Encapsulamento de células de mamífero em grânulos de alginato usando um recipiente agitado simples

Este vídeo descreve um método para imobilizar células de mamíferos, como ilhotas pancreáticas em grânulos de alginato, usando um vaso agitado simples. O princípio do método é gerar gotículas de alginato por emulsão de água e óleo, seguida de gelificação interna das gotículas de alginato. A primeira etapa do procedimento consiste em gerar uma emulsão onde uma fase aquosa contendo células de alginato e carbonato de cálcio é dispersa em uma fase orgânica de óleo mineral.

O segundo passo é acidificar a emulsão adicionando um ácido solúvel em óleo, como o ácido acético, que se divide rapidamente na fase aquosa. A queda do pH leva à dissolução do carbonato de cálcio e à gelificação interna das gotículas de alginato em grânulos. A etapa final consiste em recuperar os grânulos da emulsão adicionando uma solução aquosa, separando as fases por centrifugação, seguida de lavagem e filtragem dos grânulos.

As células imobilizadas podem então ser cultivadas in vitro ou usadas para transplante. O método que descrevemos é uma alternativa ao uso de encapsuladores de células baseados em bicos para gerar grânulos de alginato. Isso foi derivado de um método para enzimas e imobilização de células microbianas, relatado pela primeira vez por Poncelet e outros em 1992.

A aplicação que mais nos interessa é o encapsulamento de alginato como meio de imunoisolar células transplantadas, de modo a reduzir ou mesmo eliminar a necessidade de medicamentos anti-rejeição. As principais vantagens do processo baseado em emulsão em relação aos dispositivos baseados em bicos são sua escalabilidade e robustez. Como as gotículas são geradas quase simultaneamente, quantidades muito grandes de grânulos podem ser produzidas em períodos muito curtos de tempo, a partir de soluções de alginato muito diluídas ou muito concentradas.

Além disso, o processo é muito robusto e não é propenso a falhas, e mesmo na presença de partículas que podem obstruir os bicos e, finalmente, o equipamento de processo é bastante simples e, portanto, acessível, de custo relativamente baixo para a maioria dos laboratórios. As principais etapas de processamento são a emulsificação para formar as gotículas de alginato e a acidificação para liberar a fonte interna de cálcio. O tamanho da gota é influenciado principalmente pelo projeto do impulsor, taxa de agitação e duração da agitação.

As propriedades mecânicas dos grânulos e a sobrevivência celular são influenciadas pela extensão e duração da acidificação. Neste vídeo, demonstramos um método usado para encapsular células em esferas de alginato a 5% para transplante. Esses parâmetros provavelmente exigiriam otimização para outras aplicações potenciais.

Para gerar grânulos de alginato a 5% contendo uma mistura meio a meio de alginatos LVM e MVG, pesar 583 miligramas de LVM e 583 miligramas de ácido algínico MVG em pó. Coloque o tampão de processo de 20 mililitros em uma placa de agitação magnética. Para aplicações de transplante, usamos um tampão HEPES de 10 milimolares contendo cloreto de sódio 170 milimolar em pH 7,4.

Adicione progressivamente o pó de ácido algínico à solução. Deixe a solução mexendo durante a noite em velocidade baixa. Se necessário, fixe o balão à placa de agitação.

No dia seguinte, se o alginato estiver incompletamente dissolvido, prenda o frasco em um misturador rotativo e continue misturando durante a noite a 37 graus Celsius. Assim que o alginato estiver completamente dissolvido, esterilize a solução em autoclavagem por 30 minutos. Deixe a temperatura cair abaixo de 50 graus Celsius antes de abrir a autoclave.

Prepare a suspensão de carbonato de cálcio adicionando um grama de carbonato de cálcio a 20 mililitros de tampão de processo. Autoclave a suspensão de carbonato de cálcio e o recipiente agitado usado para o processo de emulsão. Antes de usar, remova quaisquer vestígios de água condensada do recipiente.

Imediatamente antes do processo de emulsão, dissolver 44 microlitros de ácido acético glacial em 11 mililitros de óleo mineral colocado em um tubo cônico de 50 mililitros. Um erro comum é a dissolução incompleta do ácido acético, evite pipetar quantidades menores que 10 microlitros e certifique-se de que o ácido seja completamente dissolvido por vórtice repetido. Deixe todas as soluções atingirem a temperatura ambiente antes de prosseguir para o encapsulamento da célula.

