Name: Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a caracterizar eletrofisiologicamente sinapses específicas em fatias cerebrais agudas de roedores usando construtos optogenéticos virais. Este método permite estudar vias de longo alcance e plasticidade sináptica com precisão temporal.

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Este trabalho é apoiado pela Wellcome grant 206401/Z/17/Z. Gostaríamos de agradecer a Zafar Bashir por sua orientação especializada e ao Dr. Clair Booth pela assistência técnica e comentários sobre o manuscrito.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo aqui apresentado descreve um método para explorar projeções sinápticas de longo alcance altamente específicas usando uma combinação de cirurgia estereotáxica para fornecer AAVs codificando construções optogenéticas e eletrofisiologia em cortes cerebrais agudos (Figura 1). Juntas, essas técnicas oferecem ferramentas para caracterizar a fisiologia e a plasticidade dos circuitos cerebrais com alta precisão em vias de longo alcance e anatomicamente difusas que antes eram inacessíveis...

Entender a fisiologia das sinapses e como elas sofrem alterações plásticas é fundamental para entender como as redes cerebrais funcionam no cérebro saudável1 e como elas funcionam mal em distúrbios cerebrais. O uso de fatias cerebrais ex vivo agudas permite o registro da atividade elétrica das sinapses de neurônios individuais com uma alta relação sinal-ruído usando gravações de patch clamp de células inteiras. O controle do potencial de membrana e a manipulação farmacológica direta permitem o isolamento dos subtipos de receptores. Esses registros podem ser feitos com requintada especificidade para identificar o neurônio pós-sináptico, incluindo posição laminar e sub-regional2, morfologia celular3, presença de marcadores moleculares4, suas projeções aferentes5, ou mesmo se ele estava recentemente ativo6.
Alcançar a especificidade das entradas pré-sinápticas é, no entanto, um pouco mais desafiador. O método convencional tem usado eletrodos de estimulação para excitar os axônios que correm em uma lâmina particular. Um exemplo disso é no hipocampo, onde a estimulação local no estrato radiado ativa sinapses que se projetam do subcampo CA3 ao CA17. Neste caso, a especificidade pré-sináptica é alcançada, pois a entrada CA3 representa a única entrada excitatória localizada dentro do estrato radiado que se projeta para células piramidais CA18. Esse alto grau de especificidade de entrada alcançável com a ativação pré-sináptica elétrica convencional dos axônios CA3-CA1 é, no entanto, uma exceção que se reflete no intenso estudo a que essa sinapse tem sido submetida. Em outras regiões do cérebro, axônios de múltiplas vias aferentes coexistem na mesma lâmina, por exemplo, na camada 1 do neocórtex9, tornando impossível a estimulação pré-sináptica específica de entrada com eletrodos estimulantes convencionais. Isso é problemático, pois diferentes entradas sinápticas podem ter propriedades fisiológicas divergentes; portanto, sua co-estimulação pode levar à descaracterização da fisiologia sináptica.
O advento da optogenética, codificação genética de proteínas de membrana fotossensíveis (opsinas), como a canalrodopsina-2 (ChR2), tem permitido uma vasta expansão de possibilidades para o estudo de projeções sinápticas isoladas entre regiões cerebrais10,11. Aqui descrevemos uma solução generalizável e de baixo custo para estudar a fisiologia sináptica de longo alcance e a plasticidade. Os construtos optogenéticos são entregues de maneira altamente específica usando vetores virais, permitindo um controle extremamente preciso da região pré-sináptica de interesse. Projeções eferentes expressarão o canal ativado pela luz, permitindo a ativação dessas fibras em uma região alvo. Assim, vias anatomicamente difusas de longo alcance que não podem ser ativadas independentemente pela estimulação elétrica tradicional e inespecífica podem ser estudadas.
Descrevemos, como um exemplo de via, a transdução do córtex pré-frontal medial (mPFC) com vírus adenoassociados (AAVs) que codificam opsinas excitatórias de canal catiônico. Em seguida, descrevemos o preparo de cortes agudos do córtex entorrinal lateral (LEC), registros de patch-clamp de neurônios piramidais LEC da camada 5 e ativação evocada por luz de projeções glutamatérgicas mPFC-LEC (Figura 1). Também descrevemos a avaliação histológica do local da injeção para confirmar a localização da região pré-sináptica de interesse e identificação da morfologia celular pós-sináptica.

