Name: Um Modelo de Infusão Crónica de nutrientes no Rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprenda a criar um modelo de infusão crónica de nutrientes em ratos para estudar os efeitos do excesso de glicose e lipídios na homeostase da glicose e na função metabólica.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R01DK58096 de Vincent Poitout). Vincent Poitout detém o Canada Research Chair em Diabetes e pâncreas a função das células beta. Bader Zarrouki receberam bolsas de pós-doutorado da Merck e Eli Lilly. Ghislaine Fontes foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da Associação de Diabetes canadense.

Resumo: O procedimento consiste em cateterização da veia jugular direita e da artéria carótida esquerda, sob anestesia geral, permitindo um período de recuperação de 7 dias, permitindo a conexão dos cateteres para as bombas através de um suporte giratório e do sistema de contrapeso que permite que o animal se mover livremente na gaiola; e infusão de glicose e / ou Intralipid (uma emulsão de óleo de soja, que gera uma mistura de aproximadamente 80% unsaturated/20% de ácidos gordos saturados quando infundida com heparina 9) durante 72 horas. 1. Canulação da veia jugular direita e da artéria carótida esquerda <ol><li> Esterilizar instrumentos cirúrgicos. Tubagem de canulação também deve ser esterilizado a frio, utilizando um agente de esterilização líquido (2,6% de glutaraldeído) antes do procedimento. Mergulhe o tubo em um recipiente autoclavado por 16-24 horas. Enxágue e lave bem com água destilada estéril para remover todos os vestígios de glutaraldeído antes do uso. </li><li> Pesa-se o rato para calculardoses de droga: Carprofeno 5 mg / kg: diluição de 1/10 = Peso corporal (g) x 0,001 mL SC (analgésica) Glicopirroplato 0,01 mg / kg: diluição de 1/10 = BW (g) X 0,0012 ml de SC (anticolinérgicos) </li><li> Anestesiar o rato com isoflurano e oxigênio. </li><li> Coloque o rato em seu estômago. Raspar a área atrás das orelhas até à base dos ombros. Coloque o rato em suas costas. Raspar a região sob o pescoço com as patas dianteiras. </li><li> Preparação do local cirúrgico com clorexidina, álcool e iodo. Administrar drogas. </li><li> Transferir o rato para o campo cirúrgico. </li><li> Utilizando uma técnica asséptica, canulate a veia jugular direita e da artéria carótida esquerda, uma cânula de PE-50 ligado a uma seringa de 1 ml, cheio com 5 L de solução salina heparinizada. Lave as cânulas com 50 L de solução salina heparinizada para evitar a coagulação durante o período de recuperação. Use agulhas 23G embotados. Feche cada cânula com um pino de 23G. </li><li> Após a cirurgia, cortar cerca de 2,5 mm daincisivos inferiores e coloque o rato em uma jaqueta de infusão para evitar que as cânulas de ser comido. </li><li> Fornecer oxigénio (1 L / min durante 10 min) para ajudar a evacuar isoflurano. </li><li> Coloque o rato em uma gaiola aquecida até que esteja completamente desperto. </li><li> Operar quatro ratos para usar um por condição infusão (Tabela 1). </li></ol> 2. Pós-operatório Care (tratamento pós-cirúrgico e conexão dos cateteres) <ol><li> Pesar os animais no dia 1 e dia 2 pós-cirurgia. </li><li> Administrar glycopyrrolate (BW (g) x 0,00048 ml) SC duas vezes no 1 º dia pós-operatório e uma vez no dia 2 pós-cirurgia. </li><li> Tratamentos de suporte adicionais podem ser administradas, se necessário: fluidos, almofada de aquecimento, dieta molhado, oxigenoterapia, analgésicos, anticolinérgicos. </li><li> No dia 7 pós-operatório, pesar os ratos para calcular as taxas de fluxo de infusão. </li><li> Ligação cada rato para um sistema de infusão utilizando uma corda e giratória montada no topo de uma grade de gaiola (Figura 1).