Name: A funcionalização assistida por microondas, de poli (etileno glicol) e Peptídeos On-resina para uso em Polimerizações cadeia e formação de hidrogel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T18:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Aprenda a funcionalização assistida por microondas de PEG e peptídeos para síntese de hidrogéis. Este método rápido e ecológico utiliza anidrido metacrílico e energia de microondas, com análise por RMN e espectrometria de massa MALDI-TOF.

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Este trabalho foi financiado em parte por uma bolsa Howard Hughes Med-em-Grad (AVH), por fundos start-up previsto para o Dr. Danielle Benoit, da Universidade de Rochester e de Pesquisa e Educação da Fundação Ortopédica / Transplante Musculoskeletal Foundation (FIA / MTF). Os autores gostariam de agradecer ao Dr. James L. McGrath para o uso de seu equipamento.

1. Síntese assistida por microondas de PEGDM <ol><li> Para evitar a contaminação com a água, pré-seco durante todo o material de vidro que está sendo usado numa estufa (&gt; 60 º C) durante 1 hora. Nota: vidraria necessária inclui: dois copos de 100 ml, um copo de 250 ml, 3 espátulas, um frasco de Büchner de 250 ml, um funil de Büchner de 7 cm, um relógio de vidro de 10 cm. </li><li> Pré-frio 100-150 ml de éter etílico anidro (74,12 g / mol), para a precipitação, subsequentemente realizada no passo 1.6, vertendo-a em uma taça, cobrindo o copo com um vidro de relógio, e colocando o recipiente em um prato de cristalização com gelo. Mova-ondas e vortexer em uma coifa química. Nota: O éter dietílico também podem ser pré-arrefecido colocando-se o recipiente num congelador química. Quanto mais baixa for a temperatura de éter dietílico conseguida por arrefecimento num congelador irá aumentar a taxa e eficiência de precipitação. </li><li> Em um pequeno barco pesar, pesar 5 g de poli (etileno glicol) (PEG) do molecupeso lar de sua escolha (1,000-100,000 Da). <ol><li> Se estiver presente, remover o pedaço de plástico a partir da tampa do frasco de cintilação. Tarar o frasco, e dispensar 10 de excesso molar de anidrido metacrílico para dentro do frasco (MA, 154,16 g / mol) por uma equação na capa. Adicionar PEG para o frasco de cintilação. <img alt="Equação 1" fo:content-width="200px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.jpg" width="250px" /> (1) onde <img alt="Equação 1.1" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.1.jpg" width="30px" /> é a massa de PEG, em g, <img alt="Equação 1.2" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.2.jpg" width="40px" /> é o peso molecular de PEG, em g / mol, <img alt="Equação 1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="40px" /> é o número de grupos OH terminais do PEG, e <img alt="Equação 1.4" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.4.jpg" width="40px" /> é o molecupeso lar de mestrado em g / mol. </li></ol></li><li> Vagamente torcer a tampa no frasco de cintilação. Defina o microondas para 5 min em potência máxima. Usando luvas resistentes ao calor, remova o frasco do microondas a cada 30 seg. <ol><li> Aperte totalmente a tampa e vortex por 30 segundos. Repita até a solução foi microondas para o total de 5 min. A tampa pode precisar de ser substituído durante o procedimento devido a rachaduras. </li></ol></li><li> Com a tampa solta, deixe o PEGDM arrefecer à temperatura ambiente. Dissolve-se o PEGDM em uma pequena quantidade (10-15 ml) de diclorometano (DCM, 84,93 g / mol). Nota: É recomendado que o PEGDM ser deixada arrefecer de forma significativa (~ 5 minutos), antes de DCM disso, para evitar a ebulição do DCM (um cancerígeno), devido ao calor residual. O PEGDM pode ser quebrado em pequenos pedaços, utilizando uma espátula e centrifugadas para ajudar na dissolução. </li><li> Precipitar o PEGDM em 10x excesso de éter etílico gelado por 20 min. Nota: Pode ser necessário para scRatch lado do copo com uma espátula para iniciar a formação de cristais para precipitar inferiores PEGs de peso molecular (2500 Da), no entanto, o PEG com um peso molecular inferior a 1000 Da não irá precipitar apesar de coçar. </li><li> Utilizando um funil de Buchner e um balão de, recolher o PEGDM por filtração a vácuo. Não filtrar à secura total, pois isso irá promover a adsorção de água para o PEGDM. Nota: Se for necessário para que o sistema de vácuo específico a ser utilizado, uma armadilha de vácuo pode ser colocado entre a instalação de filtração e a fonte de vácuo para proteger a bomba de vácuo de danos causados ​​por vapores de solventes. </li><li> Transfira a PEGDM filtrado para um tubo cônico de 50 ml com agulha de grosso calibre perfurou a tampa para ventilação. Armazenar durante a noite numa câmara de vácuo para secar. </li><li> PEGDM redissolve em DCM e reprecipitar (como nos passos 1,5-1,7) como um passo final para remover MA que não reagiu. Seque novamente como no passo 1.8. </li></ol> 2. Caracterização de PEGDM Funcionalização <ol><li> Utilizando clorofórmio deuterado (120,38 g / mol) como solvente, para preparar as amostras de 1 H-RMN. Colocar uma pequena amostra do PEGDM (≈ 10 mg) num frasco de cintilação com uma pequena quantidade de solvente (≈ 1,0 ml). A concentração alvo é de 10 mg / ml. <ol><li> Uma vez que a amostra é dissolvida, transferi-lo para um tubo NMR limpo. A amostra deve preencher os 4-5 cm do fundo do tubo de RMN. </li></ol></li><li> Recolhe-se o espectro de RMN de protão. Nossos dados são coletados por meio de um espectrômetro de 400 MHz. Execute as amostras à temperatura ambiente por pelo menos 64 exames para obter a resolução de dados suficientes. </li><li> Se a análise de RMN (Fig. 4) indica PEGDM funcionalização é inferior a 90%, o procedimento deve ser repetido methacrylation. Ajuste a massa de MA usado para contabilizar a quantidade reduzida de PEG não funcionalizados. </li></ol> Nota: A porcentagem de PEG funcionalizada em PEGDM pode ser calculado a partir do observado: a relação teórica de methacr terminaisprotões ylate (a, b e c) para centrais de protões PEG (d) (Figura 4). Para o PEG linear, o número teórico de protões centrais PEG é calculada pela equação 2: <img alt="Equação 2" fo:content-width="150px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.jpg" width="200px" /> (2) onde <img alt="Equação 2.1" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.1.jpg" width="40px" /> é o peso molecular do PEG, em g / mol e <img alt="Equação 2.2" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.2.jpg" width="70px" /> é o peso molecular de uma única repetição de PEG (44 g / mol). Por não-linear de PEG, esta equação deve ser modificada de modo a reflectir a estrutura de ramificação específica (Figura 1). A funcionalização por cento pode então ser calculada usando a equação 3: <img alt="Equação 3" fo:content-width="150px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.jpg" width="300px" /> (3) onde <img alt="Equação 3.1" fo:content-width="30px" src = &quot;/ files/ftp_upload/50890/50890eq3.1.jpg&quot; width = &quot;40px&quot; /&gt; é a área observada sob pico d (δ = 6,63 ppm), <img alt="Equação 3.2" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.2.jpg" width="40px" /> é a área sob os picos observados metacrilato de protões (a, δ = 1,94 ppm, b e c, δ = 5,57 e 6,12 ppm), e <img alt="Equação 3.