Name: Monitoramento de mudanças na estrutura Equilibrium RNA por peroxidativo e oxidativo Footprinting Radical Hidroxila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: Aprenda a quantificar a formação da estrutura terciária do RNA usando footprinting de radical hidroxila. Este método emprega reagentes de Fenton e eletroforese em gel para analisar a acessibilidade do solvente.

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Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Saúde RO1-GM085130 e National Science Foundation MCB0929394. Agradecemos ao Dr. Marion Schmidt por sua hospitalidade e por nos permitir filme em seu laboratório.

1. Preparação dos Reagentes Footprinting <ol><li> Preparar um tampão de reação 10x, contendo 100 mM cacodilato de sódio, 1 mM EDTA, e 1 M KCl. Ajustar o pH para 7,4. Filtrar o tampão 0,2 mM usando um dispositivo de filtro de acetato (Nalgene). Observação: não pipeta RNA diretamente em tampão 10x. </li><li> Prepare a mistura de reacção de titulação para cada reação, como indicado na Tabela 1. O volume da mistura de titulação (1x buffer e Mg (II) na concentração desejada) deve ser de 90 mL, antes de adicionar 10μl de RNA em tampão 1x. </li><li> Preparar um tampão de digestão RNAse T1 contendo Uréia 6.63M, citrato de sódio 20mM, EDTA 1mM, 0,25 mcg / mL tRNA, cyanol xileno 0,025% e 0,025% azul de bromofenol. Esse buffer pode ser armazenado a 4 ° C por até 6 meses. </li><li> A reação Fenton requer preparada soluções aquosas de 250 mM Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2, 250 mM EDTA e 500 mM ascorbato de sódio. As concentrações mencionado no capítulo 10,5 são ideais para experimentos de equilíbrio em tampão cacodilato de sódio, como que não limpam radicais e diversas concentrações de íons divalentes. </li><li> Reagentes para a reação footprinting peroxidativo (1.5.1) e oxidativo (1.5.2). <ol><li> A reação Fenton peroxidativo requer preparada soluções aquosas de 100 mM solução Fe-EDTA, e 50 mM ascorbato de sódio e 1,5% H 2 O 2. A solução Fe-EDTA é preparada pela mistura Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 com EDTA a ter 1,1 vezes mais excesso de EDTA de ferro. </li><li> Pouco antes de iniciar a reação de clivagem oxidativa (3.4.2), criar a mistura de reacção de Fenton, combinando 2 l da Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 (250 mM), 2,2 mL de EDTA (250 mM), 62,5 mL ascorbato de sódio (500 mM), 22,5 mL tampão de reação 10x e 135,5 mL de H 2 O para alcançar a concentração final na mistura de reação footprinting (3.4.2) de 0.10 mM, 0,11 mM e 6,61 mM, respectivamente. </li></ol></li></ol> 2. Preparação para o RNA Experiment Footprinting <ol><li> RNA podem ser produzidos pela norma in vitro a transcrição dos modelos de DNA 6 ou, se menor de 50 nucleotídeos, ser adquirido (por exemplo, Integrated DNA Technologies, www.idtdna.com). Siga os procedimentos de limpeza recomendado laboratório para manter a integridade da amostra de RNA durante as experiências footprinting. 7 </li><li> Desfosforilação 8 de RNA transcrito in vitro é necessário antes de 32 P rotulagem do terminal 5 'do RNA. 10 pmol de RNA são finais marcados por kinasing. 