Monitoramento de mudanças na estrutura Equilibrium RNA por "peroxidativo" e "oxidativo" Footprinting Radical Hidroxila

O objetivo geral do experimento a seguir é verificar como as moléculas de RNA se dobram usando a pegada do radical hidroxila. Isso é obtido por marcação final, purificação em gel e pré-dobramento do RNA, o que garante a integridade confirmacional do RNA antes do dobramento mediado por magnésio como etapa seguinte, os reagentes de Fenton são misturados para gerar radicais hidroxila, que podem subsequentemente clivar a estrutura do RNA de acordo com sua acessibilidade ao solvente. Em seguida, os produtos de clivagem do RNA são separados por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante e visualizados por autorradiografia.

As integrais de banda são quantificadas por software de análise de pegada semiautomatizada. O objetivo final é gerar isotermas de dobramento refletindo a formação da estrutura terciária do RNA. Isso é feito dimensionando as integrais de banda normalizadas para saturação fracionária.

As isotermas podem ser posteriormente ajustadas à equação de hill. A principal vantagem da pegada hidroxi é que você obtém informações da estrutura terciária do RNA usando produtos químicos baratos devido à maior atividade em radicais hidroxi de tamanho pequeno são sondas perfeitas para distinguir entre nucleotídeos acessíveis a solventes e enterrados. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia estrutural do RNA.

Por exemplo, como os ribossomos empregam íons metálicos para alcançar sua confirmação ativa? A pegada do radical hidroxi pode ser usada para entender os fundamentos da especificidade e reconhecimento do RNA. Além de revelar informações sobre a estrutura terciária do RNA, este método pode ser usado para determinar os locais precisos de ligação a proteínas no RNA ou em moléculas de DNA.

Os principais desafios deste método são evitar a degradação da amostra pela ribonuclease e otimizar a concentração de ferro para obter a quantidade certa de clivagem de RNA. Além disso, a análise detalhada dos intervalos de banda pode ser bastante complicada. O principal benefício deste vídeo é ajudar o público a entender os estágios de planejamento e a execução bem-sucedida do experimento de pegada de radical hidroxi Antes do início deste protocolo, prepare toda a pegada em reagentes conforme descrito no protocolo escrito.

Acompanhando este vídeo, o RNA pode ser produzido DFOs quatro relacionados e rotulados como final conforme descrito lá. Purifique o RNA marcado radioativamente usando eletroférese em gel desnaturante. Recupere o RNA purificado por duas extrações de gel subsequentes usando acetato de sódio 0,3 molar.

Em seguida, precipite o RNA misturando 0,5 mililitros da solução aquosa com um mililitro de etanol. Incubar a mistura durante um minuto em gelo seco Depois de centrifugar a amostra, rejeitar o supinato. Lave o pellet de RNA com etanol 70%.

Remova o supinato após centrifugação adicional e seque o pellet no vácuo. Em seguida, dissolva as amostras de RNA marcadas com P 32 purificadas. Em 330 microlitros de tampão de reação de uma vez, pipete 30 microlitros da solução de RNA em um novo tubo de reação.

Precipite o RNA com etanol e, em seguida, seque o pellet no vácuo depois de seco, este pellet pode ser usado para gerar a escada de referência conforme descrito no procedimento escrito para a natureza da solução de RNA tamponada restante aquecendo a 95 graus Celsius por dois minutos. Chame as amostras à temperatura ambiente por 15 minutos e siga com uma rotação rápida para trazer o condensado de volta à solução. Para iniciar o experimento de pegada, configure 27 tubos de reação para amostras suficientes para encher um gel de eletroforese de 30 poços.

Depois de incluir as escadas e o controle clivado, determine as concentrações finais de ferro de magnésio de modo que sejam espaçadas uniformemente em uma escala logarítmica em várias ordens de magnitude em torno da preparação do ponto médio de titulação dos íons de magnésio em um tampão de reação de uma vez é descrito no texto separadamente. Incube o RNA e as soluções de íons de magnésio a 50 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, misture 10 microlitros da solução de RNA com 90 microlitros da quantidade correspondente de solução de ferro e magnésio.

Para atingir um volume final de 100 microlitros, incube cada mistura por 30 minutos a 50 graus Celsius. Posteriormente, permita que as soluções se equilibrem a 25 graus Celsius por uma hora enquanto ocorre o dobramento do RNA. Enquanto isso, imediatamente antes de iniciar a pegada do radical hidroxila em reação, prepare a mistura de reação fantasma conforme descrito no protocolo escrito.

Prepare a reação de peroxidação pipetando duas gotículas de microlitros de ferro, EDTA, ascorbato de sódio e peróxido de hidrogênio na parte superior do tubo de reação que contém a solução de RNA, de modo que as gotículas não se toquem. Inicie a reação de pegada por meio de uma mistura vigorosa. Após 15 segundos, pare a reação adicionando 300 microlitros de etanol frio puro.

Gire os tubos três a cinco vezes. Finalmente, precipite, lave e seque o pellet conforme realizado anteriormente como alternativa à reação per oxidativa, a reação oxidativa de hidroxila seria realizada adicionando cinco microlitros da mistura de reação de Fenton recém-preparada às amostras. Incube a reação oxidativa por 30 minutos a 25 graus Celsius.

