A funcionalização assistida por microondas, de poli (etileno glicol) e Peptídeos On-resina para uso em Polimerizações cadeia e formação de hidrogel

Este vídeo é ilustrar um método rápido, eficiente para metacrilato de poli (etileno-glicol), permitindo que as polimerizações de cadeia e síntese de hidrogel. Ele vai demonstrar como a introdução de funcionalidades semelhante metacrilamida em peptídeos, detalhe métodos analíticos comuns para avaliar a eficiência de funcionalização, fornecer sugestões para a solução de problemas e modificações avançadas, e demonstrar técnicas típicas de caracterização hidrogel.

O objetivo geral deste procedimento é funcionalizar polietilenoglicol e peptídeos com grupos de acrilato de metanfetamina para polimerizações de cadeia subsequentes e síntese de hidrogel. Isso é feito combinando primeiro o anidrido acrílico de metanfetamina e o precursor funcionalizado da ONU em um frasco de cintilação. O segundo passo é usar a energia de microondas para funcionalizar o pino ou peptídeo.

Em seguida, o PEG DM é dissolvido em clorometano ou o peptídeo é clivado da resina. E todos os grupos protetores de cadeia lateral são removidos em um coquetel à base de ácido. A etapa final é precipitar o PEG DM ou peptídeo funcionalizado de metanfetamina acrilamida em éter.

Em última análise, a RMN de prótons ou a espectrometria de massa de tempo de voo de Maldi é usada para mostrar a funcionalização bem-sucedida do pino ou macro peptídico. Olá, meu nome é Amy Van Hove. Sou estudante de doutorado no departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Rochester.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a reação de PEG com fluoreto de metanfetamina e acrílico, é que a reação é significativamente mais rápida e ecologicamente correta. Olá, meu nome é Brandon Wilson. Sou graduado em engenharia química pela Universidade de Rochester.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos biomateriais, como a forma como os hidrogéis produzidos usando peg dimetil podem ser empregados para controlar a entrega de células terapêuticas nas moléculas. Olá, sou Danielle Benoit, professora assistente do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Rochester. As implicações dessa técnica são para o desenvolvimento de terapias para uma variedade de doenças, pois os compostos sintetizados podem ser usados para aplicações de entrega de células e medicamentos.

Antes de iniciar este procedimento, seque os copos necessários em um forno por uma hora para evitar a contaminação com água em um grande barco de soro de leite. Saída de cinco gramas de peg com um peso molecular entre 1000 e 100.000 daltons. Se houver, remova o pedaço de plástico da tampa de um frasco para injetáveis de cintilação na capa química.

Dispense 10 molares em excesso de anidrido acrílico de metanfetamina em um frasco de cintilação rasgado. Em seguida, adicione PEG ao frasco. Em seguida, gire a tampa no frasco e coloque o frasco no micro-ondas.

Defina o micro-ondas para cinco minutos na potência máxima usando luvas resistentes ao calor. Retire o frasco do micro-ondas a cada 30 segundos. Em seguida, aperte totalmente a tampa e vortex a amostra por 30 segundos.

Afrouxe a tampa antes de colocar o frasco no micro-ondas. Repita essas etapas até que a solução tenha sido colocada no micro-ondas por cinco minutos completos. Depois de remover o frasco do micro-ondas, solte a tampa e deixe o PEG DM esfriar até a temperatura ambiente.

Em seguida, dissolva o PEG DM em 10 a 15 mililitros de di clorometano. Precipitar o PEG MS em 10 x excesso de éter pré-datilílico durante 20 minutos. Usando um funil de Buckner de sete centímetros e um balão de 500 mililitros.

Colete o PEG DM por filtração a vácuo. Em seguida, transfira o PEG DM filtrado para um tubo cônico de 50 mililitros com uma agulha de calibre grande perfurada na tampa para ventilação. Coloque o tubo em uma câmara de vácuo e seque o PEG DM durante a noite.

Depois de remover o tubo da câmara de vácuo, dissolva o PEG DM em precipitado de clorometano DI com éter datil gelado. Para remover o anidrido acrílico de metanfetamina não reativo após filtração e coleta, seque o PEG DM em uma câmara de vácuo da mesma maneira que antes. Para análise de RMN de prótons, coloque aproximadamente 10 miligramas de PEG DM em um frasco de cintilação e adicione aproximadamente um mililitro de clorofórmio deuterado.

