O encapsulamento celular em Hidrogéis 3D para Engenharia de Tecidos

Nós apresentamos os protocolos para o 3-dimensional encapsulamento (3D) de células dentro de hidrogéis sintéticos. O procedimento de encapsulamento é descrito por dois métodos comumente utilizados de reticulação (michael tipo adição e light-iniciado livre mecanismos radical), bem como uma série de técnicas para avaliar o comportamento das células encapsuladas.

O processo gradual de encapsulamento de células começa com a preparação e esterilização de moldes de hidrogel e outros materiais, seguido pelo isolamento de células em populações individuais, em tubos para cada conjunto de gel. A ação é então realizada na presença de células, seguida do período de incubação in vitro ou in vivo. A análise a jusante do comportamento celular pode incluir testes de viabilidade, morfologia, proliferação e diferenciação.

Olá Amidio Kahan do laboratório do Dr. Jason Burdick no Departamento de Bioengenharia da Universidade da Pensilvânia. Hoje mostraremos um procedimento para encapsulamento celular em hidrogéis 3D para engenharia de tecidos. Usamos este procedimento para estudar os efeitos da composição e estrutura do hidrogel no comportamento das células encapsuladas.

Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, prepare uma solução de 0,5% de peso do fotoiniciador de cura a ar 2 9 5 9 ou I 2 9 5 9 em PBS. Misture e incube por dois a três dias no escuro a 37 graus Celsius.

Quando estiver pronto, use um filtro de seringa para esterilizar a solução e armazená-la em temperatura ambiente. Em seguida, use um programa de planilha como o Microsoft Excel para calcular a quantidade de polímero e reticulante necessária demonstrada. Aqui está o ácido hialurônico funcionalizado com grupos reativos de acrilato.

Calcule também a quantidade do peptídeo penante contendo o domínio adesivo funcional com aminoácido cistina, arginina, glicina e aspartato. A cistina é para amarrar ao polímero. Agora que as quantidades necessárias de reticulador de polímero e pent foram determinadas, pese-as e coloque cada uma em um tubo einor.

Ajuste a planilha de cálculo de acordo. Para a massa real de polímero obtida, prossiga Para preparar moldes de gel. Use uma lâmina de barbear para cortar as pontas dos estéreis embalados individualmente.

Seringas descartáveis de um mililitro. Certifique-se de que um corte plano seja feito para moldes a serem usados para padrão de foto para géis. Por fim, esterilize os moldes de seringa, os tubos EOR com as tampas abertas e quaisquer outros materiais necessários, colocando-os sob uma fonte de luz germicida embutida no gabinete de segurança biológica por 30 minutos.

Quando a esterilização estiver concluída, prossiga para preparar as células após a esterilização do equipamento experimental. Trabalhe na coifa e adicione TEA estéril ao polímero usado na reticulação do tipo mical e PBS estéril ao polímero usado para a reticulação de radicais livres. ADICIONE o amortecedor correspondente aos tubos de porção pendentes e ao vórtice.

Para dissolver a porção pendente se liga ao ácido hialurônico alquilado por meio de um tiol de um grupo INE no peptídeo para anexar a porção pendente ao polímero, adicione-o à solução de polímero e sele com parâmetro. Resumidamente, vórtice e incubar a 37 graus Celsius com mistura. Enquanto prepara as células, enquanto a porção pendente está se conectando, prepare as células para serem encapsuladas tryis, células-tronco mesenquimais humanas ou HMCs, lavando-as com PBS.

Em seguida, incube com tripsina por um minuto em temperatura ambiente, remova a tripsina e incube mais cinco minutos a 37 graus. Em seguida, adicione o meio de crescimento HMSC para neutralizar a tripsina e liberar as células da superfície da placa. Conte as células com um hemocitômetro.

Separe as células contadas em porções contendo o número apropriado para cada conjunto de géis. Para um conjunto de três géis de 50 microlitros a uma densidade de 10 milhões de células por mililitro, separe 1,5 milhão de células em um tubo cônico individual. Não prepare mais de quatro géis em um conjunto individual devido ao tempo de ação.

Em seguida, centrifugue as células a 500 RCF por seis minutos. À temperatura ambiente, enquanto as células estão girando, prepare a mistura de polimerização para a reticulação da edição mical. Adicione tampão ao reticulador para atingir a concentração apropriada.

Para a reticulação de radicais livres iniciada pela luz, adicione a solução I 2 9 5 9 previamente preparada à solução de polímero. A 10% do volume total do gel definido para uma concentração final do iniciador de 0,05% de peso. Agora as células e a mistura de polimerização estão prontas para encapsulamento no hidrogel.