</li><li> Lave as cânulas com 5 L de solução salina heparinizada para remover coágulos. Lave as cânulas mais uma vez com 50 L de solução salina heparinizada para prevenir a coagulação. </li><li> Permitir que os ratos a aclimatar ao tirante e rodar, pelo menos, 24 horas antes do início da infusão. </li></ol> 3. Infusão <ol><li> Desenhar 0,15 ml de sangue a partir da carótida de cada rato e medir a glicemia. Lave as cânulas jugulares. Usar 50 L de solução salina heparinizada para evitar a coagulação em ambos os cânulas de cada rato. </li><li> Transferência da amostra de sangue para um tubo de 0,5 ml contendo 2% de recolha de EDTA. Centrifugar a 10.000 rpm durante 2 min e congelar o plasma a -20 ° C. </li><li> Encha duas seringas de 60 ml para cada uma das condições listadas abaixo de infusão. Seringa um lugar na posição da frente da bomba de seringa e local 2 na posição posterior da bomba. </li><li> Junte-se cada par de soluções em conjunto com y-conectores e tubos T22 CO-EX, que foi esterilizado. Coloque as seringas em uma Harvard 33Bomba de seringa dupla. </li><li> Altere o fundo da gaiola e retire todos os alimentos do topo da grade da gaiola. </li><li> Pesar 150 g de ração padrão e coloque sobre a grelha superior gaiola. </li><li> Ligue as seringas à peça giratória na grade da gaiola. Lave as seringas adequadamente para remover o ar retido a partir das linhas. </li><li> Calcular as taxas de fluxo de infusão que utilizam o peso corporal, que foi tomada antes de ligar o rato para o sistema de infusão. As tarifas são calculadas com um arquivo do Microsoft Excel que converte a taxa de infusão de glicose (GIR) em ml / h. </li><li> Defina a bomba para administrar as taxas de fluxo de 60 ml seringas de acordo com as definições do fabricante. Digite a taxa de Seringa 1 (seringa frente) ea taxa de Seringa 2 (back seringa). </li><li> Iniciar a bomba. </li></ol> 4. Monitoramento <ol><li> Depois de iniciar a bomba, verificar que não existe vazamento da peça giratória ou das cânulas de tubagem de infusão e que não é torcida. Verifique também se não há bolhas de ar naa tubagem. </li><li> Após 3 horas de infusão, tomar uma amostra de sangue para monitorar a glicemia. Repita depois de 6, 24, 48 e 72 horas de infusão. Como medida de precaução, a glicemia também é monitorada após 30, 34, 54 e 60 horas da infusão. Glucose no sangue pode ser medida utilizando uma gota de sangue completo, utilizando um monitor de glucose portátil. Isso limita a quantidade de sangue colhido durante a infusão e, por conseguinte, evita que altera significativamente o volume de sangue e / ou hematócrito. </li><li> A taxa de seringa 1 está modificado com base nos valores de glicemia para manter a glicose no sangue em 220-250 mg / dl. A taxa para Seringa dois não se altera durante a hr 72 de infusão, pois os ácidos graxos livres são mantidos em 1 mmol / L. </li><li> Condições de infusão são emparelhados de modo a que o volume recebido para os animais de controlo é equivalente ao volume recebido para os animais de ensaio (Tabela 1). </li><li> Após 24 horas de infusão, mudar o fundo da gaiola e pesar a comida restante na grade da gaiola. Retornar a parte restos de toa grelha gaiola. Repita depois de 48 horas. </li><li> Seringas de recarga diária, conforme necessário durante o hr 72 de infusão. </li><li> Durante a infusão, sempre observar o rato por quaisquer sinais de inflamação ou desconforto. Administrar os cuidados adequados, se necessário. </li></ol> 5. Eutanásia pós-infusão <ol><li class="jove_content"> Após 72 horas de infusão, os ratos são anestesiados por via intravenosa, com 0,5 ml de um cocktail de cetamina / xilazina (182 mg / kg de cetamina e de 11,6 mg / kg de xilazina diluída 1:2 com 0,9% de NaCl). </li><li class="jove_content"> O reflexo toe-pitada é utilizado para verificar o nível de anestesia. Adicional anestésico é administrado como necessário. </li><li class="jove_content"> Quando o rato é anestesiado, a cavidade abdominal é aberta com uma tesoura cirúrgica. O rato é sangrados através da elaboração de 10-15 ml de sangue numa seringa a partir da aorta ou da veia cava. </li></ol>

<ol><li>Poitout, V., Robertson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucolipotoxicity%3A+fuel+excess+and+beta-cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Glucolipotoxicity: fuel excess and beta-cell dysfunction.</a> Endocr. Rev. 29, 351-366 (2008).</li>
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</ol>

Vincent Poitout é co-fundador e recebeu contratos de investigação a partir de Bêtagenex Inc., uma organização de pesquisa de contrato, que oferece o modelo de infusão apresentada neste artigo como um serviço comercial.

