Name: Encapsulamento de células de mamífero em grânulos de alginato usando um recipiente agitado simples (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Aprenda a encapsular células de mamífero em grânulos de alginato usando um recipiente agitado simples. Este método emulsão-ácido permite produção escalável para aplicações em terapia celular e engenharia de tecidos.

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Agradecemos a Jill Osborne por seu trabalho de colocação no processo de emulsão e Lauren Wilkinson para suporte técnico. Agradecemos ao Dr. Igor Laçik, ao Dr. Timothy J. Kieffer e ao Dr. James D. Johnson por sua contribuição e colaboração. Agradecemos ao Diabète Québec, à JDRF, à ThéCell, ao Centro Quebécois sobre os Materiais Funais (CQMF), ao Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (CRSNG), ao Centro de Transplante de Ilhotas Humanas e à Regeneração de Células Beta, a Rede Canadense de Células-Tronco, a Fundação Michael Smith para Pesquisa em Saúde, os Fundos de pesquisa da pesquisa e a tecnologia e o COST 865 para apoio financeiro.

1. Prepare a solução de alginato, a suspensão de CaCO 3 e o óleo acidificado <ol><li> Prepare o buffer de processo e o meio. <ol><li> Prepare o tampão de processo típico usado para gerar esferas de alginato de alta concentração usando HEPES 10 mM, NaCl 170 mM. Ajuste o pH para 7,4. </li><li> Prepare o meio de cultura típico usando o Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), 6 mM de glutamina, 100 U / mL de penicilina e 100 mg / mL de estreptomicina. </li></ol></li><li> Prepare a solução de reserva de alginato a 1,17 vezes a concentração desejada final nas pérolas. <ol><li> Primeiro, pesa a quantidade apropriada de pó de alginato. Por exemplo, para obter uma concentração final de 5% de alginato com alginato LVM e MVG 50:50, pesar um total de 1,17 g de alginato de sódio combinando 0,583 g de pó de alginato LVM e 0,583 g de pó de alginato MVG. </li><li> Coloque 20 mL de buffer de processo em um autocFrasco de vidro lavável em uma placa de agitação magnética e agite a ~ 200 rpm. Adicione progressivamente o pó de alginato de sódio à solução. </li><li> Deixe a solução mexendo durante a noite a baixa velocidade. Se necessário, prenda o balão na placa de agitação. </li><li> Se a solução estiver completamente dissolvida, prenda a garrafa sobre um misturador rotativo e continue a misturar a 37 ° C por 24 h adicionais. </li><li> Esterilizar a solução de alginato esterilizando a solução por 30 min em uma embarcação que está menos da metade cheia. Deixe a temperatura diminuir abaixo de 60 ° C antes de recuperar a solução. </li><li> Se necessário, remova as partículas filtrando a solução de alginato logo após a autoclavagem antes de atingir a temperatura ambiente, enquanto a viscosidade permanece suficientemente baixa. </li></ol></li><li> Prepare a suspensão de carbonato de cálcio a 21 vezes a concentração desejada final para a gelificação interna. <ol><li> Pesar o pó de CaCO 3 . Por exemplo, anúncioD 1 g de CaCO3 a 20 mL de tampão de processo para obter CaCO3 24 mM como a concentração final do agente gelificante. </li><li> Autoclave a suspensão de CaCO 3 durante 30 min. NOTA: A concentração de CaCO3 mudará ao longo do tempo devido ao equilíbrio de bicarbonato - CO 2 . Evite usar a mesma suspensão de CaCO 3 para mais de 10 procedimentos de encapsulamento. </li></ol></li><li> Autoclave o recipiente agitado usado para o processo de emulsão. Antes de usar, remova todos os vestígios de água condensada que permanecem no frasco giratório. </li><li> Imediatamente antes do processo de emulsão, preparar o óleo acidificado. Dissolver 44 μL de ácido acético por 11 mL de óleo mineral colocado em um tubo cônico de 50 mL. NOTA: Um erro comum é a dissolução incompleta do ácido acético. Evite pipetar pequenas quantidades de ácido acético e assegure-se de que o ácido acético é completamente dissolvido em óleo por meio de vortex repetido. CUIDADO: o ácido acético é tóxico e<html> D ácido volátil. Manuseie este reagente sob uma exaustão e mantenha a solução de ácido acético / óleo em um recipiente fechado até o passo de emulsão. Consulte as informações de MSDS sobre este reagente para obter mais informações. </li><li> Permita que todas as soluções atinjam a temperatura ambiente antes de proceder ao encapsulamento celular. </li></ol> 2. Geração de grânulos de alginato por emulsificação e gelação interna <ol><li> Coloque 10 mL de óleo mineral leve no frasco giratório e comece a agitar com uma baixa velocidade de rotação ( por exemplo, 250 rpm para o frasco giratório usado neste vídeo). </li><li> Se as células utilizadas para o processo são de culturas aderentes, aplique tripsina para suspender as células. Termine a reação adicionando o meio contendo FBS ou o inibidor da tripsina e colete uma amostra para enumeração celular. <ol><li> Determine a concentração celular e a viabilidade após a coloração do azul de Trypan usando um hemocitómetro ou um contador de células automatizado, conforme descrito anteriormenteAss = &quot;xref&quot;&gt; 32. </li></ol></li><li> Centrifugar as células por 7 min a 300 xg e lavá-las uma vez no meio desejado para imobilização celular. Certifique-se de que este meio contenha emulsionantes tais como FBS ou albumina de soro bovino (BSA). Por exemplo, use DMEM contendo 10% de FBS. </li><li> Re-suspenda o sedimento celular no mesmo meio para obter 10,5 vezes a concentração final desejada nas pérolas. </li><li> Adicione 1,1 mL do estoque celular concentrado de 10,5 vezes a 9,9 ml da solução de alginato. Em seguida, adicione 550 μL de suspensão de CaCO3 e misture com agitação com uma espátula estéril para assegurar uma distribuição uniforme do CaCO3. </li><li> Transfira imediatamente 10,5 mL da mistura de alginato, célula e CaCO3 no óleo de agitação usando uma seringa. NOTA: Para soluções altamente viscosa, aspirar e ejetar a mistura muito lentamente para evitar bolhas de ar. Em alguns casos, é preferível parar a agitação ao adicionar a mistura ao frasco para evitarArrastamento no eixo do impulsor. </li><li> Imediatamente após adicionar a mistura de alginato, célula e CaCO3 ao óleo, aumentar a taxa de agitação. NOTA: Para o 5% LVM: alginato MVG usado aqui, uma velocidade de rotação de 1025 rpm foi aplicada para gerar esferas de aproximadamente 900 um de diâmetro adequadas para cultura in vitro 35 . Velocidades de rotação mais elevadas e menores concentrações de alginato levará a