Protocolos para implementação de uma Escherichia coli Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

O objetivo geral deste procedimento é criar um sistema de expressão livre de células baseado em E. coli, conhecido como tradução de transcrição ou TX tl. Isso é feito primeiro fazendo três componentes iniciais para extrato de células brutas TX TL, solução de aminoácidos e solução energética. A solução de aminoácidos e a solução de energia serão posteriormente combinadas para formar o tampão TX TL.

O segundo passo é calibrar o extrato de células brutas para determinar as concentrações ideais de magnésio, potássio e DTT para produzir reações TX TL com níveis máximos de expressão. Em seguida, os resultados da calibração são usados para fazer um sistema TX TL de três tubos feito de extrato de célula bruta tampão e DNA. A etapa final é executar uma reação TX TL usando os reagentes que acabamos de fazer.

Em última análise, o TX TL é usado para demonstrar circuitos de biologia sintética, bem como aplicações tradicionais de expressão livre de células. Este método pode ajudar a testar circuitos no campo da biologia sintética, fornecendo um ambiente in vitro igual, que emula o in vivo. As implicações dessa técnica se estendem ao aumento da velocidade do design biológico sintético, eliminando a necessidade de realizar todas as etapas de prototipagem in vivo.

Auxiliando em um procedimento estará Claire Hayes, assistente de pesquisa em nosso grupo. Observe que este vídeo passará apenas por seções selecionadas do protocolo críticas para as filmagens. O protocolo completo está disponível com o artigo de texto.

No início deste protocolo, as células bacterianas foram cultivadas e peletizadas. Agora as células bacterianas serão lisadas usando um batedor de contas. Mantenha todos os tubos de falcão de 50 mililitros contendo suspensão celular no gelo.

Para os fins deste vídeo, o beading de contas será demonstrado para apenas um tubo. As contas devem ser adicionadas intermitentemente ao tubo Falcon em três alíquotas, cada uma usando um terço do total de contas. Adicione a primeira alíquota de contas ao vórtice do tubo por 30 segundos e coloque no gelo.

Da mesma forma, adicione a segunda alíquota de miçangas, vórtice e coloque no gelo. Depois de adicionar a última alíquota e o vórtice, certifique-se de que as contas estejam uniformemente distribuídas, uma pasta espessa deve ser formada após a terceira etapa do vórtice. Coloque o tubo no gelo.

Prepare uma ponta de pipeta de volume de cinco mililitros usando uma tesoura estéril para cortar a extremidade. Para criar uma abertura de três a quatro milímetros, disque a pipeta para dois mililitros. Coloque 20 tubos de contas estéreis no gelo.

Use a pipeta modificada para verificar a alta viscosidade da solução de células de esfera. Deve ser viscoso a ponto de mal sair da ponta da pipeta. Durante a ejeção, remova a solução de célula de grânulo do tubo Falcon e transfira para um tubo de grânulo.

Enchendo-o três quartos de centrifugação extremamente breve em uma mini centrífuga. Para remover bolhas de ar sem redistribuir as contas, termine de adicionar uma solução de célula de esferas ao tubo para formar um menisco côncavo. Em seguida, adicione uma gota muito pequena de solução de célula de grânulo no interior de uma tampa de tubo de grânulos.

Tenha cuidado para não colocar solução na borda externa da tampa. Caso contrário, o tubo de contas não fechará o suficiente. Bata a tampa em uma superfície plana e verifique se não há bolhas de ar na parte inferior da tampa.

Tampe o tubo de batida de contas. Se feito corretamente, a tampa deve ser bem fechada. Nenhuma bolha de ar deve ser visível e pouca ou nenhuma solução de célula de grânulo deve transbordar daqui em diante, duas pessoas são necessárias para realizar o beading do grânulo com eficiência.

Entregue o tubo cheio a um assistente para beading enquanto o primeiro demonstrador continua a encher mais tubos de beading com a solução de célula de bead restante. Pegue o tubo de contas cheio e coloque-o no gelo. Uma vez que dois tubos de contas cheias tenham sido coletados e estejam no gelo por pelo menos um minuto.

Comece a fazer o cordão em um tubo por 30 segundos a 46 RPM. Coloque de cabeça para baixo no gelo por 30 segundos enquanto bate o outro tubo. Repita o friso e o glacê de modo que cada tubo de miçangas cheio seja batido por um total de um minuto.