9 A solução deve ser nublado após a inativação da fosfatase sucesso. </li><li> Purificar RNA marcado radioativamente usando eletroforese em gel desnaturante. O RNA é recuperada por dois subseqüentes gel extrações utilizando acetato de sódio 0,3 M (pH 5,5). RNA é precipitado através da mistura de 0,5 ml de solução aquosa com 1 ml de etanol e posteriorincubação por 1 minuto em gelo seco. Rotação da amostra a 4 ° C, 12500 rpm para 0,5 hr. Desprezar o sobrenadante e lavar RNA pellet com etanol 70%. Remover o sobrenadante após a centrifugação adicional e seco pellet no vácuo. </li><li> Dissolver a 32 amostras P-rotulados RNA em 330 ul de 1x 30 mL Buffer.Pipet da solução de RNA em um tubo de reação, precipitado com etanol e seco RNA no vácuo; manter este tubo para gerar a escada de referência (passo 3.5). Desnaturar a solução tamponada de RNA por aquecimento a 95 ° C por 2 min. Arrefecer as amostras à temperatura ambiente por 15 min e dar um giro rápido para derrubar o condensados ​​nas tampas dos tubos na solução. </li></ol> 3. O Experimento Footprinting <ol><li> O pente eletroforese determina o número máximo de pontos de dados por gel analítica. Usamos a 30 comb bem. A escada de referência ocupa 2 poços e um controle uncleaved. Prepare 27 tubos de reação. O Mg final (II) concentrations devem ser uniformemente espaçados em uma escala logarítmica que mede ordens de magnitude em torno do ponto médio de titulação. </li><li> Separadamente, incube a RNA eo Mg (II) de soluções a 50 ° C por 5 min. Misture 10 ml de solução de RNA com 90 mL da correspondente quantidade de Mg (II) em 1x buffer para chegar a um volume final de 100 l. Incubar as soluções por 30 min a 50 ° C. </li><li> Deixe as soluções equilibrar a 25 ° C por 1 hora ao dobrar ocorre. </li><li> Peroxidativo (3.4.1) ou oxidativo (3.4.2) reação pegada radical hidroxila. <ol><li> Iniciar a reação peroxidativo colocando gotas de 2 l Fe-EDTA (100 mM), 2 mL de sódio L-ascorbato (50 mM) e 2 mL H 2 O 2 (1,5%) separados uns dos outros na parte superior interna da reação tubo contendo a solução de RNA e iniciar a reação footprinting pela mistura vigorosa. Parar a reacção após 15 segundos, adicionando 300 mL de etanol frio absoluto. Ligue os tubos de 3-5 vezes. Lavar precipitado, esecar o pellet como no passo 2.4. </li><li> Iniciar o footprintingreaction hidroxila oxidativo radical pela adição de 5 mL da mistura preparada reação de Fenton (1,6). Incubar por 30 min a 25 ° C. Adicione 300 ml de etanol absoluto frio para saciar a reação e misture girando os tubos de 3-5 vezes. Precipitado, lavar e secar o pellet, conforme indicado no passo 2.4. </li></ol></li><li> Gerar uma RNase T1 amostra de referência digerir acordo com os procedimentos padrão de 10 usando a solução preparada na etapa 1.3. </li><li> Dissolver pellets de RNA em 8 mL de gel loading dye II (Ambion) e RNA é ressuspendido confirmar usando o contador Geiger. </li><li> Prepare uma desnaturação, gel de poliacrilamida 8% seqüenciamento de acordo com protocolos padrão. 11 amostras de carga, incluindo duas referências e um controle. Separar fragmentos de RNA de 60 W - 75 W por 2,5 hr. Expor gel seco a uma tela de fósforo de armazenamento durante a noite. Varredura tela de fósforo com um sistema de imagem para autoradiografia filmless, por exemplo,. Tempestade 865 (GE Healthcare) ou Typhoon (GE Healthcare). Transferência de arquivos de imagem gel para o seu computador. </li></ol> 4. Análise de Dados <ol><li> A reatividade radical hidroxila de cada nucleotídeo é determinada pela quantificação da intensidade de cada banda no gel analítica. Baixar, instalar e abrir SAFA, um fácil de usar software de código aberto para instalação de banda única e quantificação. 