Name: Encapsulation título celular por Droplets (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:09:54.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Aprenda encapsulação celular por droplets para bioimpressão 3D usando válvula solenoide e estágio motorizado. Este método avança a engenharia de tecidos e viabilidade celular.

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NIH3T3 preparação células: Células de A. de ejeção <ol><li> Trypsinize células, então diluir 1:1 com media de células, e transferência de um frasco T75 para um tubo Falcon 15 mL </li><li> Spin down células em um pellet por centrifugação, aspirar o sobrenadante e lavar as células com DPBS </li><li> Spin down células em uma pelota de novo, e aspirar o sobrenadante </li><li> Ressuspender as células em meios de comunicação </li><li> Determinar a densidade de células com hemocitômetro (~ 200 X 10 4 células / mL por frasco T75) </li><li> Solução da célula centrífuga, aspirar o sobrenadante e ressuspender em quantidade adequada dos meios de comunicação para diferentes concentrações de células </li></ol> B. Célula de ejeção <ol><li> Vortex células antes de usar para a ejeção </li><li> Transferir 200 mL da solução de célula em seringa </li><li> Definir o modo apropriado no gerador de pulso <ol><li> Para ejetar gotículas de única e gotículas múltiplas (rajadas), grupo gerador de pulso para &quot;E. BUR&quot; modo </li><li> Para a ejeção de gotas contínuo, grupo gerador de pulso para &quot;NORM&quot; modo de </li></ol></li><li> Alterar as configurações de sinal <ol><li> Conjunto de alto nível e baixo nível de tensão de saída: LIS a 5 V e LOL para 0 V e certifique-se o &quot;LIM&quot; LED está ligado </li><li> Definir como um sinal de pulso quadrado </li><li> Alterar a quantidade de tempo que a válvula solenóide é aberta para a ejeção de gotas, alterando o valor para &quot;WID&quot; ou mudar ciclo (&quot;dever&quot;) </li><li> Mudar a freqüência de ejeção, alterando o valor para &quot;PER&quot; </li><li> Alterar o número de gotículas ejetado em uma explosão, alterando o valor para &quot;BUR&quot; </li></ol></li><li> Solução da célula ejetar em substrato preparado para imagens com microscópio </li></ol> Coloração C. <ol><li> Compõem solução corante com 0,5 mL calceína-AM e 2 homodímero de etídio mL por mL de DPBS </li><li> Substrato preparado mergulhe em solução corante </li><li> Deixar a amostra para incubar por 10 minutos a 37 ° C antes de imagem </li></ol> Validação de experiência <ol><li> Em um microscópio Nikon Eclipse TE U-2000 Fluorescent <ol><li> Software ponto avançado (Diagnostics, Inc.) </li><li> Live / Morto Assay </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a declarar.

<table><tbody><tr><td>Microscópio Fluorescente</td><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE-2000 U</td><td></td></tr><tr><td>Ejetor de células com válvula solenoide</td><td></td><td></td><td></td><td>Frequência de operação: 1 KHz, 30 psi, 50 nl~0,5 µl. Driver de válvula 12 V: corrente de acionamento de 2,5 A</td></tr><tr><td>Reservatório de ar portátil de 5 galões</td><td></td><td>Coleman</td><td>Powermate CT5</td><td>Ar pressurizado: 30 PSI</td></tr><tr><td>Reguladores de pressão</td><td></td><td>Marsh Bellofram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gerador de Pulso</td><td></td><td></td><td>HP8112A</td><td>Geração de frequência de acionamento: 50 MHz</td></tr><tr><td>Estágio XYZ</td><td></td><td>Newmark Systems</td><td></td><td>Com motor de passo: estágio xy com curso de 6 polegadas (NLS4-6-25), estágio z com curso de 2,5 polegadas (NLS4-2,5-25), controlador de 3 eixos (NSC-G3), resolução de 0,1 µm</td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>Linhagem celular</td><td></td><td></td><td>fibroblastos</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td></td><td></td><td></td><td>Solução a 0,05%</td></tr><tr><td>Meio para células NIH 3T3</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td></td><td></td><td></td><td>Frascos de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Tubos cônicos de plástico</td><td></td><td></td><td></td><td>15 ml, para cultura de tecidos</td></tr></tbody></table>

