RNA Secundária Previsão Estrutura Usando SHAPE de alta capacidade

O objetivo geral deste procedimento é a previsão da estrutura secundária do RNA com resolução de nucleotídeo único. Isso é feito modificando primeiro quimicamente o RNA dobrado com um reagente eletrofílico que isola regiões de fita simples ou flexíveis de RNA. O segundo passo é usar a transcrição reversa para detectar locais do RNA que foram quimicamente modificados.

Em seguida, os produtos CD NA da transcrição reversa são fracionados por eletroforese capilar. A etapa final é o processamento e normalização dos dados. Em última análise, o software de estrutura de RNA é usado para prever a estrutura secundária do RNA usando as restrições de energia pseudo livre derivadas da análise de forma.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia molecular, como como a estrutura do RNA governa as funções dos RNAs catalíticos e não atuais e como os genomas de RNA viral regulam a multifuncionalidade de seus genomas. As implicações dessa técnica se estendem à nossa terapia e diagnóstico de doenças virais ou câncer, porque obter informações sobre a estrutura secundária do RNA pode ajudar no design de medicamentos baseados em estrutura. Embora este método forneça informações sobre a estrutura dos RNAs produzidos pela transcrição in vitro, ele também pode ser aplicado in vivo, uma vez que os reagentes de forma são permeáveis às células.

Antes de iniciar este procedimento, prepare o RNA por transcrição in vitro. Usando um kit de transcrição comercial. Os RNAs devem ser armazenados em tampão TE entre menos 20 e menos 80 graus Celsius em um tubo de microcentrífuga de 0,5 microlitro.

Dilua 12 picomoles de RNA a 18 microlitros com água e adicione dois microlitros de 10 x mistura de tampão de renaturação batendo no tubo seguido de um breve calor giratório da mistura no tubo a 85 graus Celsius por um minuto, depois esfrie a quatro graus Celsius a uma taxa de 0,1 graus Celsius por segundo. Adicione 100 microlitros de água e 30 microlitros de cinco tampão dobrável ao tubo da microcentrífuga. Em seguida, incube o conteúdo do tubo a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos, dependendo do RNA que está sendo dobrado.

Em geral, o dobramento dependente de magnésio de RNAs mais longos e estruturados requer tempos de incubação mais longos Transfira uma alíquota de 72 microlitros para cada um dos dois tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitro, que devem ser rotulados como modificados e controle, respectivamente. O próximo passo é adicionar oito microlitros de dimetilsulfóxido anidro à mistura de controle e reservar. Em seguida, adicione oito microlitros de 10 x e MIA à mistura modificada.

Incube a mistura modificada e de controle a 37 graus Celsius por 50 minutos. Adicione oito microlitros de três acetato de sódio, pH 5,28 microlitros de EDTA 100 milimolares, 240 microlitros de etanol frio e um microlitro de 10 miligramas por mililitro. Glicogênio para o tubo misto modificado para precipitar o RNA modificado refrigerar o conteúdo do tubo por duas horas a menos 20 graus Celsius e, em seguida, centrifugar a 14.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, lave o pellet duas vezes com frio, centrifugação de etanol a 70% por cinco minutos. Após cada lavagem, remova o sobrenadante com a micropipeta e seque o pellet ao ar por cinco minutos. À temperatura ambiente, prepare as amostras modificadas e de controle para transcrição reversa em tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitro.

Para a reação modificada, misture cinco microlitros de RNA modificado, seis microlitros de água e um microlitro de uma solução de primer de cinco marcadores com 10 micromolares. Para a reação de controle, misture cinco microlitros de RNA de controle, seis microlitros de água e um microlitro de uma solução de primer marcada com 10 micromolares sci 5.5. Coloque os tubos em um termociclador e ajoelhe-se o primer no RNA.

Durante um ajoelhamento, prepare 2,5 x RT mix. Para cada reação RT, misture bem e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos antes de adicionar às reações ajoelhadas. Quando a temperatura das reações de ajoelhar atingir 50 graus Celsius, adicione oito microlitros de 2,5 XRT.

Misture e incube por 50 minutos a 50 graus Celsius. Em seguida, hidrolisou o RNA adicionando um microlitro de hidróxido de sódio de quatro molares e aquecendo a 90 graus Celsius por três minutos. Resfrie as reações no gelo e neutralize-as adicionando dois microlitros de ácido clorídrico de dois molares.

Agora combine as reações modificadas e de controle e adicione 0,1 volume ou um décimo do volume total da reação de acetato de sódio de três molares e 100 milimolares de EDTA, 1,5 volume de etanol frio e um microlitro de 10 miligramas por mililitro. Glicogénio. Isso resulta na precipitação do CDNA fora da solução. Refrigerar a solução durante duas horas e, em seguida, centrifugar a 14 000 g durante 30 minutos a quatro graus Celsius.

