Microscopia de reflexão de interferência para visualização sem rótulos da dinâmica dos microtúbulos

A microscopia de reflexão de interferência permite a imagem de microtúbulos que crescem e encolhem dinamicamente.

Fixe tiras de parafina em uma lamínula e coloque uma lamínula um pouco menor por cima. Aqueça para derreter a parafina, formando um canal selado. Pipete uma solução contendo anticorpos através do canal. Os anticorpos se ligam à superfície da lamínula. Adicione uma solução de bloqueio, bloqueando as regiões não ligadas ao anticorpo e impedindo a ligação de proteínas não específicas.

Coloque a lamínula no microscópio stage. Ajuste o sample aquecedor a uma temperatura que facilite o crescimento dos microtúbulos.

Pipetar sementes de microtúbulos estabilizadas com trifosfato de guanosina não hidrolisável, GTP, análogo. As sementes se ligam à lamínula revestida com anticorpos. Adicione um tampão contendo tubulina não marcada, GTP e agentes redutores.

Em condições ideais de temperatura e tampão, as sementes atuam como locais de nucleação, permitindo a ligação da tubulina não marcada e o crescimento dos microtúbulos.

Comece a criar imagens. A luz incidente focaliza através de um diafragma de abertura em um divisor de feixe que reflete parcialmente a luz para a objetiva, iluminando a amostra. A interface de buffer de vidro da lamínula reflete parcialmente a luz incidente. A luz incidente restante passa e é refletida nas interfaces tampão-microtúbulo.

Com base na distância entre microtúbulos e lamínulas, os feixes refletidos das duas interfaces interferem, produzindo interferência construtiva - feixes combinados para produzir um sinal brilhante ou interferência destrutiva - feixes cancelando para produzir um sinal escuro.

Visualize os microtúbulos como imagens de alto contraste. Capture imagens de lapso de tempo, detectando o crescimento e o encolhimento dos microtúbulos.

Para começar, insira um espelho 50/50 na roda do filtro de um microscópio fluorescente usando um cubo de filtro apropriado. Manuseie o espelho com cuidado, pois sempre eles têm um revestimento antirreflexo. Transforme-se em uma objetiva de alta ampliação que também tenha uma abertura numérica alta. O mostrado aqui é uma objetiva de óleo de 100x com uma abertura numérica de 1,3.

Em seguida, use uma lâmina de barbear e uma lâmina de microscópio como uma borda reta para cortar tiras de filme plástico de parafina de 3 milímetros de largura. Coloque duas das tiras de filme de parafina de plástico separadas por 3 milímetros em uma lamínula limpa de 22 por 22 milímetros. Em seguida, coloque uma lamínula de 18 por 18 milímetros no topo das tiras para formar um canal.

Transfira a lamínula para um bloco de calor a 100 graus Celsius por 10 a 30 segundos para que o filme de parafina forme um canal selado. Usando uma pipeta, flua 50 microgramas por mililitro de um anticorpo anti-rodamina por perfusão e incube a lâmina por 10 minutos.

Após a incubação, lave o canal cinco vezes usando BRB80 filtrado. Em seguida, flua em 1% de poloxâmero 407 no BRB80 filtrado para bloquear a superfície contra ligações inespecíficas e incube a lâmina por 10 minutos. Novamente, lave o canal cinco vezes usando o BRB80 filtrado.

Para evitar que a amostra seque, adicione duas gotículas do BRB80 filtrado nas extremidades do canal e adicione mais tampão conforme necessário. Coloque a amostra no microscópio stage e ligue a fonte de luz de epi-iluminação. Concentre-se na borda do filme de parafina para encontrar a superfície da amostra e, em seguida, mova o campo para definir a visualização para o centro da câmara. Você observará várias superfícies à medida que a objetiva é movida para cima e para baixo devido à reflexão traseira da luz da óptica dentro do caminho óptico.

Em seguida, centralize o diafragma de campo no campo de viewfechando-o até a metade e usando os parafusos de ajuste Assim que o diafragma estiver alinhado corretamente, reabra-o. Em seguida, deslize a lente Bertrand para visualizar o plano focal traseiro, também conhecido como pupila de saída da objetiva.

Feche o diafragma de abertura além das bordas da pupila de saída e use os parafusos de ajuste para centralizar o diafragma de abertura em relação à pupila de saída. Verifique novamente abrindo o diafragma de abertura e combinando suas bordas com as da pupila de saída. Em seguida, defina o diafragma de abertura para cerca de 2/3 da abertura numérica da objetiva.

Para obter imagens da dinâmica dos microtúbulos usando a tubulina cerebral, comece ajustando a temperatura do aquecedor de amostra para 37 graus Celsius. Usando uma pipeta, flua 10 microlitros de sementes de microtúbulos estabilizadas com GMPCPP e monitore-as ligando-as à superfície por meio de imagens da superfície ao vivo. Uma vez que 10 a 20 sementes estejam ligadas dentro do campo de view, lave a amostra usando o dobro do volume do canal de BRB80 pré-aquecido e filtrado.

Em seguida, flua em 10 microlitros da mistura de polimerização.

Para medir o crescimento dos microtúbulos, configure um lapso de tempo usando o software de aquisição para adquirir uma imagem a cada 5 segundos por 15 minutos. Melhore o contraste adquirindo uma imagem média de 10 em cada ponto de tempo. Adquira imagens de plano de fundo conforme mostrado na seção anterior. Calcule a mediana acessando Imagem, selecionando Pilha, depois Projeto Z e, em seguida, Mediana. Subtraia o plano de fundo correspondente acessando Processo, indo para Calculadora de Imagens e escolhendo Subtrair no menu suspenso. Certifique-se de que a opção de resultado flutuante de 32 bits esteja marcada.

Para encolhimento de microtúbulos, adquira imagens a 100 quadros por segundo, definindo o atraso de tempo como zero e mantendo o tempo de exposição em 10 milissegundos.