<table><tbody><tr><td>Tubo de 0,2 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12134102</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; Pipeta L</td><td>Gilson</td><td>FD10001</td><td></td></tr><tr><td>placa de 24 poços</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Válvula luer de 3 vias</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-30600-02</td><td></td></tr><tr><td>substrato de 3,3&prime;-Diaminobenzidina (DAB)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>40x objetiva</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>4-aminopiridina</td><td>Hello Bio</td><td>HB1073</td><td></td></tr><tr><td>4x objetiva</td><td>Olympus</td><td>PLN4X/0.1</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>35512</td><td>Título viral: 3.3x1013</td></tr><tr><td>Lente acromática</td><td>Edmund Optics</td><td>49363</td><td>Focaliza o espectro visual e o infravermelho próximo</td></tr><tr><td>Microcentrífuga de bancada</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1005*</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro borosillicado</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-6</td><td></td></tr><tr><td>Burr</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Câmera - Qimaging Retiga Electro</td><td>Photometrics</td><td>01-ELECTRO-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Carbachol</td><td>Tocris</td><td>2810</td><td></td></tr><tr><td>Esfoliante cirúrgico de clorexidina</td><td>Vetasept</td><td>XHG008</td><td></td></tr><tr><td>Clippers</td><td>Andis</td><td>22445</td><td>AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper</td></tr><tr><td>Lente condensadora de colimação</td><td>ThorLabs</td><td>ACL2520-A</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10011913</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato</td><td>Rapid Electronics Ltd</td><td>84-4557</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de aquisição de dados</td><td>National Instruments</td><td>USB-6341 BNC</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico 500 nm long-pass</td><td>Edmund Optics</td><td>69899</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico 600 nm passa-longo</td><td>Edmund Optics</td><td>69901</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de espelho dicróico</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH/M</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millpore</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de eletrodo com porta lateral</td><td>HEKA</td><td>895150</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emissão</td><td>Chroma</td><td>59022m</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de excitação</td><td>Chroma</td><td>ET570/20x</td><td></td></tr><tr><td>Gel para os olhos</td><td>Dechra</td><td>Lubrithal</td><td></td></tr><tr><td>Pincel fino</td><td>Suprimentos de laboratório científico</td><td>BRU2052</td><td></td></tr><tr><td>guilhotina</td><td>World Precision Instruments</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>30% (p / p)</td></tr> <tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>988-3245</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>k-gluconato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro de fluorescência cinemática</td><td>ThorLabs</td><td>DFM1T1</td><td></td></tr><tr><td>driver de LED</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>Pomada de lidocaína</td><td>Teva</td><td>80007150</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Micro broca</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-1887</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos Sutter</td><td>extrator de microeletrodos</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de microinjeção</td><td>Hamilton</td><td>7634-01/00</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de microinjeção agulha</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Especificação personalizada: calibre 33, comprimento 15mm, estilo de ponta 4 - 12&deg;</td></tr><tr><td>Bomba de seringa de microinjeção</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>LED azul montado</td><td>ThorLabs</td><td>M470L5</td><td></td></tr><tr><td>LED verde montado</td><td>ThorLabs</td><td>M565L3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NIR LED</td><td>OSRAM</td><td></td> <td>SFH4550Usado para imagens IR refratadas de fatias, a óptica de contraste de interferência diferencial (DIC) é outro método comumente usado</td></tr><tr><td>OCT meio</td><td>VWR International</td><td>RAYLLAMB/OCT</td><td>Meio de temperatura de corte ideal</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de grampo de patch</td><td>Molecular Devices</td><td>700A</td><td></td></tr> Lâminas <tr><td>de microscópio revestidas com poli-L-lisina</td> Ministar <td></td> da World Precision Instruments Fisher Scientific Ltd <td>23-769-310</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de gravação</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi</td><td>Swann Morton</td><td>#24</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Âncora de fatia Warner Instruments SHD-26-GH/15 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico</td><td>Kopf</td><td>Modelo 902</td><td></td></tr><tr><td>Suporte estereotáxico para micro broca</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-1874</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Cirúrgico</td><td>Carl Zeiss</td><td>OPMI 1 FR pro</td><td></td></tr><tr><td>Sutura</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa para gravação intracelular solução</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>171-0020</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de tetrodotoxina</td><td>Olá Bio</td><td>HB1035</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10458842</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência vertical</td><td>Leica</td><td>DM6 B</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Meio de montagem antidesvanecimento com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>Kit VECTASTAIN ABC-HRP Vector</td><td>Laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Instruments</td><td>7000smz-2</td><td></td></tr><tr><td>WinLTP</td><td>https://www.winltp.com/</td> <td>Versão 2.32</td><td>Software de aquisição de dados</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>solução <td></td><td></td><td></td><td>de corte de sacarose</td></tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intracelular?</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo interrogação optogenética da transmissão sináptica de longo alcance e plasticidade do córtex pré-frontal medial para o córtex entorrinal lateral