diâmetros de talão médios mais baixos, conforme descrito nas publicações anteriores 25 , 32 . Mudanças ligeiras na geometria do impulsor e do vaso, bem como propriedades de alginato podem afetar muito o diâmetro médio do talão. Para cada alteração na configuração da embarcação ou no lote de alginato, deve ser gerada uma curva padrão que relaciona o diâmetro da ponta média do momento da superfície com a velocidade de rotação 32 . </li><li> Inicie o temporizador e emulsionar o alginato durante 12 min. </li><li> Adicione 10 mL de tEle óleo e solução de ácido acético para acidificar a emulsão, dissolver o CaCO 3 e, portanto, reticular fisicamente o alginato em pérolas geladas. Permitir 8 minutos para este passo de acidificação. </li></ol> 3. Recuperação de grânulos <ol><li> Reduza a taxa de agitação para 400 rpm. Adicione 40 mL de tampão de processo misturado com 10% de meio para aumentar o pH e causar inversão de fase. </li><li> Pare a agitação 1 minuto depois e transfira a mistura para tubos de centrífuga de 50 mL. Enxaguar o frasco com um meio adicional de 20 mL e adicioná-lo ao tubo. Aspirar a maior quantidade possível de fase aquosa do frasco de centrifugação antes de aspirar a fase de óleo para minimizar o contato do talão com a fase de óleo. NOTA: use uma pipeta de grande diâmetro ( por exemplo, uma pipeta de 25 mL) nesta etapa e a partir deste ponto para evitar danificar as contas. Para volumes menores, a suspensão do talão também pode ser manipulada com pontas de pipeta cortadas. Para obter essas dicas, corte o fim da ponta da pipeta com tesoura whIle usando proteção para os olhos </li><li> Centrifugue os tubos por 3 minutos a 630 xg para acelerar a sedimentação e a separação de feixes. </li><li> Remova o óleo e o excesso de solução aquosa aspirando com uma pipeta Pasteur. </li><li> Lave as contas pelo menos uma vez com meio. Filtre a suspensão de talão em filtros de células de nylon de 40 μm e aspirar o excesso de líquido associado com as contas abaixo do filtro. Transfira as contas para um volume conhecido de meio usando uma espátula estéril. NOTA: filtros mais pequenos ou maiores de tamanho de poro podem ser usados ​​nesta etapa, dependendo do diâmetro mínimo do talão do alvo. No entanto, recomenda-se filtração por gravidade em vez de filtração por pressão através de filtros de tamanho de poro sub-micron para evitar danificar as esferas. </li><li> Medir o volume do grânulo por deslocamento do volume (volume após a adição das pérolas, menos o volume antes da adição das esferas) e completar o meio para obter o grânulo desejado: razão do volume total, que é tipicamente 1: 5 ou 1 mL em contas4 mL de meio. A partir deste ponto, use sempre pipetas de grande diâmetro para evitar danificar as contas. </li><li> Transfira as células encapsuladas para frascos T para experiências de cultura ou transplante in vitro . </li></ol> 4. Controle de Qualidade e Aplicações NOTA: Para garantir a qualidade encapsulada de células e grânulos, a distribuição do tamanho do talão e a sobrevida celular após o processo devem ser quantificadas. Inverter o gel para recuperar as células dentro das contas para análise posterior é comumente executado. <ol><li> Para avaliar a distribuição do tamanho do talão, coloque as contas com azul de toluidina. <ol><li> Coloque bolinhas de 0,5 mL em 4 mL de tampão de processo contendo 10% de meio completo. </li><li> Adicionar 500 μL de uma solução de 1 g / L de toluidina preparada em tampão de processo. </li><li> Incube durante 60 minutos num tubo cónico em um agitador rotativo a 50 rpm. </li><li> Adicione 5 mL de tampão de processo contendo 10% de meio completo e immedTransfira imediatamente os grânulos e a solução para uma placa de Petri e adquira imagens em um microscópio de baixa ampliação ou usando uma câmera digital portátil. Se necessário, coloque a placa de Petri em uma caixa de luz antes de adquirir imagens com uma câmera de mão para aumentar o contraste e evitar sombras. </li><li> Execute a análise da imagem para quantificar a distribuição do tamanho do talão como descrito anteriormente 32 , por exemplo usando o freeware de análise de imagem 36 . </li></ol></li><li> Para avaliar qualitativamente a sobrevida celular, coloque as células usando homodímero de etídio para identificar células mortas e AM de calceína para identificar células vivas. <ol><li> Adicione 1 volume de pérolas a 4 volumes de buffer de processo contendo 10% de meio completo. </li><li> Adicione a quantidade apropriada de soluções de reserva de calceína AM e de homidimidio de etidio para obter concentrações de 4 μM e 2 μM, respectivamente. Gerar controles de mancha simples, adicionando apenas um dos reagentes a algumas amostras de grânulos.</li><li> Incubar as contas em gelo durante 20 min. </li><li> Coloque a solução entre um slide e lamínula usando um espaçador, como um o-ring para evitar a compressão das pérolas. </li><li> Proceda ao microscópio de fluorescência. Use os controles de mancha simples para avaliar o fluxo de fluorescência. Selecione filtros de fluorescência apropriados com base nos comprimentos de onda de excitação / emissão associados com calceína AM (494/517 nm) e homodímero de etidio ligado ao DNA (528/617 nm). </li></ol></li><li> Para recuperar as células das contas para análise posterior, desenrolar o alginato usando citrato ou outra solução quelante. <ol><li> Preparar uma solução desgastante contendo citrato 55 mM, HEPES 10 mM e NaCl 95 mM a pH 7,4. </li><li> Misture esta solução com 10% de meio e, em seguida, adicione 1 mL de pérolas de alginato a 9 mL da mistura. </li><li> Degel as contas em gelo com 75 rpm de agitação durante 20 min. NOTA: As células podem agora ser usadas para análise ou removidas da solução de alginato desengorduradoPor centrifugação. Por exemplo, a viabilidade celular após desfoliamento pode ser quantificada por coloração com Trypan Blue. Alternativamente, as células podem ser centrifugadas e lavadas, seguidas por amostragem e análise de mRNA, DNA e / ou proteína. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Várias etapas (representadas na Figura 2 ) durante a reação de gelificação interna podem limitar a cinética geral. Para grãos de carbonato de cálcio maiores do que ~ 2,5 μm, a taxa de dissolução do carbonato mostrou ser de 26 , 44 de limitação de taxa. O passo de acidificação que leva à liberação interna de cálcio também mostrou ser a variável do processo crítico que afeta a sobrevivência celular 32</sup...