Depois que todos os tubos de contas preenchidos forem processados, construa um aparelho de filtro a partir de um tubo de falcão de 15 mililitros. Primeiro, adicione uma nova parte plana da tampa de contas voltada para cima na parte inferior do tubo. Em seguida, remova a tampa de um tubo de contas processado e pressione uma coluna de microcromatografia firmemente na extremidade do tubo de contas processado até que esteja completamente selada.

Retire a extremidade eluciana da coluna de microcromatografia e coloque-a eluciana. Termine em um tubo vazio de contas. Coloque este complexo no tubo de falcão de 15 mililitros.

Construa os aparelhos de filtro para todos os tubos de batimento de esferas cheios e mantenha-os no gelo. Quando a centrífuga completa, os aparelhos de filtro Tubo Falcon destampado a 6.000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius para separar o extrato e o pellet dos grânulos. Após a centrifugação, verifique se cada tubo de contas produziu um extrato viável.

O extrato devidamente batido não ficará turvo e o pellet terá duas camadas distintas, conforme ilustrado pelo tubo à esquerda. Tubos turvos, como mostrado no exemplo à direita, devem ser descartados. Transfira o sobrenadante dos tubos não turídeos para tubos individuais de microcentrífuga de 1,75 mililitros, tomando o mínimo de pellets possível.

Mantenha no gelo até que todos os tubos de contas tenham sido processados. Em seguida, gire os tubos da microcentrífuga e colete o sobrenadante. Depois de consolidar 500 microlitros de sobrenadante livre de pellets em um novo tubo de beading.

Incube os tubos com as tampas removidas a 220 RPM e 37 graus Celsius por 80 minutos. Isso digerirá os ácidos nucléicos restantes usando a exonuclease endógena liberada durante o processo de beading. Quando a incubação estiver completa, o extrato deve parecer turvo.

Consolide o extrato em tubos de microcentrífuga de 1,75 mililitro até 1,5 mililitros por centrífuga de tubo a 12.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Usando uma pipeta, consolide o sobrenadante livre de pellets em um tubo de microcentrífuga de 1,75 mililitro para rendimentos menores ou um tubo de falcão de 15 mililitros para rendimentos maiores no gelo. Tampe o tubo e misture bem invertendo.

Guarde 10 microlitros de sobrenadante no gelo para posterior medição da concentração de proteínas. Determinar a quantidade total de extracto produzido e hidratar o número necessário de de diálise de corte de 10 massas moleculares por imersão em tampão S 30 B durante dois minutos. Carregue com até 2,5 mililitros de extrato.

Cada béquer pode levar até dois dialisar mexendo a quatro graus Celsius por três horas. Consulte o artigo escrito para obter as etapas de processamento após a diálise. Uma reação básica de tradução de transcrição tem três partes, extrato de células brutas, tampão e DNA.

Embora as reações possam variar em volume, este protocolo utiliza um modelo pré-escrito para realizar uma reação de 10 microlitros. Aqui. Os itens em roxo indicam os valores de entrada do usuário e os itens em azul indicam reagentes adicionais para adicionar ao projeto de reação o experimento em sili usando a seção de preparação da mistura principal e a seção de preparação de DNA. Geralmente, as constantes podem ser colocadas na seção de preparação da mistura principal, enquanto as variáveis podem ser colocadas na seção de preparação do DNA.

Minimize as amostras por experimento para evitar a evaporação da amostra e o viés do tempo de início experimental. Uma configuração de exemplo é mostrada nesta tabela. Para preparar amostras de DNA para cada amostra, identifique a alíquota da água de DNA indicada e os itens fornecidos pelo usuário em um tubo de microcentrífuga.

À temperatura ambiente, prepare a mistura principal que consiste em extrato tampão e quaisquer itens fornecidos pelo usuário global mantidos no gelo e no vórtice. Após a adição de cada item, adicione a quantidade apropriada de master mix a cada amostra de DNA e mantenha em temperatura ambiente. Trate isso como o tempo de início da reação.

Vortex cada amostra e centrifugue a 10.000 G por 30 segundos à temperatura ambiente para derrubar qualquer amostra residual e reduzir as bolhas. Execute a reação em uma placa de 384 poços a 29 graus Celsius. Os tempos de execução variam dependendo do experimento, mas geralmente duram menos de oito horas.