Coloque 10 mililitros de óleo mineral no frasco giratório e comece a mexer a 250 RPM. Se células aderentes, como células beta-tc3, forem usadas, tripsinize as células. Termine a reação adicionando meio completo e pegue uma amostra para enumeração de células.

Determine a concentração da célula manualmente ou com um contador de células automatizado. Centrifugar as células durante sete minutos a 300 g e, em seguida, ressuspender o palete de células em meio completo. Repita a etapa de centrifugação e, em seguida, ressuspenda as células no volume apropriado de meio completo para obter 10 e 1/2 vezes a concentração final desejada nos grânulos.

Transfira a solução de alginato de 9,9 mililitros para um tubo de fundo plano e, em seguida, adicione 1,1 mililitro do estoque de células e 550 microlitros da suspensão de carbonato de cálcio. Misturar o alginato, o carbonato de cálcio e a suspensão celular por vórtice suave. Transfira imediatamente 10,5 mililitros desta mistura para o óleo agitador usando uma seringa.

Aumente a taxa de agitação e inicie o cronômetro. Para determinar a taxa de agitação, uma curva padrão relacionando o tamanho do cordão com a taxa de agitação deve primeiro ser gerada. Após 12 minutos, adicione 10 mililitros da solução de óleo e ácido acético para acidificar a emulsão, liberar o cálcio do carbonato e obter grânulos gelificados.

Aguarde oito minutos para esta etapa de gelificação interna. Observe a mudança de cor das gotículas emulsionadas que contêm o indicador de pH vermelho de fenol. Reduza a taxa de agitação para 400 RPM, neutralize o ácido adicionando 40 mililitros de tampão de processo misturado com 10% de meio, o que leva à inversão de fase.

Pare a agitação um minuto depois e transfira a mistura para tubos cônicos. Lave o balão giratório com mais 20 mililitros de meio e adicione-o aos tubos. Aspirar o máximo possível da solução aquosa antes de aspirar a fase oleosa.

Centrifugar os tubos durante três minutos a 630 g para acelerar a sedimentação do grânulo e a separação de fases. Remova o óleo e o excesso de tampão do processo aspirando com uma pipeta Pasteur. Lavar os grânulos pelo menos uma vez com meio com centrifugação de 630 g entre lavagens.

Filtre a suspensão do cordão em filtros de células de náilon de 40 mícrons e aspire o excesso de líquido no filtro por baixo. Transfira as contas para um volume conhecido de meio usando uma espátula. Meça o volume do grânulo e complete o meio para obter a concentração desejada do grânulo.

Uma concentração típica é de um mililitro por cinco mililitros de volume total. A partir deste ponto, sempre manuseie as esferas com pipetas de grande diâmetro para evitar danificá-las. As células encapsuladas agora podem ser transferidas para frascos T e usadas para cultura ou transplante in vitro.

No final do processo de emulsão, devem ser obtidas esferas de alginato contendo células imobilizadas. Após o processo, a distribuição do tamanho do grânulo e a sobrevivência celular devem ser avaliadas rotineiramente. Para determinar a distribuição do tamanho do grânulo, os grânulos podem ser corados com azul de toluidina, seguido de análise de imagem.

Uma ampla distribuição do tamanho do cordão é esperada desse processo. Para avaliar a sobrevivência celular, as esferas podem ser incubadas com corantes mortos-vivos, como calceína-AM e homodímero de etídio. Usando o processo descrito neste vídeo, 76% de sobrevivência das células beta-tc3 foi medida.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como imobilizar células de mamíferos em grânulos de alginato usando um sistema simples de agitação. O protocolo básico mostrado neste vídeo deve ser adequado para imobilizar uma variedade de tipos de células usando uma ampla gama de tipos de alginato e calcitrações. Recomendamos gerar uma curva padrão relacionando o tamanho médio do grânulo com a taxa de agitação a cada novo lote de alginato ou óleo.

O processo de emulsificação que descrevemos é uma alternativa promissora aos encapsuladores de células baseados em bicos. É um método robusto e simples para imobilizar células de mamíferos em grânulos de alginato. À medida que nós e outros ao redor do mundo desenvolvemos terapias com células bicos, essa escala de métodos será necessária para os muitos milhares de pacientes diabéticos.

Publicamos resultados promissores do transplante de uma linhagem de células beta em grânulos de 5% de alginato e continuamos a explorar o desempenho in vivo dessa barreira aprimorada à rejeição do transplante.