O encapsulamento de células de mamíferos foi amplamente estudado como um meio para proteger as células transplantadas da rejeição imune 1 ou para fornecer um suporte tridimensional para cultura celular imobilizada 2 , 3 , 4 . O encapsulamento de ilhotas de pâncreas em esferas de alginato tem sido usado para reverter o diabetes em roedores 5 , 6 ou xenogênicos 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , xenogênicos. Ensaios pré-clínicos e clínicos de transplante de ilhotas pancreáticas encapsuladas para tratar diabetes tipo 1 estão em andamento 13 , 14 , 15 . Para aplicações de transplantes ou maioresProdução celular imobilizada in vitro , geradores de talões baseados em bico são geralmente utilizados. Tipicamente, uma mistura de alginato e células é bombeada através de um bico para formar gotículas que caem numa solução agitada contendo catiões divalentes, resultando na gelificação externa das gotículas. O fluxo de gás coaxial 16 , 17 , a vibração de bocal 18 , a repulsão eletrostática 19 ou os fios rotativos 20 facilitam a formação de gotículas na ponta do bocal. As principais desvantagens dos geradores de grânulos convencionais são a sua taxa de transferência limitada e a limitada gama de viscosidades da solução que resultarão na formação adequada de grânulos 21 . Em altas taxas de fluxo, o fluido que sai do bico quebra em gotículas menor do que o diâmetro do bocal, diminuindo o controle de tamanho. Os geradores de grânulos com vários bicos podem ser usados ​​para aumentar a produção, masA distribuição uniforme do fluxo entre as bocas e o uso de soluções&gt; 0,2 Pas é problemático 22 . Por fim, espera-se que todos os dispositivos baseados em bicos dêem algum dano aos islotes, uma vez que o diâmetro dos bicos usados ​​está entre 100 μm e 500 μm, enquanto que ~ 15% das ilhotas humanas podem ser maiores do que 200 μm 23 . Neste vídeo, descrevemos um método alternativo para encapsular células de mamíferos formando gotículas em um único passo de emulsão em vez de gota a gota. Uma vez que a produção de grânulos é realizada em um recipiente de agitação simples, o método é adequado para produção de grânulos pequenos (~ 1 mL) a grande escala (10 3 L) com baixos custos de equipamento 24 . Este método permite a produção de esferas com alta esfericidade usando uma ampla gama de viscosidades de alginato com tempos de geração de grânulos curtos ( por exemplo, 20 minutos). Este método foi desenvolvido originalmente por Poncelet et aeu. 25 , 26 e usado para imobilizar DNA 27 , proteínas 28 incluindo insulina 29 e bactérias 30 . Recorremos recentemente a estes métodos para o encapsulamento de células de mamíferos usando linhas de células pancreáticas beta 31 , 32 e tecido pancreático primário 32 . O princípio do método é gerar uma emulsão de água em óleo consistindo de gotículas de alginato em óleo mineral, seguido de gelificação interna das gotículas de alginato ( Figura 1 ). Primeiro, o encapsulante ( por exemplo, células) é disperso em uma solução de alginato contendo um sal de cálcio de grão fino com baixa solubilidade no pH do processo inicial. A mistura de alginato é então adicionada a uma fase orgânica agitada para criar uma emulsão, geralmente na presença de umaSurfactante. No caso do encapsulamento de células de mamíferos, os componentes presentes no soro podem atuar como surfactantes. Em seguida, o pH é reduzido de modo a solubilizar o sal de cálcio pela adição de um ácido solúvel em óleo que particiona na fase aquosa. O ácido acético, com um coeficiente de partição de óleo mineral / óleo &lt;0,005 33 , deve ser pré-dissolvido em óleo, depois adicionado à emulsão onde é misturado na fase oleosa e partições rápidas para a fase aquosa 34 . A Figura 2 ilustra as reações químicas e a difusão que ocorrem durante o passo de acidificação e gelificação interna. Finalmente, as células encapsuladas são recuperadas por inversão de fase, separação de fase acelerada por centrifugação, passos de lavagem repetidos e filtração. Essas etapas podem então ser seguidas por amostragem de contas e células para análises de controle de qualidade, cultura celular in vitro e / ou transplante de células encapsuladas. Figura 1: Esquema do processo à base de emulsão para encapsular células de mamíferos. As pérolas são primeiro produzidas por emulsão de uma mistura de alginato, célula e CaCO3 em óleo mineral (etapas 1 e 2 no esquema), desencadeando a gelificação interna por adição de ácido acético (passo 3). As pérolas gelificadas são então separadas do óleo adicionando um tampão aquoso para desencadear a inversão de fase (passo 4), seguida de centrifugação e aspiração de óleo (passo 5) e depois filtração (passo 6). Finalmente, as pérolas coletadas no filtro são transferidas para meio de cultura celular para cultura in vitro ou para transplante. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <imgAlt = &quot;Figura 2&quot; class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55280 / 55280fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2: Reações e etapas de difusão que ocorrem durante a gelificação interna. (1) O ácido acético é adicionado à fase orgânica e é transportado para as gotículas de alginato por convecção. (2) As partições de ácido acético na fase aquosa. (3) Na presença de água, o ácido dissocia e difunde para atingir os grãos de CaCO3 representados em azul escuro. (4) Os íons H + são trocados com os íons Ca 2 + em CaCO 3 , liberando íons Ca 2+ . (5) Os íons de cálcio difundem até encontrarem alginato não reagido, levando à reticulação ionotrópica das cadeias de alginato. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> Contrariamente aos encapsuladores de células convencionais baseados em bicos, uma ampla distribuição de tamanho de talão é expeCitado deste processo devido ao mecanismo de formação de gotículas em emulsificação agitada. Para um subconjunto de aplicativos, essa distribuição de tamanho de talão pode ser problemática. Por exemplo, uma maior fração de células pode ser exposta na superfície do talão em pérolas menores. Se as limitações de nutrientes ( por exemplo, oxigênio) são uma preocupação, essas limitações podem ser exacerbadas em grânulos maiores. Uma vantagem do método de emulsificação agitada é que o tamanho médio do talão pode ser facilmente ajustado alterando a taxa de agitação durante o passo de emulsão. A distribuição ampla do tamanho do talão também pode ser explorada para estudar o efeito do tamanho do talão no desempenho da célula encapsulada. O encapsulamento de células de mamíferos por emulsificação e gelificação interna é uma alternativa interessante para laboratórios que não estão equipados com um gerador de notas. Além disso, este método oferece aos usuários a opção de reduzir o tempo de processamento ou gerar grânulos com concentrado de alginato muito baixo ou muito altoAções. O protocolo descrito abaixo descreve como encapsular células em 10,5 mL de solução de alginato a 5% preparada em tampão de ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico 10 mM (HEPES) 10 mM. O alginato consiste em uma mistura 50:50 de LVM de grau de transplante (teor de ácido manurônico de baixa viscosidade e alto teor de ácido gulurônico com viscosidade média). O carbonato de cálcio na concentração final de 24 mM é utilizado como agente de reticulação física. O óleo mineral leve constitui a fase orgânica, enquanto o ácido acético é usado para acidificar a emulsão e desencadear a gelificação interna. No entanto, o tipo e composição de alginato, bem como o buffer de processo selecionado dependem da aplicação desejada 32 . Uma variedade de tipos de alginato (ver Tabela de materiais) foram utilizados para produzir esferas com este protocolo.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes e consumíveis</forte></td>alginato de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LVM (grau de transplante)</td><td>Novamatrix</td><td>Não aplicável</td><td>Referido como "alginato #1" nos resultados.</td></tr><tr><td>Alginato MVG (grau de transplante)</td><td>Novamatrix</td><td>Não aplicável</td><td>Referido como "alginato #2" nos resultados.</td></tr><tr><td>Alginato (grau de cultura de células)</td><td>Sigma</td><td>A0682 (baixa viscosidade) ou A2033 (viscosidade média)</td><td>A2033 é referido como "alginato #3" nos resultados.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, caracterizado, origem canadense</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina e estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, cultura de células testada</td><td>Sigma</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Avantor Materiais</td><td>1301-01</td><td>Após a preparação da suspensão de CaCO3, sonicar e utilizar no prazo de um mês.</td></tr><tr><td>Óleo mineral leve</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O121-4</td><td>Filtro estéril através de um filtro de 0,22 &mu; m antes do uso.</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>Manuseie com cuidado: consulte MSDS.</td></tr><tr><td>Espátulas estéreis</td><td>Sigma</td><td>CLS3004-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células de nylon estéreis, 40 &micro; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 e 86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>Toluidina Blue-O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td><forte>equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ml frascos giratórios microcarrier</td><td>Bellco</td><td>1965-00100</td><td>A configuração do impulsor com modelos recentes pode não ser adequada para uma emulsificação adequada. Uma lâmina capaz de varrer o óleo até 0,5 cm do fundo do frasco pode ser feita sob medida a partir de uma folha de Teflon.</td></tr><tr><td>Placa de agitação magnética com velocidade ajustável</td><td>Bellco</td><td>7760-06005</td><td>A velocidade de rotação deve ser calibrada (por exemplo, usando um tacômetro) antes do uso.</td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Innovatis</td><td>Cedex AS20</td><td>Este sistema agora é vendido pela Roche. Este contador de células automatizado também pode ser substituído pela enumeração manual de células após a coloração com azul de tripano usando um hemocitômetro.</td></tr><tr><td>Caixa de luz LED</td><td>Artograph</td><td>LightPad&reg; PRO</td><td>Este item pode ser substituído por outros tipos de iluminadores.</td></tr><tr><td>Câmera de mão</td><td>Canon</td><td>PowerShot A590 IS</td><td>Uma variedade de câmeras portáteis pode ser usada para capturar imagens de contas manchadas de toluidina blue-o. Uma régua deve ser colocada ao lado da placa de Petri contendo as contas antes de adquirir as imagens.</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência com contraste de fase e filtros de fluorescência adequados</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>Vários sistemas de microscopia foram usados para obter imagens das contas. Os resultados mostrados aqui foram obtidos com um microscópio IX81 equipado com filtros de fluorescência GFP e TRITC. Para capturar contas inteiras, objetivas de 4X a 20X foram usadas, dependendo da taxa de agitação. Imagens de coloração vivas/mortas foram normalmente capturadas com objetivas de 20X a 40X.</td></tr><tr><td>Software de aquisição de imagens</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td><td>Uma variedade de softwares de aquisição de imagens pode ser usada para adquirir imagens de contraste de fase e fluorescência.</td></tr><tr><td>Freeware de análise de imagem</td><td>CellProfiler</td><td>Não aplicável</td><td>Uma variedade de software de análise de imagem pode ser usada para identificar contas como objetos e analisar o tamanho da conta (por exemplo, ImageJ).</td></tr></tbody></table>