Embora um certo número de estudos anteriores têm utilizado infusões crónicas de glicose (por exemplo, 10-15) ou lípidos (por exemplo, 16,17) em roedores, para o nosso conhecimento da infusão conjunta de ambos os combustíveis apenas foi avaliado em ratos 18. O modelo de infusão crónica aqui apresentado oferece diversas vantagens para o estudo dos efeitos sobre o excesso de nutrientes de uma variedade de funções biológicas em ratos. Primeiro, ele não envolve roedores gene...

Os níveis cronicamente elevados de glucose e lípidos na circulação têm sido propostos para contribuir para a patogénese da diabetes tipo 2 alterando a função de vários órgãos implicados na manutenção da homeostase da glucose, incluindo, mas não limitado a, o das células beta do pâncreas (revisto em 1). Os glicotoxicidade hipótese postula que a hiperglicemia crônica agrava o defeito das células beta que deu origem à hiperglicemia, em primeiro lugar, criando assim um ciclo vicioso e contribuindo para a deterioração do controle da glicose em pacientes diabéticos tipo 2. Da mesma forma, a hipótese propõe que as elevações glucolipotoxicity concomitantes dos níveis de glucose e lípidos, como frequentemente observadas em pacientes com diabetes tipo 2, são prejudiciais para a célula beta. Decifrar os mecanismos celulares e moleculares dos efeitos deletérios de nutrientes cronicamente elevados sobre a função das células beta do pâncreas é fundamental para o understanding da patogénese da diabetes de tipo 2 1. Para esse efeito, um grande número de estudos examinaram os mecanismos de nutrientes em excesso ex vivo crónica nas ilhotas de Langerhans isoladas ou in vitro, em linhas de células secretoras de insulina clonais. Contudo, a tradução dos resultados obtidos nestes sistemas modelo para todo o organismo é complexo, em especial, porque as concentrações de ácidos gordos utilizados na cultura de células ou ilhotas raramente igualar os níveis de circulação in vivo de 2 a vizinhança das células beta. Por outro lado, os mecanismos de falha das células beta em resposta ao excesso de nutrientes foram examinados em modelos de roedores da diabetes, tal como exemplificado pelo rato Zucker Diabetic Fatty 3,4, o gerbilo Psammomys obesus 5 e o elevado teor de gordura da dieta fed rato 6. Estes modelos, no entanto, são caracterizados por anormalidades metabólicas intrínsecas e não são facilmente adaptado às manipulações da glicose no sanguee / ou os níveis de lipídeos em um ambiente mais controlado e menos crônica. Para ser capaz de alterar os níveis circulantes de nutrientes num período de tempo de dias em animais normais em contrário, nós desenvolvemos um modelo de infusão crónica em ratos normais, o que nos permite examinar os efeitos de lípidos e de glucose, sozinho ou em combinação, sobre os parâmetros fisiológicos e função 7,8.

<table><tbody><tr><td>Solução salina 0,9%</td> <td>BD</td><td>JB1324</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose 70%</td> <td>McKesson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intralipídio 20%</td> <td>Fresenius Kabi</td><td>JB6023</td><td></td></tr><tr><td>Metricide (Glutaraldeído 2,6%)</td> <td>Metrex</td><td>11-1401</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sódica 10.000 USP u / ml</td><td>PPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Metacam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicopirrolato</td><td>Sandoz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clohexidina 2%</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Álcool 70%</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Iodo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE-50</td><td>BD</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>CO-EX T22</td><td>Instech Solomon</td><td>BCOEX-T22</td><td></td></tr><tr><td>Conector 22G</td><td>Instech Solomon</td><td>SC22/15</td><td></td></tr><tr><td>Giratório 22G</td><td>Instech Solomon</td><td>375/22PS</td><td></td></tr><tr><td>Conector Y 22G</td><td>Instech Solomon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contrapeso e braço</td><td>Instech Solomon</td><td>CM375BP</td><td></td></tr><tr><td>23 G agulhas cegas</td><td>Instech Solomon</td><td>LS23</td><td></td></tr><tr><td>23 G pinos de canulação</td><td>Instech Solomon</td><td>SP23/12</td><td></td></tr><tr><td>Amarras (12 polegadas)</td><td>Lomir</td><td>RT12D</td><td></td></tr><tr><td>Revestimentos de infusão </td><td>Lomir</td><td>RJ01, RJ02, RJ03, RJ04</td><td></td></tr>(<tr><td>SM-XL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peça de fixação de amarração</td><td>Lomir</td><td>RS T1</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 60 ml</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 1 ml</td><td>BD</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de infusão crónica de nutrientes no rato