Na conclusão da execução, os dados podem ser lidos a partir de um leitor de placas. Este artigo apresenta um protocolo de cinco dias para a preparação de um sistema endógeno de tradução de transcrição baseado em e coli ou sistema de expressão livre de células TXTL. As condições de expressão deste sistema foram otimizadas através do teste dos efeitos de diferentes métodos de processamento de plasmídeos e do tampão eluciano.

Certas variáveis introduzidas no sistema TXTL devem ser calibradas de antemão quanto à toxicidade, por exemplo, na comparação dos métodos de processamento de plasmídeo, o método de purificação um usa apenas um kit de preparação kaya prep spin, enquanto no método de purificação dois, o plasmídeo é preparado usando o mesmo mini kit de preparação e, em seguida, pós-processamento com um caiaque. Kit de purificação PCR rápida. Este gráfico mostra a fluorescência final após oito horas, bem como a taxa máxima de produção de proteínas com base em uma média móvel de 12 minutos As barras de erro são um desvio padrão de quatro execuções independentes em dias diferentes.

A diferença na expressão observada deve-se à diferença no teor de sal. No entanto, outros itens podem não mostrar efeito no TXTL, como buffer eluciano. Diferentes concentrações de cloreto de TS foram comparadas em uma reação de expressão livre de células baseada na expressão de um molar anual de plasmídeo.

As concentrações indicadas são concentrações finais de cloreto de tris. Na reação, o tampão eluciano usado é de 10 milimolares, as barras de erro de cloreto de tris são um desvio padrão de três execuções independentes em dias diferentes. Esta figura mostra gráficos de calibração típicos para extrato de células brutas, calibrados para níveis adicionais de glutamato de magnésio, glutamato de potássio e TDT.

A fluorescência final após oito horas, bem como a taxa máxima de produção de proteínas com base em uma média móvel de 12 minutos, são mostradas. Observe que cada extrato de célula bruta precisa ser calibrado independentemente para essas três variáveis. Em geral, os resultados indicam que o extrato de células brutas é mais sensível aos níveis de glutamato de magnésio, seguido pelos níveis de glutamato de potássio.

Com base nesses gráficos, uma faixa aceitável de glutamato de magnésio adicional é de quatro milimolares, o glutamato de potássio é de 60 a 80 milimolares e o DTT é de zero a três milimolares de aeração no lado inferior. A eficiência final de cada preparação de extrato de célula bruta pode variar de acordo com a proficiência do usuário e as condições ambientais. Embora a variação típica do rendimento esteja entre cinco e 10%, a fluorescência final de dois extratos brutos preparados em datas diferentes é mostrada aqui.

As barras de erro são um desvio padrão de três execuções independentes em dias diferentes. Para demonstrar o sistema de expressão livre de células, um loop de feedback negativo baseado na repressão de Tet foi construído e testado o mesmo circuito executado com e sem um TC mostrou uma expressão de ponto final sétupla. Alteração do relator D-E-G-F-P após oito horas de expressão as barras de erro são um desvio padrão de três execuções independentes em dias diferentes.

O circuito genético é mostrado na inserção. Esta figura final descreve a análise de custo e expressão de extratos de células brutas concorrentes. O gráfico de pizza em um divide os custos de mão de obra e materiais do sistema de expressão livre de células TX TL com base nos custos de reagentes em dezembro de 2012 e custos de mão de obra de 14 por hora.

O Painel B compara os custos do sistema de expressão livre de células TX com outros sistemas comerciais. Os custos são divididos por microlitro, embora os volumes de reação possam variar por kit. Os custos de material para este sistema são de cerca de 3 centavos por reação de microlitro, o que representa uma redução de custo de 98% em comparação com sistemas comerciais comparáveis sem células.

O painel C mostra uma comparação do rendimento do sistema de expressão livre de células TX TL versus outros sistemas comerciais. Este sistema pode produzir até 0,75 miligramas por mililitro de proteína repórter usando um promotor baseado em Sigma 70 com operadores de fagos Lambda ou um promotor acionado por T sete. Essas comparações indicam que o sistema de expressão livre de células TX TL pode produzir quantidades equivalentes de proteína, pois os sistemas baseados em T seven adicionam uma tremenda redução de custo a sistemas comerciais semelhantes.

Esperamos que esta técnica abra caminho para simplificar o processo de engenharia em biologia sintética.