encapsulamento de células de mamífero em grânulos de alginato usando um recipiente agitado simples

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

O encapsulamento celular em pérolas de alginato foi utilizado para cultura celular imobilizada in vitro , bem como para imuno-isolação in vivo . O encapsulamento de ilhotas pancreáticas tem sido amplamente estudado como meio de aumentar a sobrevivência de ilhotas em transplantes alogênicos ou xenogênicos. O encapsulamento de alginato é geralmente alcançado por extrusão de bicos e gelificação externa. Usando este método, as gotículas de alginato contendo células formadas na ponta dos bocais caem em uma solução contendo catiões divalentes que causam a gelificação ionotrópica de alginato à medida que se difundem nas gotículas. O requisito para a formação de gotículas na ponta do bico limita o rendimento volumétrico e a concentração de alginato que podem ser alcançados. Este vídeo descreve um método de emulsificação escalável para encapsular células de mamífero em alginato de 0,5% a 10% com sobrevivência celular de 70% a 90%. Por este método alternativo, as gotículas de alginato contendo células e carbonato de cálcio são emulsionadas em óleo mineral, folBaixada por uma diminuição do pH, levando à liberação interna de cálcio e à gelação de alginato ionotrópico. O método atual permite a produção de pérolas de alginato dentro de 20 min de emulsificação. O equipamento necessário para o passo de encapsulação consiste em recipientes de agitação simples disponíveis para a maioria dos laboratórios.

<html> No final do processo de emulsão e gelificação interna, um volume de talão semelhante ao volume inicial da mistura de alginato e célula deve ser recuperado. As contas devem ser altamente esféricas com alguns defeitos ( Figura 3 ). As pérolas devem ser suficientemente resistentes para resistir a pipetagem através de pipetas de grande diâmetro. A altas concentrações de alginato, gotas de óleo ou ar encapsuladas podem ser observadas nas pérolas. Isto prova...

Este vídeo e manuscrito descrevem um método baseado em emulsão para encapsular células de mamífero em pérolas de alginato de 0,5% a 10% que podem ser produzidas em grandes lotes usando um vaso de agitação simples. As células encapsuladas podem ser cultivadas in vitro ou transplantadas para aplicações de terapia celular.

Encapsulamento de células de mamífero em grânulos de alginato usando um recipiente agitado simples

