Indução de Enterocolite Necrosante em Modelo Enteróide Epitelial Humano

Obtenha criptas derivadas do tecido do intestino delgado humano - invaginações tubulares contendo células-tronco e vários tipos de células epiteliais.

Adicione as criptas intestinais em uma matriz de porão gelada.

Transfira essa mistura para uma placa multipoços, criando uma cúpula tridimensional.

Adicione o meio de crescimento e incube.

As células-tronco se auto-organizam, proliferam e se diferenciam em vários tipos de células intestinais, formando enterosferas.

Com o tempo, as enterosferas amadurecem em enteróides - estruturas tridimensionais auto-renovadoras, semelhantes às criptas intestinais.

Adicione lipopolissacarídeos, ou LPS, uma endotoxina bacteriana, no poço contendo enteróides e incuba.

As moléculas de LPS se ligam ao receptor toll-like no enteróide, iniciando uma resposta pró-inflamatória, resultando no acúmulo de espécies reativas de oxigênio. Isso desencadeia uma cascata de eventos que levam à apoptose.

Consequentemente, a integridade do enteroide é comprometida, levando à penetração do LPS no lúmen, intensificando ainda mais a resposta inflamatória.

Isso imita o desenvolvimento de enterocolite necrosante, uma inflamação grave no intestino de bebês prematuros.

No momento da coleta na sala de cirurgia, coloque a amostra de tecido do intestino delgado humano em DPBS fria. Lave a amostra no DPBS frio até que esteja livre de sangue e fezes.

Armazene a amostra em meio RPMI 1640 a quatro graus Celsius até que esteja pronta para o isolamento da cripta. Quando estiver pronto para prosseguir, verifique novamente para garantir que a amostra esteja livre de fezes e sangue. Usando uma tesoura de dissecação delicada, remova qualquer excesso de gordura ou clipes e grampos cirúrgicos. Pese a amostra e procure um pedaço de aproximadamente 0,75 a 2,5 gramas.

Em seguida, corte o tecido em pedaços de 0,5 centímetro e coloque-os em um tubo contendo 30 mililitros de tampão quelante # 1. Agite em velocidade baixa por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, filtre o tecido através de um filtro de células de 100 micrômetros e descarte o fluxo.

Adicione o tecido filtrado a um tubo contendo 30 mililitros de tampão quelante # 2. Agite em velocidade baixa por 15 minutos a quatro graus Celsius. Filtre o tecido através de um filtro de 100 micrômetros e descarte o fluxo.

Depois disso, descongele 500 microlitros da matriz da membrana basal no gelo para uso posterior. Adicione um pouco de tecido a 10 mililitros de DMEM frio em um tubo cônico de 50 mililitros e agite vigorosamente com a mão por 10 segundos. Filtre esta suspensão através de um filtro de células de 100 micrômetros e colete o fluxo. Mantenha este tubo no gelo.

Adicione um pouco de tecido a outros 10 mililitros de DMEM frio em um tubo cônico separado de 50 mililitros e agite vigorosamente com a mão por 10 segundos. Filtre esta suspensão através de um filtro de células de 100 micrômetros e colete o fluxo.

Repita esse processo mais duas vezes até que haja quatro tubos cônicos contendo fluxo rotulado de um a quatro. Em seguida, filtre a solução no tubo número um através de um filtro de células de 100 micrômetros e transfira o fluxo para um tubo cônico de 15 mililitros também rotulado como número um. Repita esse processo para os tubos de dois a quatro.

Centrifugar os tubos de 15 mililitros a 200 vezes g e a quatro graus Celsius durante 15 minutos. Em uma capela de fluxo laminar, remova o sobrenadante de cada tubo e descarte-o. Evite interromper a nuvem de tecido imediatamente acima do pellet, mesmo que isso signifique deixar algum sobrenadante para trás. Em cada tubo, pipete para cima e para baixo lentamente para misturar o pellet com o sobrenadante restante.

Transfira a mistura de cada tubo para um único tubo cônico de 2 mililitros e centrifugue a 200 vezes g e a quatro graus Celsius por 20 minutos. Depois disso, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de matriz de membrana basal pré-descongelada.

Use uma ponta de pipeta gelada para aplicar 50 microlitros desta suspensão no centro de um poço em uma placa de 24 poços. Esta amostra deve aparecer em forma de cúpula. Repita este processo de aplicação nove vezes para preencher 10 poços no total.

Transfira a placa de 24 poços para uma incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 30 minutos para permitir a polimerização. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio mini-intestinal humano completo a cada poço. Continue incubando nas mesmas condições, certificando-se de substituir este meio a cada dois dias.