encapsulation título celular por droplets

Title Cell Encapsulation by Droplets

Encapsulation título celular por Droplets

Meu nome é Hang Moon. Estou trabalhando com o professor de preservativos. Ele e eu trabalhamos com o estágio XYJ para criar uma estrutura tridimensional de célula.Olá, sou PE e Lynn, e estou trabalhando no projeto de impressão celular com encapsulamento celular e meios e géis. Este é o solenoide para a ejeção de uma célula e mistura celular de aros sobre o meio celular. A válvula solenoide é ativada por duas linhas de sinal.A linha de sinal vem de uma placa seca aqui. O sinal vem daqui. Essa linha através daquela linha, aquela é o gerador de função primeiro.Primeiro, o sinal é gerado por nosso método programado. Assim, se desejar alterar o pulso, você pode modificar o programa com a linha de comutação ou pode controlar esse gerador de processo por meio do computador. A válvula celular é aberta e fechada pelo sinal elétrico, mas a célula é suprida através dessa linha.A célula e o meio ou gel de ágar são fornecidos através das seringas. As seringas dentro da água, dentro da seringa, estão sob pressão leve causada pelo ar. O ar pressurizado é fornecido a partir de um tanque, como nesta linha.Assim, a pequena linha e o ar pressurizado passam através do filtro de ar. O filtro de ar discrimina a poeira e outros tipos de sujeira. O que chamamos de gerador de pressão gera o sinal utilizado para abrir ou fechar a válvula de ar solar. O computador está conectado por meio do conector P-I-B-U-S-V.Portanto, podemos usar a porta USB conectando-a diretamente ao nosso computador, o computador portátil. Essa conexão é feita nesse lado aqui. E então podemos controlar por meio do computador de controle localizado aqui.Portanto, se quisermos sincronizar o movimento do estágio e a abertura do sino, isso pode ser controlado pelo mesmo controlador de um laptop. Assim, podemos controlar o momento em que ele abre, em que fecha, em que se move e em que para. E podemos sincronizar o movimento com a abertura do sino.Essa fase é a fase motorizada. Ela é movida automaticamente por meio da linha de sinal de morte e do motor. Assim, a motorização é de 0,1 micrômetro.Portanto, idealmente, pode traçar a linha até a marca de 100 milímetros. Assim, o eixo do jato está se movendo, subindo e descendo dessa maneira. Dessa forma, controla a distância entre o substrato e a correia solar.Para que possa controlar a altura da ejeção. Esse substrato está conectado às etapas XY aqui, X aqui e Y ali. Assim, ele se move ao redor de um plano XY.Então, ele desenha uma demonstração de alguma característica em estágios específicos, que são três eixos: X, Y e G. Assim, o eixo do jato com jato, ou eixo XY, é controlado por um sinal aqui. A linha de sinal é conectada ao controlador de movimento aqui. Esse controlador de movimento não possui nenhum interruptor manual, pois não pode ser controlado manualmente.É controlado por meio do computador portátil. Portanto, o computador portátil está conectado. Na parte traseira do controlador, temos três xs para uma célula de impressão XY jet.Portanto, ele gera três tipos diferentes de sinal independentemente. E então, o controlador de movimento se comunica por meio dos conectores RF 2, 3, 2 que estão diretamente conectados ao USV. E então, o USV está conectado ao computador portátil.Então o laptop controla o dispositivo. Utilizamos o programa AutoCAD, criamos um caminho de geração A dessa forma, bum. E então ele é convertido para a linguagem da máquina assim.Assim, a linguagem da máquina é transferida para algo que utiliza caracteres e números simples como esses. Cada posição está relacionada aos estágios X, Y e Z. Aqui, escolho o arquivo que contém esse tipo de programa e, em seguida, abro o programa de download dessa maneira. Depois, escolho a partir do arquivo exatamente da mesma forma, o arquivo de texto.Apenas o arquivo de texto é baixado; escolha o arquivo de texto e faça o download automático do laptop para o controlador de movimento Com Motion Executive, e então ele vai para o caractere BAM, como mencionei anteriormente, BAM. Neste frasco estão células de fibroblasto de camundongo NIH/3T3. E agora vou primeiro aspirar o meio antigo.Este processo serve para repicar as células, que estão aderidas ao fundo do frasco. Portanto, após aspirar o meio, vou adicionar seis RYS, que é uma enzima. Está bem? Após a tripsina ter sido adicionada ao frasco, precisamos aguardar de três a cinco minutos para que as células se soltem