Um Modelo de Infusão Crónica de nutrientes no Rato

Um protocolo para as infusões crónicas de glicose e Intralipid no rato é descrito. Este modelo pode ser utilizado para estudar o impacto do excesso de nutrientes sobre a função do órgão de parâmetros fisiológicos.

O objetivo geral deste procedimento é cateterizar as veias jugulares e artérias carótidas de ratos para infundir glicose e lipídios como um modelo para o excesso crônico de nutrientes. Isso é feito primeiro cateterizando a veia jugular e a artéria carótida sob anestesia geral. Após o procedimento, o rato pode se recuperar por seis dias.

Em seguida, os cateteres são conectados às bombas de infusão por meio de uma corda e giro montados no topo da gaiola. Finalmente, o rato é infundido com soluções de glicose e lipídios. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram os efeitos do excesso crônico de nutrientes na homeostase da glicose.

A principal vantagem dessa técnica sobre outros modelos, como modelos genéticos, por exemplo, é que se pode examinar as mudanças iniciais na função das células beta em resposta ao excesso de nutrientes. A outra vantagem é que se pode modular especificamente os níveis de glicose e intralipídios ou lipídios na circulação. Agora, usamos essa técnica para examinar as mudanças na função das células beta, mas é claro que ela pode ser usada para observar outros parâmetros fisiológicos, como a resistência à insulina.

Por exemplo, demonstrando o procedimento estará Grace Ferguson, uma técnica de saúde animal em meu laboratório, Antes de começar, esterilize todos os instrumentos cirúrgicos em autoclave pelo menos 16 a 24 horas antes do procedimento. Coloque o tubo de canulação em 2,6% de aldeído de glúteo para esterilização. Usando quatro ratos por condição de infusão, pesar cada rato e calcular as dosagens para a analgesia e os medicamentos anticolinérgicos.

Depois de anestesiar o rato com dois a 3% de iso, flúor e oxigênio, verifique o nível de sedação pelo dedo do pé. Aperte e coloque o rato de bruços. Raspe a área atrás das orelhas até a base dos ombros, vire o animal de costas e raspe a região sob o pescoço até as patas dianteiras.

Em seguida, desinfete o local da cirurgia três vezes com álcool clorexidina e iodo e, em seguida, administre carprofeno e glicopirrolato. Transferir o rato para a área cirúrgica e, em seguida, com técnica asséptica. Usando uma cânula PE 50 conectada a uma seringa de um mililitro cheia de cinco unidades de solução salina heparinizada, canule a veia jugular direita e a artéria carótida esquerda Para evitar a coagulação durante o período de recuperação, lave as cânulas com 50 unidades de solução salina heparinizada através de uma agulha embotada de calibre 23 e, em seguida, use outro pino de calibre 23 para fechar cada cânula após a cirurgia, Apare cerca de 2,5 milímetros da parte inferior dos incisivos e coloque o rato em uma camisa de infusão para evitar que as cânulas sejam comidas.

Para ajudar a evacuar o flúor ISO, administre oxigênio a um litro por minuto. Coloque o rato em uma gaiola aquecida até que esteja totalmente acordado. Nos dias um e dois, pós-cirurgia.

Pesar os ratos, administrar glicopirrolato, por via subcutânea, duas vezes no primeiro dia e uma vez no segundo dia, e fornecer tratamentos adicionais quando necessário de acordo com o protocolo de texto no sétimo dia pós-operatório. Depois de pesar cada rato para calcular as taxas de fluxo para infusão, conecte a cânula da veia jugular por uma extensão de tubo dentro da mola ao giro azul. Lave as cânulas com cinco unidades de solução salina heparinizada e conecte-as à corda.

Em seguida, conecte o rato ao sistema de infusão usando a corda e o giro. Agora lave as cânulas mais uma vez com cinco unidades de solução salina heparinizada para evitar a coagulação. Deixe os ratos se aclimatarem à corda e girarem por pelo menos 24 horas antes de iniciar a infusão para realizar a infusão.