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Este vídeo descreve um método para imobilizar células de mamíferos, como ilhotas pancreáticas, em microesferas de alginato utilizando um recipiente simples com agitação. O princípio do método consiste em gerar gotículas de alginato por meio de emulsão entre água e óleo, seguido pela gelificação interna das gotículas de alginato. O primeiro passo do procedimento consiste em gerar uma emulsão na qual uma fase aquosa contendo células, alginato e carbonato de cálcio é dispersa em uma fase orgânica de óleo mineral.O segundo passo é acidificar a emulsão adicionando um ácido solúvel em óleo, como o ácido acético, que se distribui rapidamente na fase aquosa. A queda de pH leva à dissolução do carbonato de cálcio e à gelificação interna das gotículas de alginato em microesferas. O passo final consiste em recuperar as microesferas da emulsão adicionando uma solução aquosa, separando as fases por centrifugação, seguido de lavagem e filtração das microesferas.As células imobilizadas podem então ser cultivadas in vitro ou utilizadas para transplante. O método que descrevemos é uma alternativa ao uso de encapsuladores de células baseados em bicos para gerar microcápsulas de alginato. Este foi derivado de um método para imobilização de enzimas e células microbianas, primeiramente descrito por Poncelet e outros em 1992.A aplicação que mais nos interessa é a encapsulação com alginato como um meio para imunoisolar células transplantadas, com o objetivo de reduzir ou até eliminar a necessidade de medicamentos anti-rejeição. As principais vantagens do processo baseado em emulsão em comparação com dispositivos baseados em bicos são sua escalabilidade e sua robustez. Como as gotículas são geradas quase simultaneamente, quantidades muito grandes de microesferas podem ser produzidas em períodos de tempo muito curtos, a partir de soluções de alginato muito diluídas ou muito concentradas.Além disso, o processo é muito robusto e não está sujeito a falhas, mesmo na presença de partículas que poderiam obstruir bicos, e, por fim, o equipamento necessário é relativamente simples, acessível e de baixo custo para a maioria dos laboratórios. As etapas principais do processamento são a emulsificação para formar as gotas de alginato e a acidificação para liberar a fonte interna de cálcio. O tamanho das gotas é influenciado principalmente pelo design do agitador, pela taxa de agitação e pela duração da agitação.As propriedades mecânicas das microesferas e a sobrevivência celular são influenciadas pelo grau e duração da acidificação. Neste vídeo, demonstramos um método utilizado para encapsular células em microesferas de alginato a 5% para transplante. Esses parâmetros provavelmente exigiriam otimização para outras possíveis aplicações.Para gerar esferas de alginato a 5% contendo uma mistura meio a meio de alginatos LVM e MVG, pese 583 miligramas de alginato LVM e 583 miligramas de alginato ácido em pó MVG. Coloque 20 mililitros de tampão de processo em uma placa de agitação magnética. Para aplicações de transplante, utilizamos um tampão HEPES 10 milimolar contendo cloreto de sódio 170 milimolar em pH 7,4.Adicione progressivamente o pó de ácido algínico à solução. Deixe a solução sob agitação durante a noite em velocidade baixa. Se necessário, prenda o frasco à placa de agitação.No dia seguinte, se o alginato não estiver completamente dissolvido, prenda o frasco em um misturador rotativo e continue a mistura durante a noite a 37 graus Celsius. Uma vez que o alginato esteja completamente dissolvido, esterilize a solução por autoclavação durante 30 minutos. Aguarde a temperatura cair abaixo de 50 graus Celsius antes de abrir o autoclave.Prepare a suspensão de carbonato de cálcio adicionando um grama de carbonato de cálcio a 20 mililitros de tampão do processo. Autoclave a suspensão de carbonato de cálcio e o recipiente com agitação usado para o processo de emulsificação. Antes do uso, remova qualquer vestígio de água condensada do recipiente.Imediatamente antes do processo de emulsificação, dissolva 44 microlitros de ácido acético glacial em 11 mililitros de óleo mineral colocados em um tubo cônico de 50 mililitros. Um erro comum é a dissolução incompleta do ácido acético; evite pipetar volumes menores que 10 microlitros e certifique-se de que o ácido esteja completamente dissolvido mediante vortexagem repetida. Deixe todas as soluções atingirem a temperatura ambiente antes de prosseguir com a encapsulação celular.Coloque 10 mililitros de óleo mineral no frasco agitador e inicie a agitação a 250 RPM. Se células aderentes, como as células beta-tc3, forem utilizadas, faça a tripsinização das células. Interrompa a reação adicionando o meio completo e colete uma amostra para enumeração celular.Determine a concentração celular manualmente