Assim que a amostra estiver dissolvida, transfira-a para um tubo de RMN limpo. Em seguida, colete os espectros de RMN de prótons e execute as amostras em temperatura ambiente por pelo menos 64 varreduras para obter resolução de dados suficiente. Depois de sintetizar o peptídeo de interesse por síntese em fase sólida, armazene-o na resina em DMF a quatro graus Celsius até que esteja pronto para uso.

Em seguida, colete a resina peptídica por filtração usando um funil de buckner de sete centímetros com papel de filtro e um balão de 250 mililitros. Remova o pedaço de plástico da tampa de um frasco de cintilação e transfira a resina para o frasco. Usando uma pipeta descartável, adicione anidrido acrílico de metanfetamina apenas o suficiente para cobrir a resina Depois de girar frouxamente a tampa no frasco, coloque-o no micro-ondas e ajuste o cronômetro para três minutos.

Na potência máxima usando luvas resistentes ao calor, remova o frasco do micro-ondas a cada 15 a 20 segundos. Depois de apertar totalmente a tampa, vortex a amostra por 15 segundos. Afrouxe a tampa antes de colocar o frasco no micro-ondas.

Repita até que a solução tenha sido colocada no micro-ondas por três minutos completos. Com a tampa do frasco afrouxada, deixe a solução peptídica esfriar até a temperatura ambiente usando uma pequena quantidade de DMF e um funil de buckner de sete centímetros. Com papel de filtro e um balão de 250 mililitros.

Colete a resina peptídica do frasco para clivagem e proteção profunda. Transfira a resina peptídica para um frasco de cintilação fresco para 0,25 milimoles de arginina contendo peptídeo. Adicione 0,25 mililitros de propileno tri ISO, três seis dióxidos, um diol tiol de oito octanas, água deionizada e 18,0 mililitros de TFA.

Em seguida, gire a mistura de reação em um rotador de terremoto de laboratório por quatro horas em temperatura ambiente. Quando terminar, precipite o peptídeo em 10 x excesso de éter etílico pré-resfriado. Divida a solução uniformemente entre quatro tubos cónicos de 50 ml, centrifugue as quatro amostras a 3 200 g durante 10 minutos para recolher o péptido após centrifugação, transvase o éter e ressuspenda o péptido em 100 mililitros de éter etílico fresco dividido entre dois tubos cónicos de 50 ml.

Repita o processo de centrifugação. Resus suspendendo o peptídeo em 50 mililitros de éter fresco duas vezes para um total de quatro lavagens de éter após a última etapa de centrifugação, decanta o éter residual e seca o peptídeo durante a noite sob vácuo. Para preparar a amostra para a análise do tempo de voo de Maldi, coloque um a dois miligramas do peptídeo em um tubo einor de 1,5 mililitro e dissolva a amostra em um mililitro de solvente maldi.

Em seguida, preparar uma solução de matriz de 10 miligramas por mililitro de ácido hidroxicerâmico Alpha Sano quatro no solvente multis. Combine as soluções de peptídeos e matrizes em uma proporção de um para um, coloque um microlitro da solução combinada em três locais separados na placa de amostra MALDI. Seque as manchas usando uma pistola de ar quente.

Em seguida, reposicione e seque cada amostra. Finalmente, colete os dados de tempo de voo MALDI e confirme um aumento de 68 gramas por mol no peso molecular devido à adição do grupo metanfetamina acrilamida ao terminal final do peptídeo. Aqui é mostrado o espectro de RMN de um PEG DM linear de dois quilodalton funcionalizado usando o método assistido por micro-ondas para esta reação.

A análise de RMN de prótons pode ser usada para calcular a porcentagem de funcionalização da razão observada para teórica dos prótons terminais de metacrilato para os prótons PEG centrais. A funcionalização percentual geral é de 91% e este PEG DM é adequadamente funcionalizado para uso na síntese de hidrogel. Consulte o protocolo de texto para obter detalhes sobre como calcular a porcentagem de funcionalização devido à multiplicidade de picos de prótons que surgem na análise de RMN de prótons de peptídeos peptídicos.