Em seguida, adicione 300 microlitros de etanol frio puro para extinguir a reação e misture girando os tubos. Mais uma vez, precipite. Lave e seque o pellet após a conclusão da reação per oxidativa ou oxidativa.

Dissolva os grânulos de RNA secos em oito microlitros de corante de carregamento de gel dois. Confirme se o RNA marcado com P 32 é ressuspenso usando um contador geer, prepare um gel de sequenciamento de poliacrilamida 8% desnaturante de acordo com os protocolos padrão. Usando um pente de 30 poços, carregue as amostras, incluindo duas referências e um controle clivado.

Separe os fragmentos de RNA em 60 a 75 watts por duas horas e meia. Exponha o gel seco a uma tela de fosfato de armazenamento durante a noite. Digitalize a tela de fosfato com um sistema de imagem para auto-radiografia sem filme.

Em seguida, transfira o arquivo de imagem de gel para o computador para análise. Para iniciar a análise de dados, abra o Safa e o software de código aberto para ajuste e quantificação de banda única. Carregue a sequência de RNA como um arquivo TXT de ponto seguido pela imagem de gel como um arquivo de gel de ponto.

Defina as faixas e ajuste as intensidades da banda. Em seguida, escolha uma pista de ancoragem e execute uma atribuição de alinhamento de gel de bandas para nucleotídeos ocorre em referência aos RNAs T uma escada de digestão. Quantifique as intensidades da banda e use o recurso de plotagem de cores de barra de normalização para normalizar e atribuir resíduos potencialmente invariantes.

Salve a saída como um arquivo txt. O SFA gera uma planilha contendo colunas, representando pistas no gel e linhas representando as integrais de banda individuais correspondentes ao fragmento de RNA. Primeiro, os locais de proteção que exibem uma mudança perceptível na acessibilidade ao solvente devem ser identificados comparando o perfil de proteção derivado da amostra sem íons de magnésio com o perfil da concentração de íons de magnésio final.

Quanto menor o valor, mais protegido o nucleotídeo está contra o ataque dos radicais hidroxila e vice-versa. Em seguida, crie curvas de transição de banda, intensidades de indivíduos ou grupos de nucleotídeos versus concentração de ferro de magnésio usando um formato de planilha dimensionar individualmente essas transições para a função de saturação fracionária, conforme descrito na parte de texto deste protocolo. Como etapa final, ajuste os dados à equação de hill.

Esta análise dimensiona a transição para saturação fracionária, determina o ponto médio da transição e fornece um teste fenomenológico para saber se uma transição é mostrada sigmoidalmente. Aqui estão os resultados representativos de experimentos de pegada de radical hidroxila P quatro P seis RRNA. As isotermas foram derivadas de géis de sequenciamento analisados por Safa e, em seguida, ajustados conforme descrito na seção de análise.

A imagem do gel indica que a clivagem de fundo é mínima e que a atribuição de um único nucleotídeo é possível devido a bandas bem definidas na pista T. A fragmentação induzida pelo radical hidroxila do RNA está bem acima do fundo. A transição de íons de baixo para alto magnésio é seletivamente associada à diminuição da intensidade de indivíduos e grupos de bandas, indicando a formação de RNA.

A proteção da estrutura terciária refere-se a nucleotídeos únicos ou grupos de nucleotídeos contíguos cujas mudanças de clivagem são concomitantemente quantificadas e normalizadas por análise de açafrão. A saída é um gráfico térmico que visualiza o grau de proteção contra radicais hidroxila. A transição de cores descreve a mudança de acessibilidade após a adição de magnésio e ferro, branco a vermelho mostra nucleotídeos mais acessíveis, enquanto branco a azul mostra nucleotídeos mais protegidos.

Cada grau de sombreamento é afiliado a um valor numérico, que pode ser plotado como uma curva de proteção e analisado por um modelo de ligação, como a equação de Hill. Neste exemplo, a constante de dissociação de equilíbrio de afiliado com proteção 1 5 3 a 1 5 5 é aproximadamente o dobro do valor correspondente de proteção 1 6 3 a 1 6 4. Este experimento de pegada de radical hidroxi pode ser feito em um dia e meio se for realizado corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar luvas e jaleco para evitar qualquer contaminação por RNAs. Além disso, a concentração final de ferro depende do sistema experimental. Portanto, recomendamos realizar um experimento de resposta à dose antes de colocar a pegada seguindo este procedimento.

Outros métodos, como a pegada de radical hidroxi resolvida no tempo, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Por exemplo, em que momento crítico as moléculas de RNA atingem uma confirmação mal dobrada ou ativa após seu desenvolvimento? Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia estrutural explorarem interações terciárias moleculares inter e provisórias de ácidos nucléicos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a formação da estrutura terciária das moléculas de RNA. Não se esqueça de que o estágio dois de caato e fósforo são precauções perigosas, como o uso de luvas e óculos de proteção, bem como o uso de proteção de plexiglass são recomendados durante a realização deste procedimento.