ou com um contador de células automatizado. Centrifugue as células por sete minutos a 300 g e, em seguida, re-suspenda o pellet celular em meio completo. Repita a etapa de centrifugação e, então, re-suspenda as células no volume apropriado de meio completo para obter uma concentração final 10 e 1/2 vezes maior do que a desejada nas microesferas.Transfira 9,9 mililitros da solução de alginato para um tubo com fundo plano, adicione então 1,1 mililitro do estoque de células e 550 microlitros da suspensão de carbonato de cálcio. Misture o alginato, o carbonato de cálcio e a suspensão celular por meio de vortexagem suave. Transfira imediatamente 10,5 mililitros dessa mistura para o óleo em agitação utilizando uma seringa.Aumente a taxa de agitação e, em seguida, inicie o cronômetro. Para determinar a taxa de agitação, uma curva padrão relacionando o tamanho das esferas com a taxa de agitação deve ser previamente gerada. Após 12 minutos, adicione 10 mililitros da solução de óleo e ácido acético para acidificar a emulsão, liberar o cálcio do carbonato e obter esferas gelificadas.Permita oito minutos para esta etapa de gelificação interna. Observe a mudança de cor das gotículas emulsificadas que contêm o indicador de pH vermelho de fenol. Reduza a velocidade de agitação para 400 rpm e neutralize o ácido adicionando 40 mililitros de tampão de processo misturado com 10% de meio, o que leva à inversão de fase.Interrompa a agitação um minuto depois e transfira a mistura para tubos cônicos. Enxágue o frasco agitador com mais 20 mililitros de meio e adicione isso aos tubos. Aspire tanta quanto possível da solução aquosa antes de aspirar a fase oleosa.Centrifugue os tubos por três minutos a 630 g para acelerar a sedimentação das esferas e a separação de fases. Remova o óleo e o tampão de processo em excesso por aspiração com uma pipeta de Pasteur. Lave as esferas pelo menos uma vez com meio utilizando centrifugação a 630 g entre as lavagens.Filtre a suspensão de microesferas em peneiras de células de náilon de 40 micrômetros e aspire o líquido excedente na peneira por baixo. Transfira as microesferas para um volume conhecido de meio utilizando uma espátula. Meça o volume das microesferas e complete com o meio para obter a concentração desejada de microesferas.Uma concentração típica é um mililitro de microesferas por cinco mililitros de volume total. A partir deste ponto, manipule sempre as microesferas com pipetas de grande diâmetro para evitar danificá-las. As células encapsuladas podem agora ser transferidas para frascos do tipo T e utilizadas para cultura in vitro ou transplante.No final do processo de emulsão, devem ser obtidas microesferas de alginato contendo células imobilizadas. Após o processo, a distribuição do tamanho das microesferas e a sobrevivência celular devem ser avaliadas rotineiramente. Para determinar a distribuição do tamanho das microesferas, as microesferas podem ser coradas com azul de toluidina, seguido de análise de imagem.Espera-se uma distribuição ampla de tamanhos de microesferas a partir desse processo. Para avaliar a sobrevivência celular, as microesferas podem ser incubadas com corantes de viabilidade, como calceína-AM e etídio homodímero. Utilizando o processo descrito neste vídeo, foi medida a sobrevivência de 76% das células beta-tc3.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como imobilizar células de mamíferos em microesferas de alginato utilizando um sistema simples com agitação. O protocolo básico apresentado neste vídeo deve ser adequado para imobilizar uma variedade de tipos celulares utilizando diferentes tipos e concentrações de alginato. Recomendamos gerar uma curva padrão relacionando o tamanho médio das microesferas à velocidade de agitação com cada novo lote de alginato ou óleo.O processo de emulsificação que descrevemos é uma alternativa promissora aos encapsuladores celulares baseados em bicos. É um método robusto e simples para imobilizar células de mamíferos em microesferas de alginato. À medida que nós e outros pesquisadores ao redor do mundo desenvolvemos terapias celulares com bicos, métodos em tal escala serão necessários para os milhares de pacientes diabéticos.Publicamos resultados promissores do transplante de uma linhagem de células beta em microesferas de alginato a 5%, e continuamos a investigar o desempenho in vivo desta barreira aprimorada contra a rejeição de transplantes.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós apresentamos os protocolos para o 3-dimensional encapsulamento (3D) de células dentro de hidrogéis sintéticos. O procedimento de encapsulamento é descrito por dois métodos comumente utilizados de reticulação (michael tipo adição e light-iniciado livre mecanismos radical), bem como uma série de técnicas para avaliar o comportamento das células encapsuladas.

