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Preparação de Amostras Histológicas para Microscopia de Luz

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Histological Sample Preparation for Light Microscopy

1.10: Introduction to the Spectrophotometer

1.12: Introduction to Fluorescence Microscopy

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09:27 min

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April 30, 2023

Overview

Histologia é o estudo de células e tecidos, que normalmente é auxiliado pelo uso de um microscópio leve. A preparação de amostras histológicas pode variar muito de acordo com as propriedades inerentes das amostras, como tamanho e dureza, bem como o pós-processamento esperado, que inclui técnicas planejadas de coloração ou outras aplicações de fluxo baixo. Como descrito neste vídeo, a preparação do espécime normalmente começa com um procedimento de fixação para evitar a degradação da amostra por enzimas de ocorrência natural que são liberadas pelas células após a morte. Uma vez fixadas, as amostras são colocadas em um meio de incorporação capaz de suportar suficientemente a amostra. Mais comumente isso é cera de parafina, mas outros materiais como um meio de congelamento à base de glicerina e ágars também são usados para cercar a amostra durante a secção. A secção ocorre em um microtome ou outro dispositivo de corte que permite ao usuário raspar a amostra em fatias finas que variam de alguns mícrons a alguns milímetros de espessura. Uma vez cortadas, as seções são montadas em um slide de vidro e manchadas para trazer características específicas da amostra antes de serem imagens em um microscópio.

Procedure

Histologia é um termo que se refere ao estudo da anatomia microscópica de tecidos e células. A preparação adequada da amostra histológica para microscopia leve é essencial para obter resultados de qualidade a partir de amostras de tecido.

Existem 3 passos principais comuns a quase todos os procedimentos histológicos. Primeiro, a amostra é fixa, a fim de preservar o tecido e retardar a degradação tecidual. Em seguida, a amostra é imersa em um material, ou incorporando mídia, que tem propriedades mecânicas semelhantes a si mesma. Uma vez incorporada, a amostra é seccionada ou cortada em fatias finas usando uma ferramenta de corte precisa conhecida como microtome. Este vídeo descreve esses passos gerais e alguns dos conceitos que se relacionam com eles.

A fixação tecidual é um passo crítico que preserva os componentes celulares e tecidos e mantém sua estrutura. Após a morte celular, enzimas de ocorrência natural são liberadas de organelas celulares e começam a degradar as proteínas em toda a matriz celular e extracelular, destruindo assim a estrutura da célula. A fixação previne essa degradação inibindo diretamente a capacidade dessas enzimas de digerir proteínas e tornando os sítios de decote enzimáticos irreconhecíveis.

Os dois principais mecanismos de fixação são a ligação cruzada e a coagulação. A ligação cruzada envolve a formação de vínculos covalentes dentro das proteínas e entre elas, o que faz com que o tecido enrijeça e, portanto, resista à degradação. A coagulação é causada pela desidratação das proteínas através do uso de álcoois ou acetona, que deformam a estrutura terciária proteica, de modo que as regiões hidrofóbicas, ou temedoras da água, movam a superfície da proteína. A fixação coagulativa pode ajudar a incorporar mídia, como cera de parafina, penetrar tecido.

Um dos fixativos mais usados é a Formalin, que é formaldeído dissolvido em uma água. Durante a fixação, o formaldeído se liga às aminas primárias, como as encontradas nas cadeias laterais dos aminoácidos lysina e glutamina para formar um crosslink estável chamado ponte methelene. Este processo é inerentemente lento e pode levar até 1-2 dias.

Antes da fixação, algumas considerações devem ser feitas. Primeiro, considere a difusividade da amostra. Os fixativos difundirão uma distância através dos tecidos a uma taxa relacionada ao coeficiente de difusão para o fixador multiplicado pela raiz quadrada do tempo. Um fixador que leva 1 hora para penetrar 1 mm na amostra levará 25 horas para penetrar 5 mm. Uma vez que a formalina tenha atingido o centro do tecido, o peitoril de reação transligada precisa ocorrer. Assim, o tamanho da amostra deve ser limitado a 4 mm de espessura para fixação completa em um período razoável de tempo.

Em segundo lugar, considere o volume e o pH do fixador. A razão fixativa para o volume amostral deve ser de pelo menos 40:1 para que o reagente não seja esgotado facilmente ao longo do tempo. Enquanto alguns fixativos são projetados para trabalhar em um pH ácido, a formalina funciona melhor quando tamponada com fosfato para manter um pH neutro, de modo que o excesso de ácido não é produzido, o que causa artefatos no tecido.

O próximo passo na preparação histológica é a incorporação, que envolve o apoio de espécimes em mídia que tem rigidez mecânica semelhante ao próprio espécime. Escolher o meio de incorporação certo é fundamental, pois se ele é muito rígido ou muito fraco, defeitos podem ocorrer durante a secção. De longe, a mídia mais comum usada para incorporar é cera de parafina.

