Microscopia de reflexão de interferência para visualização sem rótulos da dinâmica dos microtúbulos

A microscopia de reflexão de interferência permite a imagem de microtúbulos que crescem e encolhem dinamicamente.

Fixe tiras de parafina em uma lamínula e coloque uma lamínula um pouco menor por cima. Aqueça para derreter a parafina, formando um canal selado. Pipete uma solução contendo anticorpos através do canal. Os anticorpos se ligam à superfície da lamínula. Adicione uma solução de bloqueio, bloqueando as regiões não ligadas ao anticorpo e impedindo a ligação de proteínas não específicas.

Coloque a lamínula no microscópio stage. Ajuste o sample aquecedor a uma temperatura que facilite o crescimento dos microtúbulos.

Pipetar sementes de microtúbulos estabilizadas com trifosfato de guanosina não hidrolisável, GTP, análogo. As sementes se ligam à lamínula revestida com anticorpos. Adicione um tampão contendo tubulina não marcada, GTP e agentes redutores.

Em condições ideais de temperatura e tampão, as sementes atuam como locais de nucleação, permitindo a ligação da tubulina não marcada e o crescimento dos microtúbulos.

Comece a criar imagens. A luz incidente focaliza através de um diafragma de abertura em um divisor de feixe que reflete parcialmente a luz para a objetiva, ilumina