Comece aspirando o snat das células centrífugas. Aguarde até que o líquido assente após a aspiração inicial e aspire novamente para remover o máximo de meio possível sem interromper o pellet celular Resus. Suspenda o pellet celular com a solução de polímero para evitar bolhas de ar.

Pipete lentamente a solução para cima e para baixo cerca de 10 vezes, o que deve ser suficiente para distribuir as células uniformemente. Para a reação de adição do tipo mical, use uma ponta de pipeta de orifício largo para adicionar o volume apropriado de solução de reticulador à célula de polímero. Misture a pipeta para o volume de gel individual desejado.

Pipete a solução para cima e para baixo para homogeneizar e Eloqua nos moldes da ponta da seringa. Execute a etapa rapidamente para garantir uma distribuição uniforme das células e deixe 10 a 30 minutos de incubação na capela de cultura para reticulação. Para a luz iniciou a reticulação de radicais livres.

Alíquota do volume apropriado em moldes de ponta de seringa. Exponha as seringas à luz UV para reticulação radical em uma exposição de 10 minutos a 365 nanômetros. Quatro miliwatts por centímetro quadrado de luz UV é comum para polímeros funcionalizados ACRL.

Execute a etapa rapidamente para minimizar a sedimentação celular antes da exposição à luz UV. Após a reticulação, mergulhe os géis nos poços de uma placa de cultura de tecidos contendo meios para incubação e análise. A reticulação do hidrogel também pode ser feita sequencialmente.

Primeiro, adicione o corante funcionalizado de rumina metolada a uma concentração final de 20 nanomolares no gel. O corante ajuda a visualizar o padrão, pois se incorpora preferencialmente em regiões radicalmente reticuladas do gel. Em seguida, comece com a reação de polimerização do tipo mic produzindo uma fração das ligações cruzadas teóricas para o seguinte.

Reticulação de radicais livres: será necessário usar uma máscara projetada em um programa como Adobe Photoshop ou Illustrator e impressa diretamente em máscaras de transparência. As dimensões da máscara devem corresponder à parte superior da seringa redonda. Use uma pinça esterilizada para aplicar uma máscara estéril diretamente na superfície do gel e exposta à luz para reticular o gel.

Além disso, são mostrados aqui os HMCs dentro de hidrogéis à base de HA uma hora após o encapsulamento. Como os hidrogéis sintetizados são tipicamente transparentes, as células podem ser visualizadas quanto à morfologia usando microscopia de luz. As mesmas células foram visualizadas quanto à viabilidade 24 horas após o encapsulamento usando um kit de coloração fluorescente de mortos vivos.

Usamos cálcio M para detectar as células vivas e homodímero de aterio para as células mortas e observamos mais de 95% de viabilidade. Também usamos o ensaio de azul de alamar para determinar o nível de proliferação celular medido por quão bem as células metabolizam o reagente do ensaio, resultando em uma mudança de cor. A coloração celular foi realizada em HMCs H sete dias após o encapsulamento em um hidrogel à base de AH degradável e adesivo e usando fixação padrão e procedimentos permeáveis.

O ácton celular é visível usando phin marcado com fluoresceína e núcleos contidos com dpi. A imunocoloração contra o cullin é usada para visualização de aderências focais dentro da matriz de hidrogel. A coloração histológica é realizada após a desidratação, inclusão em parafina e seccionamento dos hidrogéis usando protocolos padrão hidrogéis de HA encapsulados em HMSC radicalmente polimerizados.

Após uma semana em cultura, foram corados com hemat toin marcando os núcleos e ASIN marcando o tecido conjuntivo A e coragens azuis para glicosaminoglicanos. Tempo real. A PCR é usada para quantificar a diferenciação de células-tronco encapsuladas Após subtrair o fundo, o nível de expressão de um gene de interesse é determinado pelo número do ciclo em que a fluorescência limiar foi atingida em comparação com um sinal de referência passivo, que é um gene de manutenção constitutivamente ativo. Então, acabamos de mostrar como encapsular células em hidrogéis 3D e estudar o comportamento das células em géis.

Ao usar esses procedimentos, é importante garantir materiais de esterilidade completa, mantendo soluções tampão e reagentes estéreis a longo prazo ou esterilizando com a lâmpada UV germicida. Então é isso. Obrigado pela lavagem e boa sorte com seus experimentos.