Estimulação optogenética e registro eletrofisiológico de eventos sinápticos em fatias de cérebro de rato

Comece com uma fatia de cérebro de rato contendo a região do neurônio alvo conectada a um axônio sensível à luz de uma região diferente do cérebro.

Coloque a fatia na câmara de gravação submersa e prenda-a com uma âncora de fatia.

Sob um microscópio, localize a camada desejada e identifique o neurônio piramidal alvo.

Levante a objetiva do microscópio para criar um menisco com a superfície da fatia.

Abaixe uma micropipeta de vidro cheia de solução de registro intracelular neste menisco.

Toque na célula piramidal identificada com a ponta da pipeta para criar um recuo na membrana.

Aplique sucção para formar uma vedação.

Aumente a sucção até que a membrana se rompa, estabelecendo uma configuração de célula inteira.

Usando uma fonte de luz montada, aplique pulsos de luz na fatia.

Esses pulsos de luz desencadeiam um potencial de ação no axônio sensível à luz, liberando neurotransmissores na fenda sináptica.

Registre as respostas do neurônio piramidal a essas liberações para analisar a eficiência sináptica.

Para identificação da célula-alvo, coloque a fatia na câmara de gravação e imobilize-a usando uma âncora de fatia. Sob baixa ampliação, usando iluminação infravermelha, navegue até a camada LEC 5. Em seguida, mude para a objetiva de imersão em água de alta ampliação e identifique os neurônios piramidais.

Marque a posição da célula no monitor com fita adesiva. Em seguida, para formar um patch clamp de célula inteira, fabrique uma micropipeta de vidro de borossilicato e encha-a com solução de gravação intracelular. Coloque a micropipeta cheia no porta-eletrodo e aplique pressão positiva soprando com força em um bocal conectado à porta lateral do porta-eletrodo.

Levante a objetiva do microscópio de forma que um menisco se forme e insira o eletrodo no menisco até que possa ser visto no microscópio. Abra a janela de teste de vedação e determine se a resistência da pipeta é de três a cinco megaohms. Em seguida, toque na célula identificada com uma ponta de pipeta, resultando em um recuo na membrana celular.

Em seguida, aplique pressão negativa por sucção no bocal, aumentando a resistência da pipeta. Continue aplicando pressão negativa gradualmente até que a membrana celular se rompa, resultando em transientes de capacitância de toda a célula. Para entrar na configuração de pinça de corrente, use um LED montado direcionado para o caminho da luz do microscópio com cubos de filtro e óptica apropriada e aplique pulsos de luz à fatia por meio da objetiva de 40x. Forneça trens de vários pulsos de luz a 5 Hertz, 10 Hertz e 20 Hertz para investigar as propriedades de liberação pré-sináptica.