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Estudar as propriedades fisiológicas de sinapses específicas no cérebro, e como elas sofrem mudanças plásticas, é um desafio fundamental na neurociência moderna. As técnicas eletrofisiológicas tradicionais in vitro usam estimulação elétrica para evocar a transmissão sináptica. Uma grande desvantagem deste método é a sua natureza inespecífica; todos os axônios na região do eletrodo estimulante serão ativados, dificultando a atribuição de um efeito a uma conexão aferente particular. Este problema pode ser superado substituindo a estimulação elétrica pela estimulação baseada em optogenética. Descrevemos um método para combinar optogenética com registros in vitro patch-praçad. Esta é uma ferramenta poderosa para o estudo da transmissão sináptica basal e da plasticidade sináptica de conexões sinápticas anatomicamente definidas precisas e é aplicável a quase qualquer via no cérebro. Aqui, descrevemos a preparação e o manuseio de um vetor viral que codifica a proteína da canalrodopsina para injeção cirúrgica em uma região pré-sináptica de interesse (córtex pré-frontal medial) no cérebro do roedor e na confecção de fatias agudas de regiões-alvo a jusante (córtex entorrinal lateral). Um procedimento detalhado para combinar registros patch-clamp com ativação sináptica por estimulação luminosa para estudar a plasticidade sináptica de curto e longo prazo também é apresentado. Discutimos exemplos de experimentos que alcançam a especificidade da via e da célula combinando optogenética e marcação celular dependente de Cre. Finalmente, a confirmação histológica da região pré-sináptica de interesse é descrita juntamente com a marcação de biocitina da célula pós-sináptica, para permitir uma identificação mais aprofundada da localização precisa e do tipo de célula.

Neste protocolo, descrevemos como estudar a fisiologia sináptica de longo alcance e a plasticidade usando a entrega viral de construtos optogenéticos. O protocolo pode ser muito facilmente adaptado para estudar quase qualquer conexão de longo alcance no cérebro. Como exemplo, descrevemos a injeção de AAVs codificando uma opsina em mPFC de ratos, a preparação de fatias agudas de LEC, registros de patch-clamp de neurônios piramidais LEC de camada 5 e ativação evocada por luz de terminais mPFC em LEC (F...