Lave o pellet duas vezes com ressuspensão a frio, 70% de etanol, o CD NA peletizado em 40 microlitros de amida deionizada aquecendo a 65 graus Celsius por 10 minutos, seguido de vórtice vigoroso por pelo menos 30 minutos para preparação da reação de sequenciamento em uma mistura de tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro 40 microlitros da mistura de terminação DDA. Cinco moles PICA do molde de DNA, 4,6 microlitros de 10 x tampão sease e 10 microlitros de primer bem lido D dois marcados. A esta mistura, adicione 4,6 microlitros de QUIN A e dilua com água para elevar o volume total para 82 microlitros.

Prepare uma segunda reação de sequenciamento da mesma maneira, utilizando o primer marcado com DDT e lycor IR 800. Em seguida, prossiga para a amplificação de PCR usando as condições recomendadas de USB fornecidas. Adicione 16 microlitros de acetato de sódio de três molares pH 5,2 16 microlitros de EDTA 100 milimolares, um microlitro de 10 miligramas por mililitro de glicogênio e 480 microlitros de etanol a 95% para precipitar o DNA, incubar a quatro graus Celsius por 30 minutos e centrifugar a 14.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius.

Ressuspenda o CD NA peletizado em 100 microlitros de amida deionizada aquecendo a 65 graus Celsius por 10 minutos, seguido de vórtice vigoroso por pelo menos 30 minutos. Em seguida, misture 40 microlitros das amostras de forma agrupada com 10 microlitros das escadas de sequenciamento agrupadas e pipete o volume total da amostra para o programa de placas de amostra de 96 poços e prepare o instrumento de eletroforese capilar e inicie uma execução de acordo com as instruções do fabricante. Os quatro traços codificados por cores sobrepostos são produzidos pela migração dos quatro conjuntos de produtos de reação através do capilar da seguinte forma, o traço azul mostra produtos de transcrição reversa gerados a partir da transcrição reversa de RNAs modificados por NMIA.

O Green Trace mostra produtos de transcrição reversa de RNAs dobrados, mas não modificados. O Black Trace mostra a escada de sequenciamento D-N-A-D-D-G e o Red Trace mostra a escada de sequenciamento DDT. Os traços brutos de eletroforese capilar são separados, processados, alinhados e integrados usando o software localizador de formas.

A análise dos dados começa com a importação dos eletroferogramas do sistema de eletroforese capilar para o localizador de formas. A janela central de visualização de dados fornece feedback gráfico sobre cada etapa do processamento de dados. A janela do inspetor de ferramentas localizada na parte inferior esquerda da tela mostra os parâmetros das ferramentas selecionadas no inspetor de scripts.

O inspetor de script na parte superior da tela exibe as ferramentas que foram aplicadas aos dados, ajusta os eletroferogramas para corrigir o fundo fluorescente, sobreposição espectral entre canais fluorescentes, mudanças de mobilidade, transmitidas por primers marcados de forma diferente, decaimento de sinal resultante da terminação prematura da transcrição reversa e diferenças na intensidade de fluorescência de produtos comuns rotulados com diferentes fluoróforos em localizadores de forma, alinhar e integrar ferramentas. Use a função de configuração para atribuir automaticamente identidades a picos individuais e correlacionar essas informações à sequência de RNA conforme definido pela entrada do usuário e as duas escadas de sequenciamento para incorporar os perfis de reatividade de nucleotídeos no algoritmo de estrutura secundária usado pelo software RNA structure 5.3 e ou para comparar perfis de RNAs intimamente relacionados. Normalize os dados da forma de maneira padronizada.

Para fazer isso, exclua outliers dos cálculos subsequentes. Determine a reatividade máxima efetiva e normalize dividindo todos os valores de reatividade pelo máximo efetivo. O software de estrutura de RNA é usado para prever estruturas secundárias de RNA suportadas experimentalmente usando as restrições de energia pseudo livre da análise de forma.

O software fornece representações gráficas da menor energia para estruturas DRNA, bem como representação textual dessas estruturas. Na notação de colchetes de pontos, a sequência e a anotação de colchetes de pontos devem ser importadas no visualizador de estrutura de RNA mostrado aqui é a estrutura 2D da região de loop de haste do elemento de resposta de rev do HIV gerada na estrutura de RNA 5.3 usando os perfis de reatividade derivados da forma e visualizados usando um applet leve Java. Os nucleotídeos coloridos em azul têm baixa reatividade, enquanto os nucleotídeos coloridos em vermelho têm maior reatividade Uma vez dominada, a técnica pode ser feita em dois dias se realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o modelo de RNA resultante deve ser cuidadosamente interpretado antes de chegar a conclusões finais sobre a estrutura secundária do RNA após este procedimento. Outros métodos, como o uso de sondagem de radicais hidroxi por meio de métodos de clivagem espacial, podem ser realizados para elucidar interações terciárias complexas e, eventualmente, permitir que os pesquisadores determinem as estruturas desses RNAs em três dimensões.