12, 13 Siga as instruções do manual do usuário. Resumidamente, a seqüência de RNA de carga como. Txt seguido da foto como gel. Gel arquivo. Ajustar intensidades banda, define as pistas, escolha uma pista de âncora, e realizar um alinhamento gel. Atribuição de faixas de nucleotídeos ocorre em referência a RNase escada digestão T1. Quantificar as integrais banda e usar o recurso de normalização / colorplot para normalizar e atribuir resíduos potencialmente invariantes. Salvar a saída como um arquivo txt.. </li><li> SAFA gera uma planilha contendo colunas representando pistas sobre o gel e linhas representando os emgrados densidade de banda das bandas individuais correspondentes ao fragmento de RNA. Primeiro, identificar as zonas de protecção que apresentam uma notável mudança na acessibilidade do solvente através da comparação do perfil de proteção derivado da amostra não Mg (II) com o perfil do ponto final de concentração Mg (II) (50 mM em nosso exemplo). Quanto menor o valor, mais protegido do nucleotídeo é contra o ataque dos radicais hidroxila e vice-versa. </li><li> Criar isotermas dobrar da banda normalizado integrais de indivíduo ou grupos de nucleotídeos em relação Mg concentração (II). As isotermas são individualmente escalado para saturação fracional por fi = L + (U - L) • <img src="files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y"> onde f denota a densidade integrada da banda (s) que está sendo analisado, L e U representam os limites inferior e superior para a transição e <img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Y"> é a saturação fracionada. 14 Os dados estão aptos usando um l não-linearleste programa de análise de quadrados (Usamos tanto Origem (Origin) ou GraphPad (GraphPad Software, Inc.).) com a equação de Hill (1), <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 1"> onde K d é o equilíbrio constante de dissociação, [M] corresponde à concentração da variável que media a reação de dobramento, Mg (II), neste exemplo, e n H é o coeficiente de Hill. Este procedimento escalas a transição para a saturação fracionada, determina o seu ponto médio e fornece um teste fenomenológica de saber se é uma transição sigmoidal. Isotermas derivadas de seqüenciamento géis (Figura 3A), que foram analisadas por SAFA (Figura 3B) e ajuste como descrito acima são mostrados na Figura 3C. As isotermas de saturação fracional mostrado na Figura 3 foram gerados pela escala em uma planilha os valores gerados pela SAFA contra os melhores se encaixam limites superior e inferior (U e L), utilizando a fração equação = valor / (U - L) - L / (U - L). </li></ol> 5. Resultados representativos: A Figura 3 mostra resultados representativos da P4-P6 RNA • experimentos footprinting OH. A imagem gel (à esquerda) indica que uma clivagem de fundo) é mínimo (faixa direita), b) atribuição de único nucleotídeo é possível devido a bandas bem definidas na pista T1 (cliva RNase T1 em cada G), e c) o radical hidroxila induzida fragmentação do RNA é bem acima do fundo. A transição de baixa para alta Mg (II) é afiliado com a diminuição da densidade de banda integrado de individuais e grupos de faixas indicando a formação de RNA estrutura terciária. Individuais ou grupos de nucleotídeos contíguos cuja clivagem alterações concomitantemente são referidos como uma "proteção". As proteções • OH característica do Mg (II) mediada dobramento da RNA P4-P6 perto correspondem às regiões inacessíveis solvente da molécula observada em sua estrutura cristalina. 