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.3.jpg" width="40px" /> é o número teórico de protões metacrilato (a = 3 * <img alt="Equação 1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" /> , B = 1 * <img alt="Equação 1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" /> e c = 1 * <img alt="Equação 1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" /> - 6, 2 e 2, respectivamente, para o PEG linear). A funcionalização por cento cálculo deve ser realizada utilizando os picos a, b e c separadamente, e, em seguida, averaged para obter um por cento funcionalização geral. Nota: PEGDM suficientemente funcionalizado pode ser então dialisado (em água, contra a água) e recolhido por liofilização para remover o anidrido metacrílico residual e de ácido metacrílico. O produto final deverá ser misturado com uma pequena quantidade (0,01% em peso) de inibidor, tal como ácido cítrico ou de vitamina C e armazenado com dessecante a -20 ° C até à sua utilização. O produto final PEGDM podem ser utilizados para produzir hidrogeles, como detalhado no artigo JoVE por Khetan Burdick e 22. 3. Funcionalização assistida por microondas de péptidos em-resina Nota: Os peptídeos são sintetizados utilizando uma resina de Fmoc-Gly-Wang, usando um sintetizador de péptidos automatizado com monitorização UV, e soluções de 0,2 M de aminoácidos no N-metilpirrolidona (NMP, 99,1 g / mol). 5% de piperazina (86,1 g / mol) em dimetilformamida (DMF, 73,1 g / mol) é utilizado para a desprotecção, 0,5 M O-Benzotriazol-N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametil-urónio-hexaflUORO-fosfato (HBTU, 379,3 g / mol) em DMF é utilizado como activador, e 2 M de di-isopropiletilamina (DIEA, 129,3 g / mol) em NMP é usado como a base de activador. Os péptidos também podem ser obtidas a partir de um fornecedor comercial de péptidos. Quando o uso de fontes comerciais, é crítico que os péptidos são adquiridos em-resina com grupos intactos em vez de totalmente clivado da cadeia lateral do aminoácido de protecção, como é normal. Nota: É importante que os amino ácidos com cadeias laterais reactivas são protegidas para assegurar que a funcionalização metacrilamida só ocorre na amina primária do terminal-N da sequência. Ver Tabela 1 para os aminoácidos com grupos laterais reactivos, e os grupos protectores típicos. Aminoácidos com grupos protectores são incorporados na sequência durante a síntese de péptidos na mesma maneira como os aminoácidos não protegidos, e muitas vezes estão disponíveis a partir dos mesmos fornecedores de aminoácidos. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502"&gt; <colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Aminoácidos </td><td style="width:163px;"> Grupo reativo </td><td style="width:196px;"> Grupo de protecção </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Lisina </td><td style="width:163px;"> Amina Primária </td><td style="width:196px;"> terc-butiloxicarbonilo (Boc) </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Serina </td><td style="width:163px;"> Álcool Primário </td><td style="width:196px;"> terc-butil (tBu) </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Treonina </td><td style="width:163px;"> O álcool secundário </td><td style="width:196px;"> tBu </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> A tirosina </td><td style="width:163px;"> Fenol</td><td style="width:196px;"> tBu </td></tr></tbody></table> Tabela 1: aminoácidos reagentes e grupos protectores típicos. <ol><li> Sintetizar péptidos utilizando síntese de péptidos em fase sólida padrão, e armazenar a resina a 4 ° C em DMF até que esteja pronto para uso. </li><li> Utilizando um funil de Buchner de 7 centímetros, com papel de filtro e balão de 250 ml, recolher a resina de peptídeo a partir da DMF por via da filtração. </li><li> Se presente remover a peça de plástico da tampa do frasco de cintilação. Transferir a resina para o frasco de cintilação. Usando uma pipeta descartável, MA adicionar apenas o suficiente para cobrir a resina no frasco de cintilações. </li><li> Genericamente colocar a tampa no frasco de cintilações. Defina o microondas para 3 min em potência máxima. Usando luvas resistentes ao calor, remova o frasco do microondas a cada 15-20 segundos. <ol><li> Aperte totalmente a tampa e vortex por 15 s. Repita até a solução foi microondas durante o full 3 min. </li></ol></li><li> Com a tampa solta, deixe a solução de peptídeo arrefecer à temperatura ambiente. Com uma pequena quantidade de DMF e um funil de Buchner com papel de filtro e frasco, recolher a resina de péptido a partir do frasco. </li><li> Transferir a resina de peptídeo a um frasco de cintilação de fresco e clivar e desproteger o péptido. <ol><li> Por 0,25 mmol de resina, usamos uma reacção à temperatura ambiente 2 horas, com rotação, utilizando um cocktail de clivagem de 18,5 ml de ácido trifluoroacético (TFA, 114,02 g / mol) com 0,5 ml de cada um de triisopropilsilano (TIPS, 158,36 g / mol), 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol (Dodt, 182,30 g / mol) e água desionizada (18,02 g / mol). Nota: Este cocktail é suficiente para a maioria dos péptidos, mas não vai desproteger 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofurano-5-sulfonil aminoácidos (Pbf)-protegidos (vulgarmente utilizados para proteger as cadeias laterais de arginina). Se a sequência contém quaisquer grupos protegidos-Pbf, 0,5 ml de TFA deve ser substituído com 0,5 ml de tioanisole (124.20 g / mol) e clivagem de tempo aumentou para 4 h. Nota: Se um nublado, formas substância cristalina do coquetel clivagem, o peptídeo é provável cair fora da solução eo volume do coquetel clivagem deve ser duplicada. </li></ol></li><li> Relaxar 400 ml de éter dietílico anidro em gelo num copo de vidro coberto com relógio. </li><li> Precipitar o péptido em 10x excesso de éter dietílico, e divida a solução uniformemente entre quatro tubos de 50 mL cónicos. Centrifugar a 3.200 xg durante 10 min para recolher o péptido. <ol><li> Decantar o éter, e ressuspender o peptídeo em 100 ml de éter dietílico fresco divididas entre dois tubos cónicos de 50 m. Repetir o processo de centrifugação, ressuspensão em 50 ml de éter fresco duas vezes para um total de 4 lavagens de éter. Nota: Isto remove os produtos químicos usados ​​no cocktail de clivagem e clivada grupos protectores a partir do péptido sólido. </li></ol></li><li> Após a última etapa de centrifugação, decantar o et resíduosela e secar o péptido durante a noite sob vácuo. </li></ol> 4. Caracterização do Péptido Funcionalização <ol><li> Use 50:50 H 2 O: acetonitrilo (41,05 g / mol) + 0,1% de TFA como o solvente para a análise de MALDI-TOF de amostras de péptidos. Colocar uma pequena quantidade de amostra (1-2 mg) do péptido em um tubo Eppendorf de 1,5 ml e dissolve-se a amostra em 1 ml de solvente de MALDI. </li><li> Preparar a solução matriz. Uma matriz de ácido vulgarmente utilizado é α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA, 189,2 g / mol) como matriz. Dissolver 10 matriz mg / ml num solvente de MALDI, formando uma solução matriz de estoque. Nota: A solução-mãe de matriz pode ser armazenada à temperatura ambiente durante até uma semana para análises adicionais. </li><li> Combina-se o péptido e solução de matriz na proporção de 1:1. Detectar esta solução combinada em três locais distintos na chapa de amostra, MALDI, adicionando 1 ul / local. <ol><li> Seque as manchas, quer por secagem ao ar ou usando uma pistola de calor. Respot e seco cadaamostra. Nota: Respotting produz uma amostra peptídeo / matriz mais uniforme, e auxilia na obtenção de um sinal claro. Uma mistura de péptido de referência deve também ser combinado com a solução de matriz, em uma proporção de 1:1 e manchados (apenas uma vez) para a placa de MALDI. </li></ol></li><li> Coletar os dados de MALDI-TOF. Devido à adição do grupo metacrilamida para a N-terminal do péptido, deveria haver um aumento de 68 g / mole de peso molecular acima do que o peso molecular de péptido sozinho. Nota: Ao contrário da síntese PEGDM, péptidos não podem ser refunctionalized, como por clivagem os grupos de protecção de amino ácidos com cadeias laterais reactivas são removidos, e já não pode ser garantida a funcionalização selectiva do N-terminais. <ol><li> Se a análise de MALDI (Figura 5) indica o peptídeo foi correctamente funcionalizado e todos os grupos protectores apropriadamente clivado, o péptido pode ser dialisada (em água, contra a água) e recolhido por liofilização para remove contaminantes residuais (cocktail de clivagem, éter, clivado grupos protectores, etc.) O péptido sólido deve ser transferida para um pequeno tubo de Eppendorf e armazenou-se a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol></li></ol>

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	 <a target="_blank" href="http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/productid--40/">http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/productid--40/</a> (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Poli (etileno glicol) (PEG) hidrogéis são biomateriais comuns usados ​​na medicina regenerativa e de distribuição de drogas aplicações 1-3. Estes hidrogéis oferecem vantagens significativas sobre outros biomateriais. Hidrogéis PEG são sintéticos, oferecendo um alto grau de controle sobre as propriedades de engenharia, tais como módulo de elasticidade e velocidade de degradação em comparação com os seus homólogos de biomateriais naturais 1. Como eles são derivados sinteticamente, o PEG tem significativamente menos variabilidade de lote para lote, em relação materiais naturais derivados 4. Devido à composição química do PEG, estes hidrogéis são altamente hidrofílico, resistente à adsorção das proteínas, e biocompatível 3. Esta resistência à adsorção de proteínas permite hidrogéis PEG a agir como um &quot;lousa em branco&quot;, permitindo aos investigadores para interrogar e estudar fatores biológicos ou químicos específicos (fármacos, biomoléculas, peptídeos de adesão celular, etc) e os papéis específicos estes factors jogar no controlo de células e / ou o comportamento de tecidos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig1.jpg" width="600px" /> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . Figura 1: Exemplos de poli (etileno glicol) (PEG) arquitecturas A) linear PEG B) 4-braço de PEG com um núcleo de pentaeritritol C) de 8 braços de PEG com um núcleo de hexaglicerol D) 8-PEG com um braço.... tripentaeritritol núcleo. n é o número de PEG repete em cada braço. Cada repetição tem um peso molecular de 44 g / mol, por conseguinte, n pode ser calculado a partir do peso molecular total e a estrutura de braço / #. Precursores de PEG estão disponíveis com uma variedade de arquitecturas e pesos moleculares (Figura 1<html> ). Variando a arquitectura (braço #) e repetições de etileno glicol (n) de PEG pode ser utilizado para controlar as propriedades de redes de hidrogel formadas a partir destes macrómeros. Unmodified PEG contém grupos hidroxila terminais que devem ser substituídos com uma funcionalidade alternativa para facilitar a reticulação covalente via polimerização, a estratégia de reticulação mais comumente empregado para hidrogéis PEG, antes da formação de redes de hidrogel. Há uma variedade de grupos químicos que podem ser incorporados em macrómeros de PEG para facilitar a polimerização e reticulação da rede (acrilato, metacrilato, vinil éter, norborneno, etc.) Apesar da variedade de funcionalidades terminais disponíveis para facilitar a reticulação, só há dois mecanismos pelos quais a polimerização pode ocorrer: passo-e-cadeia de crescimento (ou uma mistura dos dois, de modo misto). &quot;width =&quot; g2.jpg 600px &quot;/&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . Figura 2:. Teórica. Hidrogel esquemática rede A) tradicional cadeia de crescimento de polimerização resulta em redes heterogêneas, contendo poli densa (metacrilato) regiões e aumento nonidealities rede, como loops, precursores que não reagiram, e embaraços permanentes reticulação B) Passo de crescimento de polimerização resulta em estruturas de rede significativamente mais homogêneos (sem escala). As funcionalidades que reticulam por meio de polimerização em cadeia para o crescimento não exigem a presença de um agente de reticulação adicional. No entanto, os hidrogéis polimerizado de cadeia produzir estruturas de redes heterogéneas que contenham regiões densas de reticulação (Figura 2A) 1. Em contraste, o crescimento passo-polimerização requires a utilização de um agente de reticulação ou o co-monómero que é reactivo com os grupos funcionais terminais dos macrómeros de PEG. Como os grupos funcionais terminais do PEG só ​​podem reagir com o agente de reticulação e o agente de reticulação só pode reagir com os grupos funcionais terminais do PEG, o que resulta em uma maior homogeneidade estrutura da rede (Figura 2B) 1. Passo polimerizações de crescimento também normalmente levar a uma maior conversão de grupos funcionais, diminuindo a quantidade de precursores que não reagiram e potencial para respostas imunitárias / inflamatórias devidas a macrómeros solúveis, não incorporados 1. Os métodos de polimerização de modo misto têm também sido desenvolvidos para combinar os dois polimerização passo-e-cadeia de crescimento por meio do uso de macrómeros que ambos podem auto-reagir (cadeia-crescimento) e reagem com um agente de ligação cruzada (passo de crescimento). Isto produz os hidrogéis com as características de cada um dos mecanismos de polimerização, e pode ser usado para produzir, diversas estruturas de rede mais complexa do que querpasso ou só 1 redes de cadeia de crescimento. Embora haja um grande número de grupos funcionais que podem ser utilizados para funcionalizar PEG e facilitar a formação de hidrogel, metacrilatos e norbornenos são algumas das porções de polimerização em cadeia e a etapa de crescimento mais comuns, respectivamente. Ambas as funcionalidades oferecer excelente controle espaço-temporal sobre a polimerização da rede, e, quando utilizado para encapsular células, estas redes de apoio de alta capacidade de sobrevivência das células em geral 5-7. Dimetacrilato de PEG funcionalizado (PEGDM) de ligações cruzadas através de polimerização em cadeia e permite a incorporação de biomoléculas ou de outros factores por meio de co-polimerização com acrilato, metacrilato de biomoléculas-, ou similar-funcionalizados 5,6. PEGDM hidrogéis têm vantagens significativas sobre os sistemas de polimerização em cadeia de crescimento alternativos, tais como o acrilato funcionalizado PEG (PEGDA). Utilizando métodos tradicionais, PEGDA pode ser sintetizado mais rapidamente do que PEGDM; hoWever, usando a síntese assistida por micro-ondas, a síntese PEGDM é ainda mais eficiente. PEGDA é frequentemente sintetizado em 8 ou durante a noite de 24 horas 9 reacções, mas também pode ser sintetizado em quatro horas a temperaturas