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

A exposição crónica a níveis excessivos de nutrientes é postulada para afectar a função de vários órgãos e tecidos, e para contribuir para o desenvolvimento de muitas complicações associadas à obesidade e à síndrome metabólica, incluindo diabetes tipo 2. Para estudar os mecanismos pelos quais os níveis excessivos de glucose e ácidos gordos afectam o das células beta do pâncreas e da secreção de insulina, criámos um modelo de infusão de nutrientes crónica no rato. O procedimento consiste em cateterização da veia jugular direita e da artéria carótida esquerda, sob anestesia geral, permitindo um período de recuperação de 7 dias, permitindo a conexão dos cateteres para as bombas através de um suporte giratório e do sistema de contrapeso que permite que o animal se mover livremente na gaiola, e infundindo glicose e / ou Intralipid (uma emulsão de óleo de soja, que gera uma mistura de aproximadamente 80% unsaturated/20% de ácidos gordos saturados quando infundida com heparina) durante 72 horas. Este modelo oferece vários advantages, incluindo a possibilidade de modular finamente os níveis alvo de glicose e os ácidos gordos de circulação, a opção de co-infundir compostos farmacológicos, e o período de tempo relativamente curto em oposição aos modelos dietéticos. Ele pode ser usado para examinar os mecanismos de disfunção de nutrientes induzida por uma variedade de órgãos e para testar a eficácia de drogas neste contexto.

De uma série de 42 ratos, que foram submetidos à cirurgia, cinco ratos foram perdidos durante o período pós-operatório e um rato foi perdida durante a infusão, o que representa uma taxa de sucesso global de 86%. O peso corporal médio dos 37 ratos que eventualmente foram infundidos foi 608 ± 5 g, antes da cirurgia e 588 ± 6 g no início da perfusão (média ± EP, n = 37, P &lt;0,0001 por teste t emparelhado). Os seguintes resultados representativos foram obtidos em dois grupos: de infusão. Saline (SAL) e glicose + intralipi...

Um protocolo para as infusões crónicas de glicose e Intralipid no rato é descrito. Este modelo pode ser utilizado para estudar o impacto do excesso de nutrientes sobre a função do órgão de parâmetros fisiológicos.

Um Modelo de Infusão Crónica de nutrientes no Rato

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

O objetivo geral deste procedimento é cateterizar as veias jugulares e artérias carótidas de ratos para infundir glicose e lipídios como um modelo de excesso crônico de nutrientes. Isso é realizado primeiramente cateterizando a veia jugular e a artéria carótida sob anestesia geral. Após o procedimento, permite-se que o rato se recupere por seis dias.Em seguida, os cateteres são conectados a bombas de infusão por meio de um cabo e um conector rotativo montados na parte superior da gaiola. Por fim, a rata é infundida com soluções de glicose e lipídios. Como resultado, podem ser obtidos dados que demonstram os efeitos do excesso crônico de nutrientes na homeostase da glicose.A principal vantagem dessa técnica em comparação com outros modelos, como modelos genéticos, por exemplo, é que é possível examinar as alterações iniciais na função das células beta em resposta ao excesso de nutrientes. A outra vantagem é que é possível modular especificamente os níveis de glicose e intralipídios ou lipídios na circulação. Atualmente, utilizamos esta técnica para examinar alterações na função das células beta, mas, é claro, ela pode ser usada para analisar outros parâmetros fisiológicos, como resi

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Este vídeo demonstra a canulação intraduodenal em um modelo de rato. Após anestesiar o rato, o duodeno é localizado e uma pequena punção é criada. Uma cânula em forma de J com ponta chanfrada é cuidadosamente inserida e presa, e a incisão é fechada. O modelo de rato canulado permite a infusão intra-intestinal para estudos de imunopatologia.

