Preparação de Amostras Histológicas para Microscopia de Luz

Histologia é um termo que se refere ao estudo da anatomia microscópica de tecidos e células. A preparação adequada da amostra histológica para microscopia leve é essencial para obter resultados de qualidade a partir de amostras de tecido.

Existem 3 passos principais comuns a quase todos os procedimentos histológicos. Primeiro, a amostra é fixa, a fim de preservar o tecido e retardar a degradação tecidual. Em seguida, a amostra é imersa em um material, ou incorporando mídia, que tem propriedades mecânicas semelhantes a si mesma. Uma vez incorporada, a amostra é seccionada ou cortada em fatias finas usando uma ferramenta de corte precisa conhecida como microtome. Este vídeo descreve esses passos gerais e alguns dos conceitos que se relacionam com eles.

A fixação tecidual é um passo crítico que preserva os componentes celulares e tecidos e mantém sua estrutura. Após a morte celular, enzimas de ocorrência natural são liberadas de organelas celulares e começam a degradar as proteínas em toda a matriz celular e extracelular, destruindo assim a estrutura da célula. A fixação previne essa degradação inibindo diretamente a capacidade dessas enzimas de digerir proteínas e tornando os sítios de decote enzimáticos irreconhecíveis.

Os dois principais mecanismos de fixação são a ligação cruzada e a coagulação. A ligação cruzada envolve a formação de vínculos covalentes dentro das proteínas e entre elas, o que faz com que o tecido enrijeça e, portanto, resista à degradação. A coagulação é causada pela desidratação das proteínas através do uso de álcoois ou acetona, que deformam a estrutura terciária proteica, de modo que as regiões hidrofóbicas, ou temedoras da água, movam a superfície da proteína. A fixação coagulativa pode ajudar a incorporar mídia, como cera de parafina, penetrar tecido.

Um dos fixativos mais usados é a Formalin, que é formaldeído dissolvido em uma água. Durante a fixação, o formaldeído se liga às aminas primárias, como as encontradas nas cadeias laterais dos aminoácidos lysina e glutamina para formar um crosslink estável chamado ponte methelene. Este processo é inerentemente lento e pode levar até 1-2 dias.

Antes da fixação, algumas considerações devem ser feitas. Primeiro, considere a difusividade da amostra. Os fixativos difundirão uma distância através dos tecidos a uma taxa relacionada ao coeficiente de difusão para o fixador multiplicado pela raiz quadrada do tempo. Um fixador que leva 1 hora para penetrar 1 mm na amostra levará 25 horas para penetrar 5 mm. Uma vez que a formalina tenha atingido o centro do tecido, o peitoril de reação transligada precisa ocorrer. Assim, o tamanho da amostra deve ser limitado a 4 mm de espessura para fixação completa em um período razoável de tempo.

Em segundo lugar, considere o volume e o pH do fixador. A razão fixativa para o volume amostral deve ser de pelo menos 40:1 para que o reagente não seja esgotado facilmente ao longo do tempo. Enquanto alguns fixativos são projetados para trabalhar em um pH ácido, a formalina funciona melhor quando tamponada com fosfato para manter um pH neutro, de modo que o excesso de ácido não é produzido, o que causa artefatos no tecido.

O próximo passo na preparação histológica é a incorporação, que envolve o apoio de espécimes em mídia que tem rigidez mecânica semelhante ao próprio espécime. Escolher o meio de incorporação certo é fundamental, pois se ele é muito rígido ou muito fraco, defeitos podem ocorrer durante a secção. De longe, a mídia mais comum usada para incorporar é cera de parafina.

Antes da incorporação da parafina, as amostras devem ser desidratadas substituindo a água no tecido pelo etanol, primeiro, seguida de xileno, e, finalmente, a cera de parafina aquecida. Uma vez que a cera tenha se infiltrado na amostra, ela é cuidadosamente posicionada e cercada com cera adicional usando um molde para formar um bloco. Em seguida, as amostras são anexadas a um de tecido para secção.

A secção é o processo de corte de fatias finas de uma amostra de um bloco de incorporação. As seções geralmente estão na ordem de 4-10 μm de espessura para uso com microscopia leve.

Para cortar seções, uma lâmina de metal, vidro ou diamante é primeiro presa em um microtome. A amostra é então colocada em um suporte de amostra. Em seguida, a amostra é avançada para a superfície de corte e desenhada através da lâmina para criar uma fatia de espessura desejada. As seções se acumularão como fitas finas que podem ser colocadas em lâminas de vidro.

Após a secção, as amostras são colocadas em slides. Para amostras embutidas de parafina, as fatias são primeiro colocadas em um banho de água aquecida e, em seguida, são levantadas para fora da água para o escorregador e permitidas a secar.

O tecido biológico tem muito pouco contraste inerente, por isso, após a histologia, slides geralmente são manchados com corantes ou anticorpos que destacam a morfologia ou proteínas específicas. A mancha mais comum realizada é hematoxilina e eosina, ou H&E. Por ser tão comum, muitas máquinas automatizadas foram feitas para manchar de forma reprodutificada inúmeras seções com h&E. Hematoxylin mancha os núcleos das células azuis e eosina mancha o citoplasma rosa revelando morfologia celular dos tecidos.

Uma desvantagem para a fixação é que a ligação cruzada de proteínas pode torná-lo mais para rotular anticorpos para encontrar seus locais de ligação. Em vez de usar a fixação para preservar amostras, pode-se usar o congelamento rápido do tecido ou o congelamento de encaixes, que é seguido por uma técnica de secção chamada cryosectioning

As amostras de tecido são incorporadas e orientadas em uma mídia especial de congelamento chamada OCT, ou meio de temperatura de corte ideal e, em seguida, rapidamente congelado. Como outros meios de comunicação, o OCT corresponde à rigidez da amostra.

Um criomicrotome ou criostat, é usado para cortar seções congeladas e este instrumento mantém uma temperatura interna de -20°C para manter a lâmina de corte e as amostras frias. Em contraste com as seções embutidas em parafina, as seções congeladas podem ser diretamente levantadas em um slide de vidro carregado positivamente imediatamente após a secção.

Outra maneira de evitar a fixação é através da incorporação de ágar, na qual as amostras são cobertas com agarose líquida recém-preparada. À medida que a agarose esfria, ele bloqueia o tecido no lugar e o excesso de agarose pode ser cortado.

Vibrotomes, outra alternativa ao microtome, têm uma lâmina que vibra e se move através da amostra incorporada à agarose. Vibrotomes são usados para criar seções grossas na ordem de 50-1000 μm de amostras incorporadas agarose.

As amostras são tipicamente removidas da agarose antes da coloração , e depois colocadas em um slide cercado por uma substância como graxa de vácuo que impede o deslizamento de cobertura de esmagar a amostra. Eles são melhor vistos usando microscopia confocal, a fim de obter imagens de alta resolução de cada seção grossa.

Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre a preparação de amostras histológicas para microscopia leve.

Agora você deve entender os passos envolvidos para a preparação da amostra para levá-lo de um pedaço de tecido para uma seção colorável. Como sempre, obrigado por assistir!