elevadas 10. PEGDM também é sintetizado por reacção durante a noite, tradicionalmente, 11 ou 24 horas para 5, com alguns métodos que se prolonga o tempo de reacção 4 dias a 12. Usando o método do forno de microondas aqui demonstrado, PEGDM pode ser produzido em uma reacção de 5 min. Enquanto PEGDM tem cinética de reacção mais lenta do que PEGDA 13, a reacção de reticulação para PEGDM ainda é rápida, ocorrendo em minutos, e alcança uma maior conversão do que o macrómero PEGDA como o aumento da hidrofobicidade do grupo metacrilato aumentam a agregação de grupo funcional na solução, aumentando assim a probabilidade de transferência radical e conversão de metacrilato de 14. Hidrogéis PEGDM também estão associadas com o aumento da viabilidade celular e o crescimento comoem comparação com os hidrogéis PEGDA, provavelmente devido às diminuições na taxa de reação em qualquer momento dado, o que reduz a concentração de radicais e macrômeros não reagiram presentes 14. Polimerizações tiol-eno, tais como aqueles utilizando-norborneno funcionalizado PEG (PEGN) formam hidrogeles através da fase de polimerização para o crescimento, e requerem o uso de PEGN e um agente de reticulação que contêm uma média de mais do que dois grupos funcionais. Desde thiyl radicais reagem com títulos de norborneno carbono-carbono duplas, multi-tiol contendo agentes de reticulação são comumente usados ​​para reticular hidrogéis PEGN, permitindo a incorporação fácil de peptídeos com aminoácidos cisteína funcionalidades 7. Embora existam inúmeras outras químicas que reagem via polimerização passo de crescimento (Michael reações de adição, como tiol-acrilato 15 e sulfona tiol-vinil 16 &quot;, clique em&quot; reações como alcino-azida 17 etc), hidrogéis tiol-norbornene são muito comum, já que a tensão deo anel norbornene aumenta significativamente a velocidade de reação e diminui a chance de o norbornene polimerização em cadeia dupla ligação submetidos a 7. A decisão entre o metacrilato, norbornene ou funcionalização alternativa para facilitar a formação de hidrogel é em grande parte baseada na abordagem. Por exemplo, a cadeia de crescimento redes polimerizado PEGDM foram demonstradas também adequado para controlar a localização de células no desenvolvimento de engenharia de tecidos, periósteo 18,19. Passo-crescimento polimerizado redes de PEG são mais adequados para a incorporação de sequências de péptido para facilitar a degradação do hidrogel enzimaticamente sensível, devido à facilidade de incorporação de sequências de substrato da enzima, utilizando tiol (cisteína) contendo peptídeos e norborneno macrómeros funcionalizados 20. Se a pergunta de pesquisa será melhor abordada pela utilização de hidrogéis passo de crescimento, Fairbanks et ai. Fornece uma descrição detalhada do norborestratégia funcionalização nene para PEG 7. Este detalhe papel vontade como PEG e sequências de peptídeos pode ser funcionalizada (com um metacrilato de PEG e um metacrilamida para peptídeos) para reações de polimerização em cadeia. Tradicionalmente, PEGDM é produzido por reacção de PEG com cloreto de metacriloílo e trietilamina em diclorometano. A reacção é deixada progredir à temperatura ambiente durante a noite de 11 ou 24 horas para 5, com alguns métodos que se prolongam o tempo de reacção 4 dias 12 antes da filtração, precipitação em éter dietílico, e recolha. Embora existam muitas variações desta abordagem, todos são demorados, requerem uma grande variedade de equipamento de síntese química, e não são amigos do ambiente, uma vez que envolvem a utilização de quantidades relativamente grandes de reagentes de alta pureza e de solvente. Para contornar essas limitações, Lin-Gibson et al. Desenvolveram um método livre de solvente assistida por microondas para funcionalizar PEG com te<html> grupos metacrilato rminal (Figura 3A) 12. Nesta reacção, os grupos terminais do PEG álcool reage com um dos átomos do carbonilo do anidrido metacrílico para formar um grupo carboxilo. Isto gera o produto PEGDM, com o ácido metacrílico como um produto secundário. Esta síntese tem muitas das vantagens característicos da síntese de micro-ondas, incluindo a redução do tempo de reacção e os métodos de síntese sem solventes, 21. A síntese de microondas é preferível que os métodos anteriormente discutidos, uma vez que é significativamente mais rápido, requer menos equipamento de grande síntese (por exemplo, material de vidro, placas de reacção), e utiliza menos reagente geral e quantidades de solventes como solventes são necessários apenas para a purificação do produto / recolha e não para síntese, tornando-o mais econômico e ambientalmente amigável. 0px &quot;/&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . Figura 3:. Esquemas funcionalização A) Poli (etileno-glicol) é feito reagir com anidrido metacrílico 10x excesso molar para produzir poli (etileno glicol) metacrilato B) O mesmo método pode ser usado para funcionalizar o N-terminal de sequências de péptidos, formando um. metacrilamida peptídeo funcionalizada. Ao realizar este procedimento, antes de clivar o péptido da resina, a funcionalização selectiva do terminal-N pode ser realizada como grupos laterais de aminoácidos permanecem protegidos. n: número de PEG repete no macrómero (n = 45,5, 227 e 455, respectivamente, para a 2, 10, e 20 kDa PEG linear utilizado). R1 a RN: cadeias laterais de aminoácidos. PG1 para PGN: protecção da cadeia lateral grupos. TFA: ácido trifluoroacético. Dicas: triisopropilsilano. Dodt: 3,6-dioxa-1 ,8-octaneditHiol. H2O: a água. O método methacrylation assistida por micro-ondas foi recentemente adaptado pelo nosso grupo para funcionalizar o N-terminal de péptidos com grupos de metacrilamida (Figura 3B), para facilitar a incorporação no péptido de uma variedade de polímeros e redes poliméricas. Nesta reacção, a amina primária do terminal-N do péptido reage com o átomo de carbono no anidrido metacrílico para formar uma amida. Isto gera o péptido funcionalizado metacrilamida, com o ácido metacrílico produzido como um produto secundário. Ao utilizar este processo para funcionalizar o N-terminal de sequências de péptidos, é importante que os aminoácidos contendo cadeias laterais reactivas (aminas primárias (lisina), álcoois (serina, treonina) e fenóis (tirosina)) estão protegidos durante a funcionalização, e Os grupos protectores são clivados apenas após incorporação metacrilamida. Este artigo irá demonstrar ambos microwmétodos Ave-assistida para sintetizar PEGDM e funcionalizar sequências de peptídeos em resina, com destaque para as armadilhas comuns e sugerindo métodos de solução de problemas. Neste artigo, métodos para executar técnicas químicas analíticas comumente empregados para avaliar a funcionalização do produto serão detalhados e sugestões e recursos para a realização de modificações mais avançadas será dado. Os resultados típicos será demonstrado, que incluem a utilização do PEGDM sintetizado para formar redes de hidrogel, explorando os hidrogeles formados a controlar a libertação de um fármaco modelo e empregando péptidos funcionalizados para facilitar a interacção de células de hidrogel. Particular atenção será dada para caracterizar hidrogel malhagem e discutindo como composição de hidrogel pode ser ajustado para afetar essa propriedade física subjacente, que por sua vez controla as propriedades dos materiais a granel, como rigidez e perfil de liberação da droga.