do fundo do frasco.Agora estamos prontos para adicionar o meio e repicar as células para um tubo de centrífuga. É uma diluição um para um. Então, estou adicionando seis mililitros deste meio bem aqui e vou lavar um pouco os discos para garantir que todos sejam repicados.E agora as células estão prontas para serem centrifugadas neste tubo. Agora vamos centrifugar essas células a mil RPM por três a cinco minutos. Agora que as células foram sedimentadas em um pellet, vou aspirar o sobrenadante.Agora vou lavar as células com PBS. Isso é para, isso é para colorir as células. As colorações que estamos usando são substratos de esterase.Certo, agora vamos centrifugar novamente e sedimentar as células em um pellet. E vou aspirar o PBS e vou ressuspender as células no meio para contagem.Estou misturando as células para que, ao coletar uma amostra, a concentração fique uniforme em todo o tubo. Agora vou coletar cem microlitros das células para medir a densidade celular. Agora estou adicionando cem microlitros de tripano azul, que é um corante.Vamos esperar de três a cinco minutos para que o corante penetre nas membranas das células mortas. Ao contarmos as células, não contamos as azuis. As células estão prontas para serem contadas com o hemocitômetro; vou transferir 50 microlitros da mistura celular para cada lado do hemocitômetro.Ok, vou cobri-lo com o lado do lamínula. O hemocitômetro tem dois lados. Vou contar o primeiro lado e, após contar ambos os lados, vou calcular a média e depois multiplicar por dois, porque tivemos uma diluição um para um com o tipo na cor azul.Então, basicamente, nossa densidade celular será de 135 vezes 10 elevado a quatro células por mililitro. Para o nosso experimento, utilizaremos uma solução celular com uma concentração de meio milhão de células por mililitro. E como temos 13,5 milhões de células, vou ressuspender as células em 27 mililitros de meio.Estamos utilizando dois tipos diferentes de corantes. Este é um ensaio de viabilidade celular da Molecular Probes. Nosso primeiro corante chama-se calcium am.Nossa segunda coloração é chamada de homodímero AUM. Ela cora células mortas. Utilizamos excitação azul para obter fluorescência verde e excitação verde para obter fluorescência vermelha. Para essas duas colorações, quando estivermos realizando a imagem, nossa solução será preparada em PBS.Primeiro, vou transferir cinco mililitros de PBS para um tubo de salina tamponada com fosfato. Essa é uma solução salina. Agora, vou adicionar meio microlitro de cálcio am por mil.Agora estou adicionando 2,5 microlitros de cálcio am ao tubo e dois microlitros do homodímero athe por mililitro de PBS. Aqui está a máquina btex. Ela faz com que as células e o meio se distribuam uniformemente por todo o volume.Agora carregamos a célula com 200 microlitros na sete aqui. Em seguida, colocamos a tampa, que é hermeticamente fechada dessa maneira; aqui, abro a válvula e então o ar pressurizado entra, depois ajusto a correia assim. E então mudo a pressão.Então eu ajusto. A pressão é de cinco PSI. A pressão no interior do tubo é de cinco PSI.Daqui até aqui, conecta-se através deste ponto dentro do orifício. Então, simplesmente abrimos o sino aqui e, em seguida, a célula é injetada com pressão de cinco PSI e começa a abrir. E então a válvula Sona começa a operar.Em seguida, rolamos o substrato. O substrato é apenas um simples lamínula de vidro. Depois, carregamos a porção adequada e coloco uma fita adesiva para fixar o substrato dessa maneira, certo?E simplesmente eu apenas o fixo. Então, estamos montando todo o conjunto, a célula e a válvula ary e o substrato durante o movimento do ary em funcionamento, iniciando o trabalho. Assim, montamos todo o conjunto e então abrimos a válvula ary para iniciar.Em seguida, movemos a platina dessa forma, certo? E então criamos um padrão sobre o padrão do substrato e pronto, o personagem. Vou imergir essas gotas que imprimimos na solução corante que preparamos anteriormente.E agora as gotas serão incubadas por 10 minutos e, em seguida, analisadas. Primeiro, vou ajustar a imagem através da ocular. Nossa primeira imagem é apenas uma imagem de campo claro.Vou desligar a luz e trocar o filtro para termos excitação azul, o que mostrará fluorescência verde. E a terceira imagem que vamos capturar é a das células mortas, que é a coloração com Thm Homodimer. Com luz verde, obteremos fluorescência vermelha.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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