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Construtos optogenéticos entregues por via via permitem a caracterização eletrofisiológica detalhada da fisiologia e plasticidade de sinapses específicas em cortes cerebrais agudos. As principais vantagens de ativar as sinapses optogeneticamente é a capacidade de estudar vias de longo alcance e a estimulação seletiva de axônios que não são anatomicamente separados. Demonstrando o procedimento estará a Dra. Lisa Kinnavane, pesquisadora associada do nosso laboratório.Para começar, carregue uma seringa Hamilton em uma bomba de seringa de microinjeção presa a um braço móvel montado em uma estrutura estereotáxica. Em seguida, coloque uma alíquota de cinco microlitros do vírus em uma microcentrífuga. Gire o tubo por alguns segundos e pipete dois microlitros da preparação viral na tampa do tubo.Para encher a seringa com a preparação viral, veja a ponta da agulha com um microscópio cirúrgico. Em seguida, coloque manualmente o bolo do vírus na ponta da agulha e retire o êmbolo da seringa usando os controles da bomba. Defina o volume de injeção da bomba para 300 nanolitros e a taxa de fluxo para 100 nanolitros por minuto.Execute a bomba e confirme o fluxo adequado observando a gota do vírus na ponta da agulha. Absorva o vírus em um cotonete e limpe a agulha com etanol a 70%. Em seguida, usando os parafusos ajustadores no quadro estereotáxico, navegue pela ponta da agulha até o bregma e tome nota das medidas estereotáxicas observadas nas três escalas vernier no quadro.Adicione ou subtraia essas distâncias das coordenadas do bregma. Faça um furo de rebarba na superfície do crânio usando uma micro-broca montada no braço estereotáxico. Insira a agulha no cérebro na coordenada dorsoventral predeterminada e infunda um volume predeterminado da preparação viral.Após a perfusão, deixe a agulha in situ durante 10 minutos para permitir a difusão do bolo. Em seguida, remova a agulha e execute a bomba para garantir que a agulha não esteja bloqueada. Duas semanas após a injeção viral, eutanasie o rato, disseque rapidamente todo o cérebro e transfira-o para a solução de corte de sacarose.Usando uma colher de chá de metal, pegue o cérebro, descarte o excesso de solução e coloque-o em um papel de filtro. Usando um bisturi, remova o cerebelo e corte o cérebro no plano coronal aproximadamente na metade do seu comprimento. A metade posterior é o bloqueio tecidual LEC.Devolva o bloco de tecido e o cérebro restante para a solução de corte de sacarose. Em seguida, coloque uma gota de cola de cianoacrilato em um palco de vibratome e espalhe-a em uma camada fina. Em seguida, usando uma colher de chá, pegue o bloco de tecido LEC e transfira-o para o adesivo, de modo que o corte coronal anterior tenha aderido.Instale o estágio na câmara de tecido vibratório e despeje rapidamente uma solução de corte de sacarose suficiente para submergir o tecido. Depois de orientar a superfície ventral do bloco de tecido em direção à lâmina, corte fatias de 350 micrômetros de espessura do ventral para o dorsal usando uma velocidade lenta de avanço da lâmina. Normalmente, sete fatias podem ser obtidas por hemisfério.Transfira as fatias para a câmara de coleta de fatias. Em seguida, coloque a câmara de coleta em banho-maria de 34 graus Celsius por uma hora antes de retornar à temperatura ambiente. Coloque o restante do cérebro em paraformaldeído por 48 horas.Para a identificação da célula-alvo, coloque a fatia na câmara de gravação e imobilize-a usando uma âncora de fatia. Sob baixa ampliação, usando iluminação infravermelha, navegue até a camada cinco do LEC. Em seguida, mude para o objetivo de imersão em água de alta ampliação e identifique os neurônios piramidais.Marque a posição da célula no monitor com fita adesiva. Em seguida, para formar uma braçadeira de remendo celular inteiro, fabrique uma micropipeta de vidro de borossilicato e preencha-a com uma solução de gravação intracelular. Coloque a micropipeta cheia no suporte do eletrodo e aplique pressão positiva soprando com força em um bocal conectado à porta lateral do suporte do eletrodo.Levante a objetiva do microscópio de tal forma que um menisco se forme e insira o eletrodo no menisco até que ele possa ser visto no microscópio. Abra a janela Teste de vedação e determine se a resistência da pipeta é de três a cinco megaohms. Em seguida, toque a célula identificada com uma ponta de pipeta, resultando em um recuo na membrana celular.Em seguida, aplique pressão negativa por sucção no bocal, aumentando a resistência da pipeta. Continue aplicando pressão negativa gradualmente até que a membrana celular se rompa, resultando em transientes de capacitância de célula inteira. Para entrar na configuração atual da braçadeira, use um LED montado direcionado para o caminho da