15 Dobrado moléculas RNA c um tem extensões diferentes (isto é, o quão perto a fundo a banda declínio densidades) de proteção de contato superior que não têm sido correlacionados com fenômeno estrutural ou dinâmico clara. Assim, algumas moléculas de RNA vai mostrar bem definidas transições estruturais, como mostrado na Figura 3, e alguns não. Intensidades banda são quantificados e normalizados pela SAFA análise 12 (Figura 3B). A saída é uma trama 'térmico' visualizando o relativo grau de protecção contra o • OH. A transição de cores descreve a mudança de acessibilidade em cima disso Mg (II). Branco para vermelho ou azul mostra nucleotídeos mais acessível ou mais protegidos, respectivamente. Cada grau de sombreamento é afiliado com um valor numérico que pode ser plotado como uma curva de proteção (Figura 3C) e analisados ​​por um modelo de ligação, tais como a equação de Hill (1). O equilíbrio constante de dissociação afiliada à Proteção 153-155 é aproximadamente o dobro do valor correspondente de Proteção 163-164. ONTEÚDO "&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Produção de radicais hidroxila e P4-P6 dobrar RNA. A) Fe (II) catalisa a geração de radicais hidroxila a partir de peróxido de hidrogênio. Ascorbato reduz Fe volta (III) a ferro. B) Na ausência de Mg (II), nenhuma estrutura P4-P6 terciário é formada, permitindo que os radicais hidroxila para penetrar e se unir todas as posições backbone acessível. Além do Mg (II) inicia dobrar de P4-P6, permitindo apenas a espinha dorsal do solvente acessíveis a ser clivada pelos radicais hidroxila. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esboço para uma experiência pegada radical hidroxila. A Dephophorylation) e 32 P rotulagem 5'-final da RNA. B) Purificação de 32 P-rotulados RNA em gel de poliacrilamida desnaturante. C) Excisão da banda de RNA, extração de RNA subseqüentes, e precipitação de etanol. D Prefolding) edobramento de RNA. E) A adição de recém-preparada mistura de reação Fenton para gerar os radicais hidroxila. F) separação fragmento de RNA por eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida. G) A quantificação de fragmentos de RNA por software SAFA. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Análise de fragmentos de RNA após a reação peroxidativo footprinting Fenton. (A) O RNA foi exposto a radicais hidroxila e os produtos de dissociação foram resolvidas usando eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (PAGE). A imagem mostra produtos de dissociação peroxidativo com o aumento da concentração de Mg (II). Pistas de referência e controle são rotulados. Este arquivo de imagem é a entrada para o programa SAFA, que quantitates o volume de cada banda. (B) O enredo "térmico" gerado pela SAFA. (C) A planilha de valores relativos a densidade de banda integrado para a saída número de nucleotídeos de SAFA é analisada por um modelo de vinculação, como o equati Colinaem (1). Regiões de proteção foram escolhidos de acordo com o aumento da densidade de banda integral como uma função da concentração de Mg (II). A d K é a concentração de Mg (II) em que metade do RNA é dobrada no local está sendo monitorado. O coeficiente de Hill, n H, é uma medida da inclinação da curva que dá informações sobre a cooperatividade de ligação e oferece um menor estimativa para o número de íons de magnésio envolvidos na dobragem deste site particular. <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 1"> Tabela 1. Volumes Representante para a geração de amostras de RNA contendo diferentes Mg (II) as concentrações.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Footprinting radical hidroxila é uma ferramenta valiosa para avaliar a área de superfície acessível solvente de ácidos nucléicos. Formação qualitativa e quantitativa da estrutura terciária 14 pode ser seguido em função de parâmetros como tipo e concentração de íons, pH, temperatura, proteínas de ligação ou dobrar co-fatores. A combinação irresistível de um protocolo para a frente e de baixo custo e acessibilidade resultante de solvente e informações dobrar em um nível de nucleotídeo único torna este método mu...