<table><tbody><tr><td>3,6-dioxa-1,8-octanedithiol</td><td>Tokyo Chemical Industry Co, LTD</td><td>D2649</td><td>CAS 14970-87-7</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>J.T. Baker</td><td>UN1648</td><td>CAS 75-05-8</td></tr><tr><td>aminoácidos</td><td>AAPPTech</td><td>Glicina: AFG101</td><td>CAS 29022-11-5</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>Arginina: AFR105</td><td>CAS 154445-77-9</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>Asparagina: AFD105</td><td>CAS 71989-14-5</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>Serina: AFS105</td><td>CAS 71989-33-8</td></tr><tr><td>Éter dietílico anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN1155</td><td>CAS 60-29-7</td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1857</td><td>CAS 77-92-9</td></tr><tr><td>Clorofórmio deuterado</td><td>Cambridge Isotope Laboratories Inc.</td><td>DLM-7-100</td><td>CAS 865-49-6</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN1593</td><td>CAS 75-09-2</td></tr><tr><td>Diisopropiletilamina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1181</td><td>CAS 7087-68-5</td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119-4</td><td>CAS 68-12-2</td></tr><tr><td>Fmoc-Gly-Wang resina</td><td>Peptídeos Internacional</td><td>RGF-1301-PI</td><td>100-200 tamanho de malha</td></tr><tr><td>Methacrylic anidrido</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14357</td><td>CAS 760-93-0</td></tr><tr><td>N-Metilpirrolidona</td><td>VWR</td><td>BDH1141-4LG</td><td>CAS 872-80-4</td></tr><tr><td>Peptídeos em resina</td> Os peptídeos de resina <td>sintetizados</td><td></td><td>internamente também podem ser adquiridos na Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.</td></tr><tr><td>O-Benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametil-urônio-hexafluoro-fosfato</td><td>AnaSpec Inc</td><td>510/791-9560</td><td>CAS 94790-37-1</td></tr><tr><td>Calibração de Peptídeos Cuidados Padrão</td><td></td><td>206195</td><td></td></tr><tr><td>Piperazina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15019</td><td>CAS 11-85-0</td></tr><tr><td>Poli(etilenoglicol) 2 kDa linear</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22181</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>Poli(etilenoglicol) 10 kDa linear</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21955</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenoglicol) 20 kDa linear</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81300</td><td>JenKem Technologies USA é um fornecedor alternativo de PEG linear e multi-braço</td></tr><tr><td>Tioanisol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L5464</td><td>CAS 100-68-5</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td>CAS 76-05-1</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>Alfa Aesar</td><td>L09585</td><td>CAS 6485-79-6</td></tr><tr><td>&alfa;-Ciano-4-ácido hidroxicinâmico</td><td>Tóquio Indústria química Co, LTD</td><td>C1768</td><td>CAS 28166-41-8</td></tr></tbody></table>

a funcionalização assistida por microondas, de poli (etileno glicol) e peptídeos on-resina para uso em polimerizações cadeia e formação de hidrogel

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Uma das principais vantagens de se utilizar poli (etileno glicol) (PEG) macrômeros na formação de hidrogel é a versatilidade sintética. A capacidade de desenhar a partir de uma grande variedade de pesos moleculares de PEG e configurações (número braço, comprimento do braço, e padrão de ramificação) proporciona pesquisadores controlo apertado sobre resultando estruturas de hidrogel e propriedades, incluindo o módulo de Young eo tamanho da malha. Este vídeo vai ilustrar um método rápido, eficiente, livre de solventes, assistida por microondas para metacrilato precursores PEG em poli (etileno glicol) dimetacrilato (PEGDM). Este método sintético fornece matérias-primas tão necessárias para aplicações na entrega da droga e da medicina regenerativa. O método demonstrado é superior aos métodos methacrylation tradicionais, uma vez que é significativamente mais rápida e mais simples, bem como mais económico e amigo do ambiente, usando menores quantidades de reagentes e solventes. Nós também irá demonstrar uma adaptação desta técnica para methacr on-resinafuncionalização ilamida de péptidos. Este método de resina permite que o N-terminal de péptidos a ser funcionalizado com grupos de metacrilamida antes da desprotecção e clivagem a partir da resina. Isto permite a adição selectiva de grupos metacrilamida para o terminal N dos péptidos, enquanto os aminoácidos com grupos reactivos secundários (por exemplo, amina primária de lisina, o álcool primário de serina, álcoois secundários da treonina e da tirosina) fenol permanecem protegidos, evitando funcionalização em múltiplos locais. Esse artigo vai detalhe métodos analíticos comuns (protões de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (H-NMR) e Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Tempo de Voo espectrometria de massa (MALDI-TOF)) para avaliar a eficiência das funcionalizações. Armadilhas comuns e sugere métodos de resolução de problemas serão abordados, como modificações da técnica que pode ser usada para mais funcionalidade sintonia macrômero e resultando hidrogel física e químicapropriedades. O uso de produtos sintetizados para a formação de hidrogéis para a entrega da droga e os estudos de interação de células material será demonstrado, com especial atenção para modificar a composição de hidrogel para afetar tamanho de malha, controlando rigidez hidrogel e liberação da droga.