luz do microscópio com cubos de filtro e óptica apropriada e aplique pulsos de luz à fatia através da objetiva de 40X.Forneça trens de múltiplos pulsos de luz a cinco hertz, 10 hertz e 20 hertz para investigar as propriedades de liberação pré-sináptica. Para permitir que a biocitina preencha o neurônio, aguarde pelo menos 15 minutos depois de entrar em toda a configuração celular. Na braçadeira de tensão, monitore a capacitância da membrana e a resistência de entrada.Em seguida, retire lentamente a pipeta ao longo do ângulo de aproximação para longe do somatório da célula, observando o lento desaparecimento dos transientes de capacitância e da corrente de membrana, indicando a reselagem da membrana celular e a formação de um remendo externo na ponta da pipeta. Coloque a fatia em paraformaldeído em uma placa de 24 poços e incube durante a noite. Usando o meio OCT, prenda um bloco de tecido ao disco da amostra de criostato.Para congelar o tecido, coloque o isopentano num recipiente apropriado e submerja o disco da amostra, garantindo que o tecido está acima do nível do isopentano. Em seguida, abaixe o recipiente de isopentano em nitrogênio líquido e deixe o tecido congelar. Uma vez que o tecido esteja completamente congelado, deixe o bloco de tecido na câmara de criostato a menos 20 graus Celsius por 30 minutos para permitir que a temperatura do bloco se equilibre.Após o equilíbrio, corte seções de 40 micrômetros de espessura no criostático e use um pincel fino para guiar as seções da lâmina. Aderir estas secções congeladas a uma lâmina de microscópio de vidro revestido de poli-L-lisina à temperatura ambiente, tocando a lâmina nas secções. Depois de adicionar 150 microlitros de meio de montagem a cada lâmina, aplique o deslizamento da tampa e remova as bolhas de ar pressionando suavemente o deslizamento da tampa.Cubra as lâminas para proteger contra o fotobranqueamento e deixe-as secar ao ar por 12 horas. Em seguida, usando um microscópio de fluorescência, examine a localização do local da injeção viral. Para a coloração com biocitotina, incubar as fatias em peróxido de hidrogênio a 3% em PBS por 30 minutos para bloquear qualquer atividade endógena da peroxidase.Em seguida, lave as fatias cerebrais com PBS até que não haja mais bolhas de oxigênio visíveis. Em seguida, incubar os cortes por três horas em solução complexa HRP biotinilada a 1% de avidina em PBS contendo 0,1%Triton X-100. Após seis lavagens de PBS, incubar cada fatia em solução de DAB até que a coloração de biocitina das estruturas neuronais se torne visível.Pare a reação transferindo as fatias em PBS frio. Em seguida, monte as fatias nas lâminas do microscópio de vidro usando um pincel. Depois de remover o excesso de PBS, adicione o meio de montagem.Cubra as fatias usando folhas de cobertura e deixe-as secar ao ar, como demonstrado anteriormente. Uma célula piramidal saudável foi localizada e remendada. Se a identificação de células pós-sinápticas for necessária, uma célula que expresse o marcador fluorescente deve ser localizada usando óptica de campo amplo.Pulsos de luz simples de dois milissegundos resultaram em potenciais pós-sinápticos excitatórios optogenéticos de forma de onda simples. A plasticidade de curto prazo da sinapse é examinada pela aplicação de cinco trens de 10 e 20 hertz de estimulação luminosa. Ao investigar a plasticidade a longo prazo, a adição do agonista colinérgico carbachol ao aCSF circulante por 10 minutos causou uma depressão a longo prazo que ainda era evidente 40 minutos após a remoção do ligante.O comprimento do local de injeção foi examinado histologicamente. O repórter fluorescente mCherry foi localizado nas camadas mais profundas do córtex pré-límbico e infralímbico. Além disso, a coloração de uma célula cheia de biocitina confirmou sua localização e morfologia.As etapas críticas deste protocolo são a transdução precisa da região aferente do cérebro, que pode ser verificada post hoc, e a dissecção rápida do cérebro ao preparar fatias agudas. Este procedimento é facilmente combinado com a marcação fluorescente de um tipo de célula individual, como uma subclasse de interneurônios em particular. Para fazer isso, usaríamos um animal transgênico que expressa uma recombinase nesse tipo específico de célula.As construções optogenéticas entregues Viralmente permitiram avanços rápidos nos campos da neurociência de sistemas e circuitos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o procedimento para estudar a eficiência sináptica no córtex entorrinal lateral (LEC) estimulando optogeneticamente os axônios do córtex pré-frontal medial (mPFC) e registrando as respostas dos neurônios piramidais no LEC. Este método combina gravações de patch-clamp com ativação sináptica por estimulação de luz para estudar a plasticidade sináptica.