<table><tbody><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>N.º Cat.</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de Sódio (Cuidado! Tóxico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4945-25g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Água tratada com DEPC</td><td>Ambion</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio (3 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Ambion</td><td>AM9902</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-7876</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato de Sódio-L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7631-25g</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1543-500g</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>Fermentas</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrogênio (30%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>349887</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento de mudanças na estrutura equilibrium rna por &quot;peroxidativo&quot; e &quot;oxidativo&quot; footprinting radical hidroxila

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

Moléculas de RNA desempenham um papel essencial na biologia. Além de transmitir a informação genética, RNA pode dobrar em exclusivo estruturas terciárias cumprindo um papel biológico específico como ligante regulador, ou catalisador. Informações sobre a formação de contato superior é essencial para compreender a função das moléculas de RNA. Radicais hidroxila (OH •) são sondas única da estrutura dos ácidos nucléicos, devido à sua alta reatividade e tamanho pequeno. 1 Quando utilizado como uma sonda pegada, os radicais hidroxila mapa da superfície acessível solvente do backbone fosfodiéster do DNA e RNA 1 2 com tão fina como a resolução de nucleotídeo único. Footprinting radical hidroxila pode ser usado para identificar os nucleotídeos dentro de uma superfície de contato intermolecular, por exemplo, DNA-proteína-1 e RNA-proteína complexos. Equilibrium 3 e 4 transições cinética pode ser determinada através da realização de pegada radical hidroxila em função de um solutina variável ou tempo, respectivamente. Uma característica fundamental da pegada é que a exposição limitada à sonda (por exemplo, &#39;single-hit cinética &quot;) resulta na amostragem uniforme de cada nucleotídeo do polímero. 5 Neste artigo de vídeo, usamos o domínio P4-P6 da ribozima Tetrahymena para ilustrar RNA preparação de amostras e determinação de um (II) mediada por Mg isotermas de dobradura. Descrevemos a utilização do protocolo pegada bem conhecido radical hidroxila que requer H 2 O 2 (nós chamamos este protocolo &quot;peroxidativo &#39;) e um valor, mas não muito conhecido alternativa, que usa naturalmente O 2 dissolvido (chamamos isso de&quot; o protocolo oxidativo &quot;). Uma visão geral da redução de dados, transformação e procedimentos de análise é apresentado.

Este protocolo descreve como quantificar o Mg (II) dependente da formação de RNA estrutura terciária através de dois métodos de pegada radical hidroxila.

Monitoramento de mudanças na estrutura Equilibrium RNA por &quot;peroxidativo&quot; e &quot;oxidativo&quot; Footprinting Radical Hidroxila

As moléculas de RNA desempenham um papel essencial na biologia. Além de transmitir informações genéticas, o RNA pode se dobrar em estruturas terciárias únicas que cumprem...

