Metodologia Elastografia por Ressonância Magnética para a Avaliação de engenharia de tecidos Crescimento Construct

Para examinar construtos de tecidos engenheirizados, testes mecânicos tradicionais, que frequentemente resultam na destruição da amostra, não são aceitáveis. Este método utiliza a elastografia por ressonância magnética microscópica, ou micro MRE, como uma técnica não invasiva para medir as propriedades mecânicas de tecidos moles pequenos. Primeiro, as células são semeadas em uma matriz de biomaterial para gerar o tecido.

O tecido é suspenso em gel aros, e a ponta de um atuador é colocada dentro do gel. Em seguida, para caracterizar o movimento do atuador, ele é transferido para a amostra e detectado usando um laser. Doppler viter.

A amostra e o atuador são transferidos para um ímã e submetidos à ressonância magnética. São adquiridas imagens de elastografia. A análise das imagens resultantes mostra a alteração na rigidez ao cisalhamento para ambos os constructos osteogênicos e adipogênicos.

Tivemos inicialmente a ideia desta técnica ao observar a fotografia de residência magnética para o diagnóstico de doenças e percebemos que ela poderia ser estendida à engenharia de tecidos. A principal vantagem desta técnica em relação a outras técnicas existentes, como testes mecânicos, é que ela aplica a tecnologia não invasiva de ressonância magnética para avaliar propriedades mecânicas importantes dos tecidos. As aplicações desta técnica estendem-se à engenharia de tecidos porque o conhecimento das propriedades mecânicas garantirá sua adequação para os usos pretendidos na engenharia de ossos e cartilagens.

Embora esses métodos forneçam informações valiosas sobre engenharia de tecidos, eles também podem ser utilizados para diagnosticar doenças em diferentes órgãos, como fibrose hepática, lesão cerebral traumática ou câncer cerebral, por exemplo. A demonstração visual deste método é fundamental porque inclui etapas difíceis de aprender, além do conhecimento prévio sobre engenharia de tecidos e imagem de ritmo de magnitude.Gars. O processo de preparação do constructo tecidual consiste em três estágios principais: expansão da população celular, semeadura das células em uma matriz de biomaterial e diferenciação por meio do uso de moléculas sinalizadoras químicas.

Após o cultivo e expansão da linhagem celular, semeie as células-tronco mesenquimais humanas ou CTHMs em uma esponja de gelatina numa densidade de um vezes 10 à sexta potência de células por mililitro para formação óssea. Aproximadamente três dias depois, as células devem apresentar-se confluente na matriz para induzir a diferenciação. Remova o meio e substitua-o por meio de indução adipogênica.

Em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono após três dias. Substituir o meio por meio de manutenção, que consiste em meio de expansão contendo 10 microgramas por mililitro de insulina recombinante humana. Após a incubação por 24 horas, substituir o meio de manutenção por meio de indução.

Repita este ciclo três vezes. Substitua o meio de manutenção a cada dois dias a partir de então, durante quatro semanas, para induzir a osteogênese. Substitua pelo meio osteogênico fresco a cada dois dias pelo período restante do estudo.

Aqui, o estudo tem duração de quatro semanas e a MRE é realizada a cada semana. A elastografia por ressonância magnética baseia-se na propagação de ondas de cisalhamento mecânicas para avaliar os valores locais de propriedades mecânicas. Portanto, essas vibrações mecânicas precisam ser geradas e caracterizadas dentro do tecido de interesse utilizando um atuador piezoelétrico. Para preparar a amostra, transfira a cultura tecidual para um tubo de ensaio com diâmetro de 10 milímetros contendo uma base sólida e uma camada de gel AGROS 0,5%.

Em seguida, adicione gel acro 0,5 aquecido. Para envolvê-lo. Deixe o gel de agros endurecer por cinco minutos.

A temperatura ambiente, insira a ponta do motor de flexão elétrico piso na superfície do gel. Em seguida, fixe o tubo contendo a amostra e o atuador a um suporte rígido. Oriente o feixe do barômetro a laser Doppler em direção à ponta do atuador mecânico.

Ajuste a posição do sistema para otimizar a intensidade do sinal refletido, que é exibida no barômetro. Para maximizar a reflexão, use fita refletiva, se necessário, para configurar o atuador de modo a gerar ondas de cisalhamento inofensivas com amplitudes significativas de cerca de 250 micrômetros. Configure o gerador de funções para percorrer a faixa de frequência desejada usando uma tensão de operação de 20 volts pico a pico com um sinal de ruído branco.

Para este experimento, a faixa de frequência desejada é de 20 a 2000 hertz. Para visualizar o espectro caracterizado no programa Polytech Rsof, selecione a velocidade e a exibição FFT. Inicie a captura do sinal e identifique a frequência de ressonância do sistema com base nos picos do espectro.

Em seguida, para medir a deflexão do atuador, configure o atuador para gerar um sinal senoidal contínuo na frequência de ressonância caracterizada. Utilizando uma tensão operacional de 200 volts pico a pico, denote o deslocamento gerado entregue pelo atuador à superfície do gel; configure o fibra óptica para exibir a FFT com o deslocamento no eixo Y. Após a caracterização do atuador, coloque o tubo de ensaio contendo a amostra e o atuador em um compartimento de uma bobina RF de 10 milímetros e posicione a amostra e o atuador no centro do scanner de RM.