Estimulação optogenética e registro eletrofisiológico de eventos sinápticos em fatias de cérebro de rato

Experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta aos desafios comportamentais.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

Descrevemos um método para caracterizar a topografia funcional e as propriedades sinápticas dos circuitos do prosencéfalo usando uma abordagem optogenética para fotoestimular populações neuronais in vitro.

Fotoestimulação de varredura a laser de circuitos de prosencéfalo optogeneticamente direcionados

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

abordagens optogenética são amplamente utilizados para manipular a atividade neural e avaliar as consequências para o funcionamento do cérebro. Aqui, uma técnica que é descrita por expressão in vivo do activador channelrodopsina óptico, permite a análise ex vivo de propriedades sinápticos de longo alcance específico e conexões neurais locais em circuitos relacionados com o medo.

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

Este protocolo descreve um conjunto de métodos para identificar a conectividade funcional específica do tipo de célula de entradas de longo alcance de regiões cerebrais distantes usando estimulações optogenéticas em fatias de cérebro ex vivo.

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Este método descreve uma preparação crônica que permite o acesso óptico ao hipocampo de camundongos vivos. Esta preparação pode ser utilizada para realizar imagens ópticas longitudinais de plasticidade estrutural neuronal e plasticidade celular evocada por atividade ao longo de um período de várias semanas.

Imagem latente longitudinal do dois-fotão do hipocampal dorsal CA1 em ratos vivos

O protocolo atual demonstra um método simples para traçar projeções de glutamato da área tegmental ventral (VTA) para o hipocampo. A fotostimulação dos neurônios de glutamato VTA foi combinada com a gravação de CA1 para demonstrar como terminais de glutamato VTA modulam a taxa de disparo piramipário putativo ca1 in vivo.

Rastreamento Anatômico e Funcional In Vivo dos Terminais de Glutamato da Área Tegmental Ventral no Hipocampo

Desenvolvemos uma abordagem simplificada e econômica para a fabricação de eletrodos e realizamos gravações de sinais em várias regiões em camundongos em movimento livre. A utilização da optogenética, juntamente com a eletrofisiologia multirregional e o registro do sinal de cálcio, permitiu a revelação de atividades neuronais em todas as regiões do modelo de acendimento de convulsões.

Um método integrado para criar otérios eletrofisiológicos flexíveis e convenientes para gravação in vivo em várias regiões

Aqui, apresentamos dois protocolos para registro de microeletrocorticografia de alta densidade (μEcoG) em ratos e camundongos, incluindo métodos cirúrgicos, de implantação e de registro. As gravações de μECoG são realizadas em combinação com a gravação de politrodo laminar no córtex auditivo de ratos ou com a manipulação optogenética da atividade neural no córtex somatossensorial de camundongos.

Investigações Multiescala de Processamento Cortical Integrando Politrodos Laminares e Optogenética com Microeletrocorticografia em Roedores

Este protocolo descreve um método cirúrgico em duas fases para criar uma grande janela craniana revedável e preservadora da dura-máter em camundongos. Essa técnica permite registros eletrofisiológicos crônicos e multimodais a partir de redes transmissas profundas do cérebro, como a Rede de Modos Padrão, ao longo de várias semanas.

Protocolo cirúrgico para uma grande janela craniana reselável que permite registros eletrofisiológicos longitudinais e multimodais da rede de modo padrão do camundongo

Aprenda a caracterizar eletrofisiologicamente sinapses específicas em fatias cerebrais agudas de roedores usando construtos optogenéticos virais. Este método permite estudar vias de longo alcance e plasticidade sináptica com precisão temporal.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral (Vídeo) | JoVE Journal

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

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