Resonância magnética nuclear é um dos mais comuns técnicas analíticas para avaliar a eficiência de uma reacção química, tal como a área sob cada pico de espectros é proporcional aos níveis relativos de protões que na amostra, permitindo a determinação das razões de reagente e de produtos na amostra. Para esta reacção, uma análise da &#39;H-RMN (Figura 4) pode ser utilizado para calcular a funcionalização% do observado: proporção teórica de protões de metacrilato terminais (a, b e c) para protões centrais PEG (d). O PEGDM mostrado na Figura 4 foi de 2.000 Da antes da funcionalização, portanto n = 2.000 Da / (44 Da / PEG repetição) = 45,5, então d = 4 * (n-1) = 178, fazendo com que o protão: proporção unidade RMN 178 / 102,16 = 1,74. Neste caso, o pico um não pode ser utilizado para avaliar% funcionalização, como a presença de água na amostra artificialmente aumenta a área sob o pico. Usando pico b, a funcionalização é de 1,00% 1,74 * / 2 * 100% = 87,1%; using de pico c, a funcionalização% é 1,08 * 1,74 / 2 * 100% = 94,1%. Portanto, a funcionalização total% é 91% e este é PEGDM adequadamente funcionalizado para utilização na síntese de hidrogel. Tipicamente, aproximadamente 90% de funcionalização é conseguida após um único ciclo de methacrylation. Devido ao grande número de picos de prótons que surgem em uma análise de H-RMN de peptídeos, peptídeos funcionalização é mais facilmente investigados usando espectrometria de massa MALDI-TOF. Isto é demonstrado na Figura 5, onde o GKRGDSG péptido foi sintetizado e submetido a metacrilamida funcionalização. Uma pequena fracção do péptido foi clivado para prefunctionalization avaliação do peso molecular (Figura 5A), que mostrou o pico de peso molecular observada ocorrendo em 676 g / mol, o peso molecular esperado de péptido, indicando a síntese correcta da sequência peptídica. O resto do péptido foram submetidos a metacrilamida funcionalzação antes da clivagem. Como este péptido contém Pbf aminoácidos protegidos por R, a clivagem foi realizada em um coquetel contendo tioanisole, durante 4 h. Após a funcionalização a metacrilamida, o pico observado peso molecular ocorre em 744 g / mol (Figura 5B), o peso esperado de metacrilamida funcionalizado péptido (68 676 g / mol) e não com o peso molecular esperado do péptido não funcionalizados, indicando correcta funcionalização. Para demonstrar a funcionalidade do PEG e a metacrilamida funcionalizado péptido, hidrogéis PEGDM foram produzidos com e sem 0,5 mM metacrilamida funcionalizado GKRGDSG (Figura 6). Os hidrogéis foram produzidas com 10% em peso linear de 10 kDa PEGDM em PBS, com 0,05% em peso de lítio fenil-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) como fotoiniciador. A solução de hidrogel precursor foi injetada entre duas lâminas de vidro separadas por um espaçador lâmina de vidro e realizada em conjunto com grampos da pasta. Solução precursora foi então exposto à luz UV de 365 nm a 2 mW / cm 2, durante 10 min para induzir a reticulação, após o que géis 8 mm de diâmetro foram recolhidos utilizando um punção cilíndrico. Os géis foram lavados em PBS e deixou-se inchar durante 2 dias para assegurar condições de inchamento de equilíbrio foram obtidos 16,20. MSCs humanas (passagem 3) foram cultivadas até 80% de confluência e semeadas em hidrogéis de 15.000 células / cm 2. As células foram deixadas aderir durante 48 h antes de ser transferido para meio fresco contendo 0,5 ul / ml de calceina AM e 2 ul / ml de homodímero de etídio (VIVO kit Viabilidade / MORTOS de Invitrogen) e visualizados sob contraste de fase e fluorescência a 10x de ampliação utilizando um Nikon Eclipse Ti 2000. MSCs foram incapazes de aderir aos hidrogeles de PEG não funcionalizados (Figura 6A), mas quando da inclusão do péptido RGD, a adesão das células que foram capazes de aderir e se espalhar sobre a superfície do hidrogel (Figura 6B). As imagens AO VIVO / MORTOapresentada não representam a viabilidade da população semeado MSC, como MSCs são células dependentes de aderência que se desprendem da superfície da gel após a morte e serão removidas durante o processo de transferência do material, resultando no aumento artificial da viabilidade das células semeadas. Pelo contrário, as imagens fluorescentes são destinados a delimitar entre as células aderentes e as pequenas variações na topologia de hidrogel, o que pode ser difícil sob contraste de fase sozinho. Interessantemente, as células semeadas em nonspread os PEG-somente os géis coloração positiva para ambas calceina AM e homodimero de etidio, indicando que as células estavam a morrer no momento da imagiologia. Uma das muitas vantagens para a hidrogeles de PEG é a sua natureza altamente sintonizável. Modificando a composição específica do hidrogel de PEG proporciona investigadores um elevado grau de controlo sobre as propriedades, tais como o módulo de elasticidade. Tal como ilustrado na Figura 7, tanto o peso molecular de PEG (Figura 7A) e percentagem de peso ( <strong&gt; Figura 7B) são conhecidos para controlar o tamanho da malha do hidrogel (ξ) e a rigidez do hidrogel resultante e taxa de libertar as drogas encapsuladas. Isto foi demonstrado pela produção de hidrogéis com diferentes PEGDM peso molecular, e investigar o módulo de hidrogel resultante e tamanho de malha (Figura 8). Todos os hidrogéis foram produzidas com 10% em peso PEGDM linear em PBS, com 0,05% em peso de LAP como fotoiniciador. 40 ul de solução precursora foi hidrogel em seringas de 1 ml, com as pontas cortadas e expostas a 365 nm de luz UV a 2 mW / cm 2, durante 10 min para formar hidrogéis, produzindo geometrias cilíndricas cerca de 5 mm de diâmetro e 2 mm de altura . Os géis foram deixadas inchar em PBS durante 2 dias antes do teste mecânico. Hidrogel módulo foi determinado usando um MTS QT / 5 com uma célula de carga de 5 N, enquanto comprimindo entre 5 e 10% da altura inicial do hidrogel a uma velocidade de 0,1 mm / seg. Após o teste mecânico foi completada, o tamanho da malha foi determinada pela medição de hidrogel mass pré-(M s) e pós-(M D) 24 horas de liofilização através da equação de Flory-Rehner conforme detalhado na seção de discussão, com cálculos realizados em MATLAB. Como esperado, o aumento do peso molecular do PEG macrómero causou um aumento no tamanho da malha do hidrogel (Figura 8A) e uma diminuição na rigidez do hidrogel (Figura 8B). Hidrogel de tamanho de malha e a rigidez de gel resultante também pode ser controlada através da alteração percentual de peso de PEG. Os hidrogéis foram produzidas com diferentes% em peso de linear de 10 kDa PEGDM, e rigidez do hidrogel e tamanho da malha foram determinadas como anteriormente descrito (Figura 9). Como foi ilustrado na Figura 7B, aumentando% em peso de PEG provoca uma diminuição significativa no tamanho de malha (Figura 9A) e aumento da rigidez do hidrogel (Figura 9B). Os hidrogeles que contêm encapsulado de albumina de soro bovino (BSA) foram formadas utilizando molecula variandor PEG de massa (2, 10, e 20 kDa). Todos os hidrogéis foram produzidas com 10% em peso PEGDM em PBS contendo 50 ug / ml de BSA, como descrito para a Figura 6. Os géis foram incubados em 1 ml de PBS a 37 ° C, e transferidos para PBS fresco em cada ponto de tempo. BSA liberada foi quantificada usando o Ensaio de Bradford da Thermo Scientific. Hidrogel malhagem foi determinada como descrito para a Figura 8. Como ilustrado na Figura 7A, a libertação de BSA ocorre mais rapidamente a partir de hidrogéis formados usando PEGDM maior peso molecular, como um resultado do maior tamanho de malha no interior do hidrogel (Figura 10). <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4. Representante 1 H-RMN de 2 kDa linear PEGDM funcionalizado usando o método assistido por microondas. Funcionalização por cento pode ser calculated baseado na observou:. relação teórica de prótons de metacrilato de terminais (a, b e c) para centrais prótons PEG (d) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig5.jpg" width="500px" /> Figura 5. Representante de MALDI-TOF de péptido GKRGDSG (A) antes e (B), após a funcionalização usando o método assistido por microondas. Note-se que o pico de peso molecular observado após a funcionalização ocorre a 744 g / mol, o peso esperado de metacrilamida funcionalizado péptido (676 68 g / mol) e não com o peso molecular esperado do peptídeo funcionalizada-un (676 g / mol). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . Figura 6. Representante de contraste de fase (à esquerda) e Live / DEAD (verde / vermelho) imagens fluorescentes (direita) de MSCs cultivadas em A) PEG géis sozinho e B) géis PEG contendo 0,5 mM metacrilamida GKRGDSG funcionalizada. MSCs são incapazes de aderir e espalhar sobre os géis PEGDA sozinho, mas aquando da constituição do peptídeo RGD adesão celular, são capazes de aderir e espalhar sobre a superfície do hidrogel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig7.jpg" width="500px" /> Figura 7. A) peso molecular PEG e B) porcentagem de peso PEG usado para formar redes de hidrogel afeta hidrogel tamanho da malha (_8 ;) ea rigidez resultante hidrogel e taxa de drogas encapsuladas liberar. A) O aumento do peso molecular PEG (esquerda para direita) em porcentagem de peso constante aumenta o tamanho da malha de hidrogel, diminuindo a rigidez hidrogel e aumentar a taxa de liberação da droga. B) A diminuição do peso porcentagem de PEG (esquerda para direita) usados ​​para formar hidrogéis aumenta o tamanho da malha de hidrogel, diminuindo a rigidez semelhante hidrogel e aumentar a taxa de liberação da droga (sem escala). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig8.jpg" width="500px" /> Figura 8. A) aumenta malhagem e B) rigidez hidrogel diminui com o aumento do peso molecular do PEG macrômero. N = 10, barras de erro = SEM, *** p &amp;º 60; 0,001 por ANOVA com teste post-hoc HSD de Tukey. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Prism 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig8highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig9.jpg" width="500px" /> Figura 9. A) Malha diminui e B de tamanho) de hidrogel de rigidez aumenta com o aumento da% em peso PEG. N = 9-10, barras de erro = SEM, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001 por ANOVA de uma via com HSD de Tukey pós- teste hoc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig9highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 10" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig10.jpg" width="500px" /> Figura 10. Lançamento de encalibertação de BSA modelo psulated soro albumina bovina droga (BSA) a partir de hidrogéis formados utilizando 2 kDa, 10 kDa, 20 kDa, o peso molecular do PEG. ocorre mais rapidamente a partir de hidrogéis formados com maior peso molecular PEGDM, como um resultado do tamanho de malha maior dentro do hidrogel . n = 6, as barras de erro = EPM. A BSA% liberado é significativamente diferente (p &lt;0,0001) entre os três grupos em cada ponto de tempo, exceto t = 1 e 2,5 horas quando a libertação das 2 e 10 kDa géis são equivalentes, por duas vias repetir-medidas ANOVA com Bonferroni post-hoc teste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig10highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

Este vídeo é ilustrar um método rápido, eficiente para metacrilato de poli (etileno-glicol), permitindo que as polimerizações de cadeia e síntese de hidrogel. Ele vai demonstrar como a introdução de funcionalidades semelhante metacrilamida em peptídeos, detalhe métodos analíticos comuns para avaliar a eficiência de funcionalização, fornecer sugestões para a solução de problemas e modificações avançadas, e demonstrar técnicas típicas de caracterização hidrogel.

A funcionalização assistida por microondas, de poli (etileno glicol) e Peptídeos On-resina para uso em Polimerizações cadeia e formação de hidrogel

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

O objetivo geral deste procedimento é funcionalizar polietilenoglicol e peptídeos com grupos de acrilato de metanfetamina para polimerizações de cadeia subsequentes e síntese de hidrogel. Isso é feito combinando primeiro o anidrido acrílico de metanfetamina e o precursor funcionalizado da ONU em um frasco de cintilação. O segundo passo é usar a energia de microondas para funcionalizar o pino ou peptídeo.Em seguida, o PEG DM é dissolvido em clorometano ou o peptídeo é clivado da resina. E todos os grupos protetores de cadeia lateral são removidos em um coquetel à base de ácido. A etapa final é precipitar o PEG DM ou peptídeo funcionalizado de metanfetamina acrilamida em éter.Em última análise, a RMN de prótons ou a espectrometria de massa de tempo de voo de Maldi é usada para mostrar a funcionalização bem-sucedida do pino ou macro peptídico. Olá, meu nome é Amy Van Hove. Sou estudante de doutorado no departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Rochester.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a reação de PEG com fluoreto de metanfetamina e acrílico, é que a reação é significativamente mais rápida e ecologicamente correta. Olá, meu nome é Brandon Wilson. Sou graduado em engenharia química pela Universidade de Rochester.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos biomateriais, como a forma como os hidrogéis produzidos usando peg dimetil podem ser empregados para controlar a entrega de células terapêuticas nas moléculas. Olá, sou Danielle Benoit, professora assistente do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Rochester. As implicações dessa técnica são para o desenvolvimento de terapias para uma variedade de doenças, pois os compostos sintetizados podem ser usados para aplicações de entrega de células e medicamentos.Antes de iniciar este procedimento, seque os copos necessários em um forno por uma hora para evitar a contaminação com água em um grande barco de soro de leite. Saída de cinco gramas de peg com um peso molecular entre 1000 e 100.000 daltons. Se houver, remova o pedaço de plástico da tampa de um frasco para injetáveis de cintilação na capa química.Dispense 10 molares em excesso de anidrido acrílico de metanfetamina em um frasco de cintilação rasgado. Em seguida, adicione PEG ao frasco. Em seguida, gire a tampa no frasco e coloque o frasco no micro-ondas.Defina o micro-ondas para cinco minutos na potência máxima usando luvas resistentes ao calor. Retire o frasco do micro-ondas a cada 30 segundos. Em seguida, aperte totalmente a tampa e vortex a amostra por 30 segundos.Afrouxe a tampa antes de colocar o frasco no micro-ondas. Repita essas etapas até que a solução tenha sido colocada no micro-ondas por cinco minutos completos. Depois de remover o frasco do micro-ondas, solte a tampa e deixe o PEG DM esfriar até a temperatura ambiente.Em seguida, dissolva o PEG DM em 10 a 15 mililitros de di clorometano. Precipitar o PEG MS em 10 x excesso de éter pré-datilílico durante 20 minutos. Usando um funil de Buckner de sete centímetros e um balão de 500 mililitros.Colete o PEG DM por filtração a vácuo. Em seguida, transfira o PEG DM filtrado para um tubo cônico de 50 mililitros com uma agulha de calibre grande perfurada na tampa para ventilação. Coloque o tubo em uma câmara de vácuo e seque o PEG DM durante a