Adquira uma imagem de reconhecimento para identificação da localização do constructo. Uma vez que o constructo tecidual tenha sido localizado, defina os parâmetros para a aquisição. Uma varredura sagital in vitro típica terá um tempo de repetição de 1000 milissegundos.

Tempo de eco de 20 a 40 milissegundos, espessura de corte de 0,5 a um milímetro e campo de visão de 12 por 10 milímetros quadrados, com um tamanho de matriz de 128 por 128 pixels. Para os parâmetros de elastografia, ajuste a frequência do atuador ao valor determinado pela caracterização do vibrômetro a laser Doppler. Para esta amostra, é necessário um par bi com uma amplitude de gradiente de 50 gauss por centímetro e um atraso de MRE ajustado a zero.

Altere o gerador de funções para o modo de rajada e ajuste os parâmetros do gerador de funções para coincidir com os parâmetros de aquisição de elastografia, incluindo a frequência e o número de ciclos. Configure também o gerador de funções para ser acionado externamente. Para obter uma imagem sagital, defina a sensibilização ao movimento na direção positiva do corte e inicie a varredura após a aquisição.

Verifique a imagem para avaliar a qualidade do sinal na estrutura tecidual. Se a imagem parecer muito escura, ajuste os parâmetros de RM e realize uma nova aquisição. Em seguida, altere a sensibilização para a direção negativa da fatia.

Transfira os arquivos do scanner de ressonância magnética para outro computador equipado com MATLAB e execute o programa MATLAB que realizará uma divisão complexa para gerar uma imagem que mostre a propagação das ondas cisalhantes. Avalie a imagem quanto à presença de ondas cisalhantes e possíveis artefatos; perfis de linha de fase podem ser traçados para melhorar a avaliação da qualidade e da amplitude da onda. Se ocorrer enrolamento de fase, reduza a amplitude do gradiente e realize uma nova aquisição.

Se não forem necessários ajustes na imagem, ajuste o tamanho do array de parâmetros para oito valores igualmente espaçados, variando de zero segundos a um período completo da frequência de ressonância caracterizada. Adquira uma varredura nas orientações de corte positiva e negativa assim que as imagens forem adquiridas.

Utilize um programa MATLAB desenvolvido para gerar os dados da onda de cisalhamento e o filme correspondente da propagação da onda na amostra. Esse é o arquivo necessário para estimar as propriedades mecânicas. O passo final da MRE é calcular a rigidez ao cisalhamento a partir das imagens da onda de cisalhamento.

Inicie colocando os dados no programa MATLAB que irá avaliar o conjunto de dados tridimensional, especifique os parâmetros de imagem, incluindo campo de visão, gradiente, amplitude e número de pares bipolares, e execute o código. O algoritmo permite a seleção de regiões de interesse para as quais a média e o desvio padrão de cada parâmetro são calculados. Desenhe os contornos da estrutura tecidual para selecionar a região de interesse.

A média e o desvio padrão da rigidez, módulo de armazenamento e módulo de perda dentro da região de interesse selecionada são exibidas. O programa também fornece resultados intermediários, incluindo onda após filtros, onda após filtragem direcional e perfis lineares que auxiliam na estimativa da fidelidade da recuperação. Para uma estimativa precisa, a onda filtrada precisa ser suave.

O desvio padrão de um parâmetro em uma região específica de interesse também é um indicador da qualidade do cálculo; se necessário, ajuste outros parâmetros conforme necessário para obter valores precisos das propriedades mecânicas e observar as alterações nas propriedades mecânicas dos constructos projetados à medida que se desenvolvem. O teste de MRE foi aplicado ao longo de um período de quatro semanas. Este mapa de desenvolvimento do constructo mostra constructos adipogênicos, indicados pela letra A, e osteogênicos, indicados pela letra O, com as respectivas imagens de magnitude, imagens de onda cisalhante, ELAs e rigidez ao cisalhamento média exibidas.

O mapa de cores para as LAEs corresponde ao esquema de cores da barra. O gráfico e as barras de erro representam o desvio padrão dentro de cada região de interesse do construto. Com o tempo, os construtos adipogênicos tornaram-se menos rígidos, indicando propriedades semelhantes às do tecido adiposo.

Da mesma forma, os constructos osteogênicos tornaram-se mais rígidos ao longo do período de quatro semanas, indicando diferenciação semelhante à óssea. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de duas horas, se executada corretamente. Durante a tentativa deste procedimento, é importante caracterizar completamente o atuador após seguir este protocolo. Métodos como análise bioquímica e histologia podem ser utilizados para responder perguntas, como a confirmação do depósito mineral.

Não se esqueça de que, ao trabalhar com material celular humano e ressonância magnética, isso pode ser extremamente perigoso, exigindo conscientização sobre as normas adequadas de nível de biossegurança dois e ressonância magnética. Precauções devem ser tomadas durante a realização desses procedimentos.