Comece tirando 0,15 mililitros de sangue da carótida de cada rato e meça a glicemia. Lave as cânulas jugulares e use 50 unidades de solução salina heparinizada para evitar a coagulação de ambas as cânulas. Transfira a amostra de sangue para um tubo de coleta de 0,5 mililitro contendo 2% de EDTA, centrifugue a 10.000 RBM por dois minutos e congele o plasma a menos 20 graus Celsius.

Encha duas seringas de 60 mililitros para cada uma das condições de perfusão listadas aqui. Use conectores y e tubos coex T 22 esterilizados para unir cada par de soluções. Em seguida, coloque as seringas em uma bomba de seringa Harbor 33, colocando a seringa um na posição frontal da bomba e a seringa dois na posição traseira.

Em seguida, troque o fundo da gaiola e remova todos os alimentos da parte superior da grelha da gaiola antes de substituí-la por 150 gramas de ração padrão. Em seguida, conecte as seringas ao giro na grade da gaiola e lave as seringas corretamente. Para remover o ar preso das linhas usando o peso corporal determinado mais recentemente, calcule as taxas de fluxo de infusão usando um arquivo Excel que converte a taxa de infusão de glicose ou GIR em mililitros por hora com base nos níveis de glicose predeterminados que desejam manter durante todo o experimento.

Defina a bomba para administrar taxas de fluxo para 60 seringas de acordo com as configurações do fabricante e insira a taxa para a seringa um e a seringa dois. Em seguida, ligue a bomba. Depois de ligar a bomba, verifique se não há vazamento do giro ou das cânulas e se o tubo de infusão não está torcido.

Além disso, verifique se não há bolhas de ar na tubulação. Após três horas de infusão, pegue uma pequena amostra de sangue e use um monitor portátil de glicose para medir a glicemia. Pequenos volumes evitarão a alteração do volume sanguíneo e/ou hematócrito.

Colete amostras de sangue adicionais usando este horário. Com base nos valores de glicemia medidos, modifique a taxa da seringa um para manter a glicose no sangue em 220 a 250 miligramas por decilitro. A taxa da seringa dois permanece constante para manter os ácidos graxos livres em um milimol por litro.

Após 24 horas de infusão, troque o fundo da gaiola e pese os alimentos restantes na grelha da gaiola. Retorne a porção UNE para a gaiola, grelhe e reabasteça as seringas conforme necessário ao longo das 72 horas. Observe o rato em busca de sinais de inflamação ou desconforto e administre os cuidados apropriados conforme necessário.

No final da infusão, os ratos podem ser submetidos a estudos de pinça hiperinsulinêmica hiperglicêmica ou glicêmica e, posteriormente, eutanasiados ou eutanasiados para coletar o pâncreas para histologia ou isolamento do ilhó. Esta figura mostra os níveis de sangue, glicose e ácidos graxos durante o período de infusão de 72 horas. Conforme mostrado aqui pelo design, os níveis de glicose são mantidos em torno de 220 a 250 miligramas por decilitro durante a infusão.

Os roedores têm uma forte capacidade de compensar a infusão de glicose, aumentando a secreção endógena de insulina. Portanto, o GIR deve ser aumentado durante o curso da infusão para que os níveis de glicose no sangue sejam mantidos em um estado relativamente estável. No entanto, os níveis de glicose no sangue tendem a diminuir no final da infusão.

Além disso, com base nas medições de peso da ração, uma vez que os animais com infusão de glicose e intralipídios estão recebendo nutrientes calóricos, eles diminuem espontaneamente sua ingestão de alimentos. Ao contrário dos ratos de controle com infusão salina, uma vez dominados, essa técnica pode ser realizada em 30 a 40 minutos por rato, se for feita corretamente. Portanto, após esse procedimento, geralmente realizamos pinças anêmicas hiperglicêmicas ou hiperglicêmicas U glicêmicas para medir a secreção de insulina ou a sensibilidade à insulina, respectivamente.