A funcionalização do peptídeo é mais facilmente investigada usando espectrometria de massa de tempo de voo maldi. Isso é demonstrado aqui onde o peptídeo G-K-R-G-D-S-G foi sintetizado e submetido à funcionalização da acrilamida de metanfetamina, uma pequena fração do peptídeo foi clivada para avaliação do peso molecular de pré-funcionalização, que mostrou o pico de peso molecular observado ocorrendo em 676 gramas por mol, o peso molecular esperado do peptídeo, o restante do peptídeo sofreu funcionalização de acrilamida de metanfetamina antes da clivagem após a funcionalização da acrilamida de metanfetamina. O pico de peso molecular observado ocorre em 744 gramas por mol, o peso esperado do peptídeo funcionalizado de metanfetamina acrilamida.

Para demonstrar a funcionalidade tanto do PEG DM quanto dos peptídeos funcionalizados de metanfetamina-acrilamida, hidrogéis de PEG foram produzidos com e sem metanfetamina 0,5 milimolar. GK R-G-D-S-G funcionalizado com acrilamida mostrados aqui são imagens representativas de contraste de fase e fluorescentes de mortos vivos de MSCs em géis de peg sozinhos e em géis de peg contendo o peptídeo funcionalizado com metanfetamina. As MSCs não conseguiram aderir aos hidrogéis de pinos funcionalizados pela ONU, mas após a inclusão do peptídeo de adesão celular RGD, elas foram capazes de aderir e se espalhar na superfície do hidrogel.

As imagens de mortos-vivos não representam a viabilidade da população de MSC semeada. Em vez disso, as imagens fluorescentes destinam-se a demarcar entre células de aderência e pequenas variações na topologia do hidrogel, o que pode ser difícil apenas sob contraste de fase. Curiosamente, as células não espalhadas semeadas nos géis PEG apenas coram positivo para o cálcio AM e o homodímero AUM, indicando que as células estavam morrendo no momento da imagem.

Uma das muitas vantagens dos hidrogéis PEG é sua natureza altamente ajustável, modificando a composição específica do pino. O hidrogel oferece aos pesquisadores um alto grau de controle sobre propriedades como módulo de elasticidade, conforme ilustrado aqui. Tanto o peso molecular do PEG quanto a porcentagem de peso são conhecidos por controlar o tamanho da malha do hidrogel, o hidrogel resultante, a rigidez e a taxa de liberação de medicamentos encapsulados.

Isso foi demonstrado produzindo hidrogéis com peso molecular variável PEG dm e investigando o módulo de hidrogel resultante e o tamanho da malha, conforme hipotetizado, aumentando o peso molecular do pino. Macer causou um aumento no tamanho da malha de hidrogel e uma diminuição na rigidez do hidrogel, o tamanho da malha de hidrogel e a rigidez do gel resultante também podem ser controlados alterando o peso. A porcentagem de hidrogéis de PEG foi produzida com peso variável.

A porcentagem de PEG DM linear de 10 kilodalton e a rigidez do hidrogel e o tamanho da malha foram determinados conforme ilustrado aqui, o aumento da porcentagem em peso do PEG causa uma diminuição significativa no tamanho da malha e um aumento na rigidez do hidrogel. Hidrogéis contendo albumina de soro bovino encapsulada foram formados usando pinos de peso molecular variável, conforme mostrado aqui. A liberação de albumina de soro bovino ocorre mais rapidamente a partir de hidrogéis formados usando PEG DM de maior peso molecular como resultado do maior tamanho da malha dentro do hidrogel.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar o elogio PEG DME usando o método assistido por micro-ondas e como avaliar a funcionalização usando RMN de prótons. Depois de dominar este procedimento, pode-se também utilizar a abertura do anel de grupos degradáveis hidrolíticos para responder a perguntas adicionais sobre como a degradação do hidrogel afeta a função celular. Você também deve ter uma boa compreensão de como essa técnica pode ser usada para incorporar seletivamente as funcionalidades de acrilamida de metanfetamina nas sequências de peptídeos terminais finais e como avaliar essa funcionalização usando espectrometria de massa de tempo de voo múltiplo.

Obrigado por assistir.