O objetivo geral do seguinte experimento é determinar como as moléculas de RNA se dobram utilizando a técnica de mapeamento por radicais hidroxila. Isso é alcançado por marcação em extremidade, purificação em gel e pré-dobramento do RNA, o que garante a integridade conformacional do RNA antes da etapa subsequente de dobramento mediado por magnésio. Em seguida, os reagentes de Fenton são misturados para gerar radicais hidroxila, os quais podem clivar a cadeia principal do RNA de acordo com sua acessibilidade ao solvente. A seguir, os produtos de clivagem do RNA são separados por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante e visualizados por autorradiografia.As integrais das bandas são quantificadas por meio de software de análise de footprinting semi-automatizado. O objetivo final é gerar isotermas de dobramento que reflitam a formação da estrutura terciária do RNA. Isso é realizado escalando as integrais das bandas normalizadas para a saturação fracional.As isotermas podem então ser ajustadas à equação de Hill. A principal vantagem do footprinting com hidroxila é que se obtém informações sobre a estrutura terciária do RNA utilizando produtos químicos de baixo custo, pois os radicais hidroxila de pequeno tamanho apresentam alta atividade, sendo sondas ideais para distinguir entre nucleotídeos acessíveis ao solvente e nucleotídeos enterrados. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia estrutural de RNA.Por exemplo, como os ribossomos utilizam íons metálicos para atingir sua conformação ativa? A técnica de mapeamento por radicais hidroxila pode ser usada para compreender os fundamentos da especificidade e reconhecimento de RNA. Além de revelar informações sobre a estrutura terciária do RNA, este método pode ser empregado para determinar os sítios exatos de ligação de proteínas em moléculas de RNA ou DNA.Os principais desafios deste método são prevenir a degradação da amostra por ribonuclease e otimizar a concentração de ferro para obter a quantidade adequada de clivagem de RNA. Além disso, a análise detalhada dos intervalos das bandas pode ser bastante complicada. O principal benefício deste vídeo é ajudar o público a compreender as etapas de planejamento e a execução bem-sucedida de um experimento de mapeamento por radicais hidroxila. Antes do início deste protocolo, prepare todos os reagentes para o mapeamento conforme descrito no protocolo escrito.Acompanhando este vídeo, o RNA pode ser produzido a partir de quatro DFOs relacionados e marcado na extremidade, conforme descrito. Purifique o RNA marcado radioativamente utilizando eletroforese em gel desnaturante. Recupere o RNA purificado por duas extrações subsequentes em gel usando acetato de sódio 0,3 molar.Em seguida, precipite o RNA misturando 0,5 mililitros da solução aquosa com um mililitro de etanol. Incube a mistura por um minuto em gelo seco. Após centrifugar a amostra, descarte o sobrenadante. Lave o pellet de RNA com etanol 70%.Remova o sobrenadante após nova centrifugação e seque o pellet em vácuo. Em seguida, dissolva as amostras de RNA marcado com P 32 purificado. Em 330 microlitros de tampão de reação uma vez, pipete 30 microlitros da solução de RNA em um novo tubo de reação.Precipite o RNA com etanol e, em seguida, seque o pellet em vácuo; uma vez seco, esse pellet pode ser usado para gerar a escada de referência conforme descrito no procedimento escrito para nature. Desnature o restante da solução de RNA tamponada aquecendo-a a 95 graus Celsius por dois minutos. Deixe as amostras atingirem a temperatura ambiente por 15 minutos e, em seguida, faça uma centrifugação rápida para recolher o condensado de volta à solução. Para iniciar o experimento de footprint, monte 27 tubos de reação, quantidade suficiente para preencher um gel de eletroforese de 30 poços.Após incluir os marcadores e o controle clivado, determine as concentrações finais de íons de magnésio e ferro para que fiquem uniformemente espaçadas em uma escala logarítmica ao longo de várias ordens de grandeza em torno do ponto médio da titulação. A preparação dos íons de magnésio em tampão de reação uma vez é descrita separadamente no texto. Incube a solução de RNA e as soluções de íons de magnésio a 50 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, misture 10 microlitros da solução de RNA com 90 microlitros da quantidade correspondente de solução de íons de magnésio e ferro.Para atingir um volume final de 100 microlitros, incube cada mistura por 30 minutos a 50 graus Celsius. Em seguida, deixe as soluções equilibrarem a 25 graus Celsius por uma hora enquanto ocorre o dobramento do RNA. Enquanto isso, imediatamente antes de iniciar a reação de mapeamento por radicais hidroxila, prepare a mistura de reação fantasma conforme descrito no protocolo escrito.Prepare a reação de peroxidação pipetando duas gotas de dois microlitros cada uma de ferro EDTA, ascorbato de sódio e peróxido de hidrogênio na parte superior interna do tubo de reação contendo a solução de RNA, de modo que as gotas não entrem em contato. Inicie a reação de mapeamento por pegadas com uma mistura vigorosa. Após 15 segundos, interrompa a reação adicionando 300 microlitros de etanol puro e frio.Agite os tubos de três a cinco vezes. Por fim, precipite, lave e seque o pellet conforme realizado anteriormente. Como alternativa à reação oxidativa, a reação oxidativa de hidroxila será realizada pela adição de cinco microlitros da mistura recém-preparada de reação de Fenton às amostras. Incube a reação oxidativa por 30 minutos a 25 graus Celsius.Em seguida, adicione 300 microlitros de etanol puro e frio para interromper