Canulação intraduodenal em modelo de rato para estudos de imunopatologia

Este protocolo descreve um modelo de camundongo cateterizado centralmente de doença crítica prolongada. Combinamos o método de ligadura e punção cecal para induzir sepse com o uso de uma linha venosa central para administração de fluidos, medicamentos e nutrientes para mimetizar o ambiente clínico humano.

O uso de um cateter venoso central para fluidos, drogas e Administração de nutrientes em um modelo do rato da doença crítica

Este protocolo descreve o uso de uma dieta altamente palatável, de estilo ocidental cafeteria para modelar excessos e obesidade em roedores. Aqui, fornecemos um esboço detalhado da seleção, preparação e medição de alimentos e explicamos fatores metodológicos que ajudam na geração de um fenótipo robusto e reproduzível.

Palatável dieta de estilo ocidental cafeteria como um método confiável para modelagem de dieta induzida obesidade em roedores

O acesso à infusão a longo prazo na artéria mesentérica superior (SMA) dos ratos é um procedimento cirúrgico que consiste na cannulação de um ramo proximal da SMA. A cânula sai da ferida abdominal e é encapsulada através do espaço subcutâneo de volta para a dobra interscapular.

Mirando o intestino delgado do rato: infusão de longo prazo na artéria mesentérica superior

Pancreatite crônica (PC) é uma doença caracterizada por inflamação e fibrose do pâncreas, frequentemente associada a dor abdominal intratável. Este artigo se concentra na refinação da técnica para gerar um modelo de camundongo de CP via infusão de ducto biliar com ácido sulfônico de 2,4,6 -trinitrobenzene (TNBS).

Um modelo de rato para pancreatite crônica através da infusão TNBS do ducto biliar

Este trabalho apresenta as respostas morfométricas e os resultados do desempenho no treinamento de um protocolo de treinamento intervalado de alta intensidade (HIIT) em um modelo de obesidade induzida por dieta em ratos Sprague-Dawley. O objetivo deste protocolo foi maximizar a intensidade do exercício e determinar as respostas fisiológicas ao HIIT em ratos magros e obesos.

Um modelo crônico de treinamento intervalado de alta intensidade e obesidade induzida por dieta para maximizar o esforço de exercício e induzir mudanças fisiológicas em ratos

Um modelo de compulsão alimentar foi estabelecido em camundongos usando acesso intermitente a M&amp;M's (um alimento altamente palatável feito de gordura e açúcar). Camundongos com acesso intermitente a esse alimento rico em gordura e açúcar mostraram comportamentos semelhantes ao estresse, aumento da ingestão calórica e preferência por esse alimento em relação à ração padrão em comparação com camundongos com acesso contínuo ou nenhum acesso ao alimento.

Modelo de ingestão periódica intermitente em camundongos

Este protocolo descreve um modelo de transplante intestinal baseado em ratos com ileostomia para avaliação temporal da intervenção medicamentosa na rejeição do enxerto.

Um Modelo de Rejeição de Enxerto de Rato de Transplante Intestinal com Ileostomia Exteriorizada para Avaliação de Prognóstico Longitudinal

Este estudo oferece um método reprodutível e padronizado para estabelecer modelos de ratos obesos que apresentam obesidade simples, comumente caracterizada por pâncreas gorduroso. Também inclui protocolos detalhados para amostragem de tecido pancreático e imuno-histoquímica.

Desenvolvimento e Validação de uma Metodologia para Estabelecimento de Modelos de Ratos Obesos com Pâncreas Gorduroso Típico

Este artigo apresenta um modelo isquêmico de DRC usando IRI renal unilateral com nefrectomia contralateral realizada um dia antes da coleta da amostra; esse protocolo permite avaliação funcional baseada em soro, alta sobrevivência e patologia reprodutível da DRC em 28 e 42 dias, proporcionando uma plataforma versátil para estudos mecanicistas e intervencionistas.

Modelo murino de transição aguda para crônica de doença renal induzida por isquemia/lesão de reperfusão renal

Aprenda a criar um modelo de infusão crónica de nutrientes em ratos para estudar os efeitos do excesso de glicose e lipídios na homeostase da glicose e na função metabólica.

Um Modelo de Infusão Crónica de nutrientes no Rato

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