O encapsulamento celular em Hidrogéis 3D para Engenharia de Tecidos

O processo passo a passo para a encapsulação de células começa com a preparação e esterilização de moldes de hidrogel e outros materiais, seguido pelo isolamento de células em populações individuais, em tubos para cada conjunto de gel. Em seguida, a reticulação é realizada na presença de células, seguida pelo período de incubação in vitro ou in vivo. A análise posterior do comportamento celular pode incluir testes de viabilidade, morfologia, proliferação e diferenciação.

Olá, sou Amidio Kahan do laboratório do Dr. Jason Burdick, do Departamento de Bioengenharia da Universidade da Pensilvânia. Hoje vamos mostrar um procedimento para encapsulamento celular em hidrogéis tridimensionais para engenharia de tecidos. Utilizamos este procedimento para estudar os efeitos da composição e estrutura do hidrogel sobre o comportamento de células encapsuladas.

Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, prepare uma solução a 0,5% em peso do fotoiniciador air cure 2 9 5 9 ou I 2 9 5 9 em PBS. Misture e incube por dois a três dias no escuro a 37 graus Celsius.

Quando pronto, utilize um filtro de seringa para esterilizar a solução e armazene-a à temperatura ambiente. Em seguida, use um programa de planilha eletrônica, como o Microsoft Excel, para calcular a quantidade de polímero e de agente de reticulação necessária, conforme demonstrado. Aqui está o ácido hialurônico funcionalizado com grupos reativos acrilatos.

Também calcule a quantidade do peptídeo penante contendo o domínio adesivo funcional com os aminoácidos cistina, arginina, glicina e aspartato. A cistina é utilizada para ancorar ao polímero. Agora que as quantidades necessárias de reticulante polimérico e pent foram determinadas, pese-os e coloque cada um em um tubo einor.

Ajuste a planilha de cálculo conforme necessário. Para a massa real do polímero obtido, prossiga para preparar as formas de gel. Use uma lâmina de barbear para cortar as pontas das embalagens estéreis individuais.

Seringas descartáveis de um mililitro. Certifique-se de que seja feito um corte reto para os moldes a serem usados no padrão fotográfico dos géis. Por fim, esterilize os moldes de seringa e os tubos EOR com suas tampas abertas, bem como quaisquer outros materiais necessários, colocando-os sob uma fonte de luz germicida integrada ao gabinete de segurança biológica por 30 minutos.

Uma vez concluída a esterilização, prossiga para o preparo das células após a esterilização do equipamento experimental. Trabalhe na câmara de fluxo laminar e adicione TEA estéril ao polímero utilizado na reticulação do tipo mical e PBS estéril ao polímero utilizado na reticulação por radicais livres. ADICIONE tampão correspondente aos tubos contendo os grupos laterais e vortexe.

Para dissolver o grupo pendente que se liga ao ácido hialurônico alquilado por meio de um tiol de um grupo INE no peptídeo, a fim de fixar o grupo pendente ao polímero, adicione-o à solução polimérica e feche com param. Resumidamente, vortexie e incube a 37 graus Celsius com agitação. Enquanto prepara as células, durante a ligação do grupo pendente, prepare as células a serem encapsuladas, como células-tronco mesenquimais humanas ou HMCs, lavando-as com PBS.

Em seguida, incubar com tripsina por um minuto à temperatura ambiente, remover a tripsina e incubar por mais cinco minutos a 37 graus. Em seguida, adicionar o meio de crescimento para HMCS para neutralizar a tripsina e liberar as células da superfície da placa. Contar as células com um hemocitômetro.

Divida as células contadas em porções contendo o número apropriado para cada conjunto de géis. Para um conjunto de três géis de 50 microlitros com uma densidade de 10 milhões de células por mililitro, separe 1,5 milhão de células em um tubo cônico individual. Não prepare mais de quatro géis em um único conjunto devido ao tempo de gelificação.

Em seguida, centrifugue as células a 500 RCF durante seis minutos. À temperatura ambiente, enquanto as células estão sedimentando, prepare a mistura de polimerização para a reticulação com crosslinker da edição mical. Adicione tampão ao reticulador para atingir a concentração apropriada.

Para a reticulação por radicais livres iniciada por luz, adicione a solução de I 2 9 5 9 previamente preparada à solução polimérica. Utilize 10% do volume total definido para o gel, obtendo uma concentração final de iniciador de 0,05% em peso. Agora, as células e a mistura de polimerização estão prontas para encapsulação no hidrogel.