O encapsulamento celular em Hidrogéis 3D para Engenharia de Tecidos

Nas seções seguintes, que definirá procedimentos para a preparação de microesferas de alginato para uso em aplicações biomédicas. Nós especificamente ilustram uma técnica para a criação de várias camadas de alginato microesferas para a dupla finalidade de célula e de encapsulamento proteína como um tratamento potencial para a diabetes tipo 1.

Geração de alginato Microesferas para aplicações biomédicas

Este vídeo demonstra um método para fabricar microesferas de polímero que encapsulam células secretoras de beta-amilóide neurotóxicas. A suspensão célula-polímero é processada por meio de um dispositivo de fabricação de microesferas, com gelificação de polímero obtida por meio de reticulação de cálcio, formando microesferas esféricas ao redor das células. O polímero permite a proliferação celular enquanto permite a liberação controlada e de longo prazo de beta-amilóide, simulando seu acúmulo na...

Fabricação de microesferas de polímero liberador de beta-amilóide para modelagem da doença de Alzheimer

Aqui, apresentamos um protocolo para encapsulamento de células catabólicas, que consomem lipídios para produção de calor no tecido adiposo intra-abdominal e aumentam a dissipação de energia em camundongos obesos.

Encapsulation termogênico pré-adipócitos para transplante em adiposo Depots Tissue

Estabelecemos um método de encapsulamento de células-tronco pluripotentes (células PS) em cápsulas de hidrogel de alginato usando um bico coaxial.  Isso evita que as células se agreguem excessivamente e limita a tensão de cisalhamento experimentada pelas células em cultura em suspensão.  A técnica é aplicável à produção em massa de células PS, bem como à pesquisa de nicho de células-tronco.

Encapsulation alginato de pluripotentes células estaminais utilizando um bocal Co-axial

Apresentado é o protocolo para biocatalisadores de célula inteira co-imobilização para a regeneração de cofactor e melhorada a capacidade de reutilização, utilizando a produção de L-xilulose como um exemplo. A regeneração cofator é conseguido acoplando duas estirpes de Escherichia coli que expressam enzimas funcionalmente complementares; a imobilização de células inteiras biocatalisador é conseguido por encapsulação de células em esferas de alginato de cálcio.

Imobilização de Multi-biocatalisadores em alginato Beads para Cofator Regeneração e melhorada Reutilização

Engenharia e análise de tecidos de suporte de carga com populações de células heterogêneas ainda são um desafio. Aqui, descrevemos um método para criar discos de hidrogel de alginato em duas camadas como uma plataforma para co-cultura de diversas populações de células dentro de uma construção.

Em camadas de alginato Constrói: Uma Plataforma para Co-cultura de populações de células heterogéneas

Este protocolo ilustra um método de encapsulamento da pilha pela gelação física rápida do alginato para imobilizar pilhas. Os microgrânulos obtidos permitem a secreção controlada e sustentada de amiloide-β ao longo do tempo e podem ser usados para estudar os efeitos do amilóide-β secretado em modelos in vitro e in vivo.

Fabricação de microgrânulos de alginato de secreção de amiloide-β para uso na modelagem da doença de Alzheimer

Apresentado aqui é um protocolo para o uso de alginato como polímero na microencapsulação de células imortalizadas para entrega a longo prazo de biológicos aos olhos de roedores.

Tecnologia celular encapsulada para a entrega de biológicos ao olho do rato

Apresentados aqui estão dois protocolos para o encapsulamento de oócitos suínos em condições culturais 3D. No primeiro, os complexos cumulus-oocyte (COCs) são encapsulados em contas fibrina-alginato. No segundo, são fechados com partículas fluoradas de propileno de etileno (microbioreatores). Ambos os sistemas garantem condições ideais para manter sua organização 3D.

Hidrogéis alginatos desordeiros descabidos proteolíticos e microbiorreatores hidrofóbicos para encapsulamento de oócito suíno

Aprenda a encapsular células de mamífero em grânulos de alginato usando um recipiente agitado simples. Este método emulsão-ácido permite produção escalável para aplicações em terapia celular e engenharia de tecidos.

Encapsulamento de células de mamífero em grânulos de alginato usando um recipiente agitado simples

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