a reação e misture invertendo os tubos. Precipite novamente. Lave e seque o pellet após a conclusão da reação peroxidativa ou oxidativa.Resuspenda os pellets de RNA secos em oito microlitros de corante de carga para gel tipo dois. Confirme que o RNA marcado com P-32 foi ressuspenso utilizando um contador Geiger. Prepare um gel de sequenciamento desnaturante de poliacrilamida a 8% de acordo com protocolos padrão. Usando um pente de 30 poços, carregue as amostras, incluindo dois referenciais e um controle clivado.Sequencie os fragmentos de RNA a 60 a 75 watts durante duas horas e meia. Exponha o gel seco a uma tela fosfoensomada durante a noite. Analise a tela fosfoensomada com um sistema de imagem para autorradiografia sem filme.Em seguida, transfira o arquivo de imagem do gel para o computador para análise. Para iniciar a análise dos dados, abra o Safa, um software livre para ajuste e quantificação de banda única. Carregue a sequência de RNA como um arquivo TXT seguido pela imagem do gel como um arquivo GEL.Defina as faixas e ajuste as intensidades das bandas. Em seguida, escolha uma faixa de referência e realize a atribuição de alinhamento do gel, associando as bandas aos nucleotídeos com base na escada de digestão do RNA T um. Quantifique as intensidades das bandas e utilize a função de gráfico de normalização por cores para normalizar e atribuir resíduos potencialmente invariantes.Salve a saída como um arquivo txt. O SFA gera uma planilha contendo colunas, que representam as pistas do gel, e linhas que representam os integrais individuais das bandas correspondentes ao fragmento de RNA. Primeiro, os sítios de proteção que exibem uma mudança notável na acessibilidade ao solvente devem ser identificados comparando o perfil de proteção derivado da amostra sem íons de magnésio com o perfil da concentração final de íons de magnésio.Quanto menor o valor, mais protegido está o nucleotídeo contra ataques pelos radicais hidroxila, e vice-versa. Em seguida, crie curvas de transição da banda, intensidades de nucleotídeos individuais ou grupos em função da concentração de íons de magnésio usando um formato de planilha, escalando individualmente essas transições à função de saturação fracional conforme descrito na parte textual deste protocolo. Como etapa final, ajuste os dados à equação de Hill.Esta análise ajusta a transição até a saturação fracional, determina o ponto médio da transição e fornece um teste fenomenológico para verificar se a transição é sigmoide. Abaixo estão resultados representativos de experimentos de mapeamento por radicais hidroxila do RNA P4-P6. As isotermas foram derivadas de géis de sequenciamento analisados pelo Safa e, em seguida, ajustadas conforme descrito na seção de análise.A imagem do gel indica que a clivagem de fundo é mínima e que a atribuição de nucleotídeos individuais é possível devido às faixas bem definidas na pista T. A fragmentação do RNA induzida por radicais hidroxila está bem acima do fundo. A transição de íons de magnésio baixos para altos está seletivamente associada à diminuição da intensidade de faixas individuais e grupos de faixas, indicando a formação de RNA.A proteção da estrutura terciária refere-se a nucleotídeos únicos ou grupos de nucleotídeos contíguos cuja clivagem altera simultaneamente as intensidades das bandas, as quais são quantificadas e normalizadas por meio da análise saffer. O resultado é um gráfico térmico que visualiza o grau de proteção contra radicais hidroxila. A transição de cor descreve a alteração na acessibilidade após a adição de ferro magnésio: de branco a vermelho indica nucleotídeos mais acessíveis, enquanto de branco a azul indica nucleotídeos mais protegidos.Cada grau de sombreamento está associado a um valor numérico, que pode ser representado graficamente como uma curva de proteção e analisado por um modelo de ligação, como a equação de Hill. Neste exemplo, a constante de dissociação no equilíbrio associada à proteção de 1 5 3 a 1 5 5 é aproximadamente duas vezes maior que o valor correspondente da proteção de 1 6 3 a 1 6 4. Este experimento de mapeamento por radicais hidroxila pode ser realizado em um dia e meio, se for executado corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar luvas e jaleco de laboratório para evitar qualquer contaminação por RNAs. Além disso, a concentração final de ferro depende do sistema experimental. Por isso, recomendamos realizar um experimento de resposta à dose antes da análise de footprinting seguindo este procedimento.Outros métodos, como a pegada de radical hidroxila com resolução temporal, podem ser realizados para responder perguntas adicionais. Por exemplo, em qual momento crítico as moléculas de RNA atingem uma conformação incorretamente dobrada ou ativa após seu desenvolvimento? Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia estrutural explorarem interações terciárias inter e intermediárias de ácidos nucleicos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a formação da estrutura terciária de moléculas de RNA. Não se esqueça de que o estágio com cloreto de cálcio e fósforo apresenta riscos; precauções, como o uso de luvas e óculos de proteção, bem como o uso de blindagem de plexiglás, são recomendadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Alta capacidade seletiva 2 'acilação hidroxila analisados ​​por extensão primer (SHAPE) utiliza um romance químico sondagem tecnologia, transcrição reversa, eletroforese capilar e software de predição de estrutura secundária para determinar as estruturas de RNAs de várias centenas a vários milhares de nucleotídeos em única resolução de nucleotídeos.

