outros componentes e proteínas experimentais, incluindo tampão TIRF 2x, anti-alvejante, nucleotídeos, tampões e proteínas acessórias. Incubar a mistura de citoesqueleto na mistura de reação de proteína separadamente, a 37 graus Celsius por 30 a 60 segundos.

Para iniciar a reação, adicione o conteúdo da mistura de reação proteica à mistura de citoesqueleto e misture. Fluxo de 50 microlitros da mistura de reação contendo 1x tampão TIRF suplementado com 15 tubulinas livres micromolares, um GTP milimolar, monômeros de actina 0,5 micromolar e volumes apropriados de controles tampão para a câmara de perfusão.

Grave um filme em time-lapse usando um software de microscópio, para adquirir a cada cinco segundos, por 15 a 20 minutos. Condicione bem uma nova perfusão e substitua o volume do tampão pela proteína reguladora de interesse e controles do tampão. Adquira para avaliar as proteínas reguladoras para as funções emergentes dos microtúbulos de actina.