Antes da incorporação da parafina, as amostras devem ser desidratadas substituindo a água no tecido pelo etanol, primeiro, seguida de xileno, e, finalmente, a cera de parafina aquecida. Uma vez que a cera tenha se infiltrado na amostra, ela é cuidadosamente posicionada e cercada com cera adicional usando um molde para formar um bloco. Em seguida, as amostras são anexadas a um de tecido para secção.

A secção é o processo de corte de fatias finas de uma amostra de um bloco de incorporação. As seções geralmente estão na ordem de 4-10 μm de espessura para uso com microscopia leve.

Para cortar seções, uma lâmina de metal, vidro ou diamante é primeiro presa em um microtome. A amostra é então colocada em um suporte de amostra. Em seguida, a amostra é avançada para a superfície de corte e desenhada através da lâmina para criar uma fatia de espessura desejada. As seções se acumularão como fitas finas que podem ser colocadas em lâminas de vidro.

Após a secção, as amostras são colocadas em slides. Para amostras embutidas de parafina, as fatias são primeiro colocadas em um banho de água aquecida e, em seguida, são levantadas para fora da água para o escorregador e permitidas a secar.

O tecido biológico tem muito pouco contraste inerente, por isso, após a histologia, slides geralmente são manchados com corantes ou anticorpos que destacam a morfologia ou proteínas específicas. A mancha mais comum realizada é hematoxilina e eosina, ou H&E. Por ser tão comum, muitas máquinas automatizadas foram feitas para manchar de forma reprodutificada inúmeras seções com h&E. Hematoxylin mancha os núcleos das células azuis e eosina mancha o citoplasma rosa revelando morfologia celular dos tecidos.

Uma desvantagem para a fixação é que a ligação cruzada de proteínas pode torná-lo mais para rotular anticorpos para encontrar seus locais de ligação. Em vez de usar a fixação para preservar amostras, pode-se usar o congelamento rápido do tecido ou o congelamento de encaixes, que é seguido por uma técnica de secção chamada cryosectioning

As amostras de tecido são incorporadas e orientadas em uma mídia especial de congelamento chamada OCT, ou meio de temperatura de corte ideal e, em seguida, rapidamente congelado. Como outros meios de comunicação, o OCT corresponde à rigidez da amostra.

Um criomicrotome ou criostat, é usado para cortar seções congeladas e este instrumento mantém uma temperatura interna de -20°C para manter a lâmina de corte e as amostras frias. Em contraste com as seções embutidas em parafina, as seções congeladas podem ser diretamente levantadas em um slide de vidro carregado positivamente imediatamente após a secção.

Outra maneira de evitar a fixação é através da incorporação de ágar, na qual as amostras são cobertas com agarose líquida recém-preparada. À medida que a agarose esfria, ele bloqueia o tecido no lugar e o excesso de agarose pode ser cortado.

Vibrotomes, outra alternativa ao microtome, têm uma lâmina que vibra e se move através da amostra incorporada à agarose. Vibrotomes são usados para criar seções grossas na ordem de 50-1000 μm de amostras incorporadas agarose.

As amostras são tipicamente removidas da agarose antes da coloração , e depois colocadas em um slide cercado por uma substância como graxa de vácuo que impede o deslizamento de cobertura de esmagar a amostra. Eles são melhor vistos usando microscopia confocal, a fim de obter imagens de alta resolução de cada seção grossa.

Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre a preparação de amostras histológicas para microscopia leve.

Agora você deve entender os passos envolvidos para a preparação da amostra para levá-lo de um pedaço de tecido para uma seção colorável. Como sempre, obrigado por assistir!

Transcript

Histology is a term that refers to the study of the microscopic anatomy of tissues and cells. Proper histological sample preparation for light microscopy is essential for obtaining quality results from tissue samples.

There are 3 main steps common to nearly all histological procedures. First, the sample is fixed, in order to preserve the tissue and slow down tissue degradation. Next, the sample is immersed in a material, or embedding media, that has similar mechanical properties to itself. Once embedded, the sample is sectioned, or cut, into thin slices using a precise cutting tool known as a microtome. This video describes these general steps and some of the concepts that relate to them.

Tissue fixation is a critical step that preserves cell and tissue components and maintains their structure. Following cell death, naturally occurring enzymes are released from cellular organelles and begin to degrade the proteins throughout the cell and extracellular matrix, thereby destroying the structure of the cell. Fixation prevents such degradation by directly inhibiting the ability of these enzymes digest protein and by making the enzyme cleavage sites unrecognizable.