Inicie aspirando o sobrenadante das células centrifugadas. Aguarde a acomodação do líquido após a aspiração inicial e aspire novamente para remover o máximo de meio possível sem perturbar o pellet celular. Suspenda o pellet celular com a solução polimérica para evitar bolhas de ar.

Pipete lentamente a solução para cima e para baixo cerca de 10 vezes, o que deve ser suficiente para distribuir as células uniformemente. Para a reação de adição do tipo mical, use uma ponteira de pipeta com orifício largo para adicionar o volume apropriado da solução de agente de reticulação à célula polimérica. Misture. Ajuste a pipeta ao volume individual desejado do gel.

Pipete a solução para cima e para baixo para homogeneizar e transferir para as moldes das ponteiras de seringa. Realize o passo rapidamente para garantir uma distribuição uniforme das células e deixe incubando de 10 a 30 minutos na câmara de cultura para a reticulação. Para a reticulação radical livre iniciada por luz.

Aliquote o volume apropriado em moldes de ponta de seringa. Exponha as seringas à luz UV para reticulação radical por 10 minutos com exposição a 365 nanômetros. Uma luz UV de 4 miliwatts por centímetro quadrado é comum para polímeros funcionalizados com ACRL.

Realize o passo rapidamente para minimizar a sedimentação celular antes da exposição à luz UV. Após a reticulação, mergulhe os géis nas cavidades de uma placa de cultura de tecidos contendo meio para incubação e análise. A reticulação do hidrogel também pode ser realizada sequencialmente.

Primeiro, adicione o corante funcionalizado metolado de rumina a uma concentração final de 20 nanomolares no gel. O corante auxilia na visualização do padrão, pois se incorpora preferencialmente nas regiões do gel reticuladas radicalmente. Em seguida, inicie a reação de polimerização do tipo mic, produzindo uma fração dos reticulamentos teóricos para o seguinte.

A ligação cruzada por radicais livres exigirá o uso de uma máscara projetada em um programa como o Adobe Photoshop ou Illustrator e impressa diretamente em máscaras de transparência. As dimensões da máscara devem corresponder à parte superior redonda da seringa. Utilize pinças esterilizadas para aplicar uma máscara estéril diretamente sobre a superfície do gel e exponha à luz para promover a ligação cruzada do gel.

Além disso, são mostrados aqui MCHs em hidrogéis à base de AH uma hora após a encapsulação. Como os hidrogéis sintetizados são tipicamente transparentes, as células podem ser visualizadas quanto à morfologia utilizando microscopia de luz. As mesmas células foram analisadas quanto à viabilidade 24 horas após a encapsulação, utilizando um kit fluorescente de coloração de células vivas e mortas.

Utilizamos o corante de cálcio M para detectar as células vivas e o homodímero de atherium para as células mortas, observando uma viabilidade superior a 95%. Também utilizamos o ensaio alamar blue para determinar o nível de proliferação celular, medido pela capacidade das células de metabolizar o reagente do ensaio, resultando em uma mudança de cor. A coloração celular foi realizada em H HMCs sete dias após a encapsulação em um hidrogel à base de HA degradável e adesivo, utilizando procedimentos padrão de fixação e permeabilização.

O acto celular é visível utilizando faloidina marcada com fluoresceína e núcleos contrastados com DAPI. A imunomarcação contra caderina é utilizada para visualização de adesões focais dentro da matriz do hidrogel. A coloração histológica é realizada após desidratação, inclusão em parafina e seccionamento dos hidrogéis, seguindo protocolos padrão de hidrogéis de HA com HMSC encapsuladas por polimerização radicalária.

Após uma semana em cultura, as amostras foram coradas com hematoxilina, marcando os núcleos, e com ASIN, marcando o tecido conjuntivo A, além de colorações azuis para glicosaminoglicanos. A PCR em tempo real é utilizada para quantificar a diferenciação de células-tronco encapsuladas. Após a subtração do fundo, o nível de expressão de um gene de interesse é determinado pelo número de ciclos no qual a fluorescência atingiu o limiar, comparado a um sinal de referência passiva, que é um gene de controle constitutivamente ativo. Assim, acabamos de mostrar como encapsular células em hidrogéis tridimensionais e estudar o comportamento das células em géis.

Ao utilizar estes procedimentos, é importante garantir a esterilidade completa dos materiais, seja mantendo soluções tampão e reagentes estéreis por longo prazo ou esterilizando com a lâmpada germicida de UV. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.