RNA Secundária Previsão Estrutura Usando SHAPE de alta capacidade

Radical baseado em química biomimética tem sido aplicado para a construção de bibliotecas, necessários para o desenvolvimento de biomarcadores.

Radicais Livres em Biologia Química: de comportamento químico para o Desenvolvimento de biomarcadores

Aqui nós apresentamos um protocolo para o clivagem dnazyme-dependente do RNA. Isto permite a análise rápida e local-dependente do RNA 2 '-O-methylation. Esta aproximação pode ser usada para a avaliação preliminar ou principal da atividade do snoRNA.

Análise DNAzyme-dependente de rRNA 2 '-O-methylation

Nós descrevemos aqui métodos para a quantificação sensível e exata das lesões 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-dAdo) e 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-DGUO) no ADN. Os métodos foram aplicados na avaliação dos efeitos da matéria particulada fina ambiente (PM2,5) nos tecidos (pulmão, fígado e rim) de camundongos a/J expostos.

Quantificação de três lesões de DNA por espectrometria de massas e avaliação de seus níveis em tecidos de camundongos expostos a material particulado fino ambiente

In vivo a oxidação fotoquímica rápida de proteínas (IV-FPOP) é uma técnica de pegada de proteína radical hidroxil que permite o mapeamento da estrutura proteica em seu ambiente nativo. Este protocolo descreve a montagem e a configuração do sistema de fluxo microfluido IV-FPOP.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting para o Estudo de Interações Proteicas em Caenorhabditis elegans

Aqui, caracterizamos a estrutura proteica e os locais de interação em células vivas usando uma técnica de pegada proteica denominada oxidação fotoquímica rápida de proteínas (IC-FPOP).

Caracterização de proteínas celulares com oxidação fotoquímica rápida de proteínas

A reticulação cinética e análise de cDNA é um método que permite investigar a dinâmica das interações proteína-RNA em células vivas em alta resolução temporal. Aqui, o protocolo é descrito em detalhes, incluindo o crescimento de células de levedura, reticulação UV, colheita, purificação de proteínas e etapas de preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração.

Monitorando a Dinâmica da Interação Proteína-RNA In Vivo em Alta Resolução Temporal Usando χCRAC

A oxidação fotoquímica rápida das proteínas é uma técnica emergente para a caracterização estrutural das proteínas. Diferentes aditivos e ligantes de solventes têm variadas propriedades de limpeza radical hidroxyl. Para comparar a estrutura proteica em diferentes condições, a compensação em tempo real dos radicais hidroxis gerados na reação é necessária para normalizar as condições de reação.

Permitindo compensação em tempo real em oxidações fotoquímicas rápidas de proteínas para a determinação de mudanças de topografia de proteínas

Este protocolo apresenta um método para usar a dosimetria radical inline e uma fonte de luz plasmática para realizar a pegada de proteína de oxidação flash. Este método substitui o perigoso laser UV para simplificar e melhorar a reprodutibilidade da oxidação fotoquímica rápida de estudos proteicos.

Pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser para realizar análises estruturais de proteínas de ordem superior

MALDI-TOF foi utilizado para caracterizar fragmentos obtidos a partir da reatividade entre o RNA oxidado e o exoribonuclease Xrn-1. O presente protocolo descreve uma metodologia que pode ser aplicada a outros processos envolvendo RNA e/ou DNA.

Identificação de fragmentos de RNA resultantes da degradação enzimática usando espectrometria de massa MALDI-TOF

O protocolo fornece instruções para modificar o RNA com sulfato de dimetilo para experimentos de perfil mutacional. Inclui sondagem in vitro e in vivo com dois métodos alternativos de preparação de bibliotecas.

Sondando a estrutura do RNA com perfil mutacional de sulfato de dimetilo com sequenciamento in vitro e em células

Aprenda a quantificar a formação da estrutura terciária do RNA usando footprinting de radical hidroxila. Este método emprega reagentes de Fenton e eletroforese em gel para analisar a acessibilidade do solvente.

Monitoramento de mudanças na estrutura Equilibrium RNA por "peroxidativo" e "oxidativo" Footprinting Radical Hidroxila

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