The two main mechanisms of fixation are cross-linking and coagulation. Cross-linking involves covalent bond formation both within proteins and between them, which causes tissue to stiffen and therefore resist degradation. Coagulation is caused by the dehydration of proteins through the use of alcohols or acetone, which deform protein tertiary structure, so that hydrophobic, or water fearing, regions move the protein surface. Coagulative fixation can help embedding media, like paraffin wax, penetrate tissue.

One of the most commonly-used fixatives is Formalin, which is formaldehyde dissolved in a water. During fixation, formaldehyde attaches to primary amines, such as those found on the side chains of the amino acids lysine and glutamine to form a stable crosslink called a methelene bridge. This process is inherently slow and can take up to 1-2 days.

Prior to fixation a few considerations should be made. First, consider the diffusivity of the sample. Fixatives will diffuse a distance through tissues at a rate related to the coefficient of diffusion for the fixative multiplied by the square root of time. A fixative that takes 1 hour to penetrate 1 mm into the sample will take 25 hours to penetrate 5 mm. Once formalin has reached the center of the tissue, the crosslinking reaction sill needs to occur. Thus, sample size should be limited to 4 mm in thickness for thorough fixation in a reasonable amount of time.

Second, consider the volume and pH of the fixative. The fixative to sample volume ratio should be at least 40:1 so that the reagent is not depleted easily over time. While some fixatives are designed to work at an acidic pH, formalin works best when buffered with phosphate to maintain a neutral pH, so that excess acid is not produced, which causes artifacts in tissue.

The next step in histological preparation is embedding, which involves supporting specimens in media that has similar mechanical rigidity to the specimen itself. Choosing the right embedding medium is critical, because if it is too stiff or too weak, defects may occur while sectioning. By far, the most common media used for embedding is paraffin wax.

Prior to paraffin-embedding, samples must be dehydrated by replacing the water in the tissue with ethanol, first, followed by xylenes, and then finally warmed paraffin wax. Once wax has infiltrated the sample, it is carefully positioned and surrounded with additional wax using a mould to form a block. Next, samples are attached to a tissue cassette for sectioning.

Sectioning is the process of cutting thin slices of a sample from an embedding block. The sections are usually on the order of 4-10 µm thick for use with light microscopy.

To cut sections, a metal, glass, or diamond blade is first secured on a microtome. The sample is then placed in a sample holder. Next, the sample is advanced to the cutting surface and drawn across the blade to create a slice of desired thickness. Sections will amass as thin ribbons which can be placed on glass slides.

Following sectioning, samples are placed on slides. For paraffin embedded samples, slices are first placed into a warmed water bath and are then lifted out of the water onto the slide and allowed to dry.

Biological tissue has very little inherent contrast, so after histology, slides are usually stained with dyes or antibodies that highlight morphology or specific proteins. The most common stain performed is hematoxylin and eosin, or H&E. Because it is so common, many automated machines have been made to reproducibly stain numerous sections with H&E. Hematoxylin stains the nuclei of cells blue and eosin stains the cytoplasm pink revealing cellular morphology of tissues.

One drawback to fixation is that the cross-linking of proteins can make it more for labeling antibodies to find their binding sites. Rather than using fixation to preserve samples, rapid freezing of tissue, or snap freezing can be used, which is followed by a sectioning technique called cryosectioning

Tissue samples are embedded and oriented in a special freezing media called OCT, or optimal cutting temperature medium and then rapidly frozen. Like other embedding media, OCT matches the rigidity of the sample.

A cryomicrotome or cryostat, is used to cut frozen sections and this instrument maintains an internal temperature of -20°C to keep the cutting blade and samples cool. In contrast to paraffin-embedded sections, frozen sections can be directly lifted onto a positively charged glass slide immediately after sectioning.

Another way to avoid fixation is via agar embedding, in which samples are covered with freshly prepared liquid agarose. As the agarose cools, it locks the tissue into place and excess agarose can be trimmed away.

Vibrotomes, another alternative to the microtome, have a blade that vibrates and moves across the agarose-embedded sample.Vibrotomes are used to create thick sections on the order of 50-1000 µm from agarose embedded samples.

Samples are typically removed from the agarose before staining , and then placed onto a slide surrounded by a substance such as vacuum grease that keeps the coverslip from squishing the sample. They are best viewed using confocal microscopy in order to obtain high resolution images of each thick section.

You’ve just watched JoVE’s video on histological sample preparation for light microscopy.

You should now understand the steps involved for sample preparation to get you from a piece of tissue to a stainable section. As always, thanks for watching!

Tags

Histological Sample Preparation Light Microscopy Histology Fixing Embedding Media Microtome Sectioning Cell Degradation Enzymes Protein Degradation Cross-linking Coagulation Protein Dehydration