noite.Depois de remover o tubo da câmara de vácuo, dissolva o PEG DM em precipitado de clorometano DI com éter datil gelado. Para remover o anidrido acrílico de metanfetamina não reativo após filtração e coleta, seque o PEG DM em uma câmara de vácuo da mesma maneira que antes. Para análise de RMN de prótons, coloque aproximadamente 10 miligramas de PEG DM em um frasco de cintilação e adicione aproximadamente um mililitro de clorofórmio deuterado.Assim que a amostra estiver dissolvida, transfira-a para um tubo de RMN limpo. Em seguida, colete os espectros de RMN de prótons e execute as amostras em temperatura ambiente por pelo menos 64 varreduras para obter resolução de dados suficiente. Depois de sintetizar o peptídeo de interesse por síntese em fase sólida, armazene-o na resina em DMF a quatro graus Celsius até que esteja pronto para uso.Em seguida, colete a resina peptídica por filtração usando um funil de buckner de sete centímetros com papel de filtro e um balão de 250 mililitros. Remova o pedaço de plástico da tampa de um frasco de cintilação e transfira a resina para o frasco. Usando uma pipeta descartável, adicione anidrido acrílico de metanfetamina apenas o suficiente para cobrir a resina Depois de girar frouxamente a tampa no frasco, coloque-o no micro-ondas e ajuste o cronômetro para três minutos.Na potência máxima usando luvas resistentes ao calor, remova o frasco do micro-ondas a cada 15 a 20 segundos. Depois de apertar totalmente a tampa, vortex a amostra por 15 segundos. Afrouxe a tampa antes de colocar o frasco no micro-ondas.Repita até que a solução tenha sido colocada no micro-ondas por três minutos completos. Com a tampa do frasco afrouxada, deixe a solução peptídica esfriar até a temperatura ambiente usando uma pequena quantidade de DMF e um funil de buckner de sete centímetros. Com papel de filtro e um balão de 250 mililitros.Colete a resina peptídica do frasco para clivagem e proteção profunda. Transfira a resina peptídica para um frasco de cintilação fresco para 0,25 milimoles de arginina contendo peptídeo. Adicione 0,25 mililitros de propileno tri ISO, três seis dióxidos, um diol tiol de oito octanas, água deionizada e 18,0 mililitros de TFA.Em seguida, gire a mistura de reação em um rotador de terremoto de laboratório por quatro horas em temperatura ambiente. Quando terminar, precipite o peptídeo em 10 x excesso de éter etílico pré-resfriado. Divida a solução uniformemente entre quatro tubos cónicos de 50 ml, centrifugue as quatro amostras a 3 200 g durante 10 minutos para recolher o péptido após centrifugação, transvase o éter e ressuspenda o péptido em 100 mililitros de éter etílico fresco dividido entre dois tubos cónicos de 50 ml.Repita o processo de centrifugação. Resus suspendendo o peptídeo em 50 mililitros de éter fresco duas vezes para um total de quatro lavagens de éter após a última etapa de centrifugação, decanta o éter residual e seca o peptídeo durante a noite sob vácuo. Para preparar a amostra para a análise do tempo de voo de Maldi, coloque um a dois miligramas do peptídeo em um tubo einor de 1,5 mililitro e dissolva a amostra em um mililitro de solvente maldi.Em seguida, preparar uma solução de matriz de 10 miligramas por mililitro de ácido hidroxicerâmico Alpha Sano quatro no solvente multis. Combine as soluções de peptídeos e matrizes em uma proporção de um para um, coloque um microlitro da solução combinada em três locais separados na placa de amostra MALDI. Seque as manchas usando uma pistola de ar quente.Em seguida, reposicione e seque cada amostra. Finalmente, colete os dados de tempo de voo MALDI e confirme um aumento de 68 gramas por mol no peso molecular devido à adição do grupo metanfetamina acrilamida ao terminal final do peptídeo. Aqui é mostrado o espectro de RMN de um PEG DM linear de dois quilodalton funcionalizado usando o método assistido por micro-ondas para esta reação.A análise de RMN de prótons pode ser usada para calcular a porcentagem de funcionalização da razão observada para teórica dos prótons terminais de metacrilato para os prótons PEG centrais. A funcionalização percentual geral é de 91% e este PEG DM é adequadamente funcionalizado para uso na síntese de hidrogel. Consulte o protocolo de texto para obter detalhes sobre como calcular a porcentagem de funcionalização devido à multiplicidade de picos de prótons que surgem na análise de RMN de prótons de peptídeos peptídicos.A funcionalização do peptídeo é mais facilmente investigada usando espectrometria de massa de tempo de voo maldi. Isso é demonstrado aqui onde o peptídeo G-K-R-G-D-S-G foi sintetizado e submetido à funcionalização da acrilamida de metanfetamina, uma pequena fração do peptídeo foi clivada para avaliação do peso molecular de pré-funcionalização, que mostrou o pico de peso molecular observado ocorrendo em 676 gramas por mol, o peso molecular esperado do peptídeo, o restante do peptídeo sofreu funcionalização de acrilamida de metanfetamina antes da clivagem após a funcionalização da acrilamida de metanfetamina. O pico de peso molecular observado ocorre em 744 gramas por mol, o peso esperado do peptídeo funcionalizado de metanfetamina acrilamida.Para demonstrar a funcionalidade tanto do PEG DM quanto dos peptídeos funcionalizados de metanfetamina-acrilamida, hidrogéis de PEG foram produzidos com e sem metanfetamina 0,5 milimolar. GK R-G-D-S-G funcionalizado com acrilamida mostrados aqui são imagens representativas de contraste de fase e fluorescentes de mortos vivos de MSCs em géis de peg sozinhos e em géis de peg contendo o peptídeo funcionalizado com metanfetamina. As MSCs não conseguiram aderir aos hidrogéis de pinos funcionalizados pela ONU, mas após a inclusão do peptídeo de adesão celular RGD, elas foram capazes de aderir e se espalhar na superfície do hidrogel.As imagens de mortos-vivos não representam a viabilidade da população de MSC semeada. Em vez disso, as imagens fluorescentes destinam-se a demarcar entre células de aderência e pequenas variações na topologia do hidrogel, o que pode ser difícil apenas sob contraste de fase. Curiosamente, as células não espalhadas semeadas nos géis PEG apenas coram positivo para o cálcio AM e o homodímero AUM, indicando que as células estavam morrendo no momento da imagem.Uma das muitas vantagens dos hidrogéis PEG é sua natureza altamente ajustável, modificando a composição específica do pino. O hidrogel oferece aos pesquisadores um alto grau de controle sobre propriedades como módulo de elasticidade, conforme ilustrado aqui. Tanto o peso molecular do PEG quanto a porcentagem de peso são conhecidos por controlar o tamanho da malha do hidrogel, o hidrogel resultante, a rigidez e a taxa de liberação de medicamentos encapsulados.Isso foi demonstrado produzindo hidrogéis com peso molecular variável PEG dm e investigando o módulo de hidrogel resultante e o tamanho da malha, conforme hipotetizado, aumentando o peso molecular do pino. Macer causou um aumento no tamanho da malha de hidrogel e uma diminuição na rigidez do hidrogel, o tamanho da malha de hidrogel e a rigidez do gel resultante também podem ser controlados alterando o peso. A porcentagem de hidrogéis de PEG foi produzida com peso variável.A porcentagem de PEG DM linear de 10 kilodalton e a rigidez do hidrogel e o tamanho da malha foram determinados conforme ilustrado aqui, o aumento da porcentagem em peso do PEG causa uma diminuição significativa no tamanho da malha e um aumento na rigidez do hidrogel. Hidrogéis contendo albumina de soro bovino encapsulada foram formados usando pinos de peso molecular variável, conforme mostrado aqui. A liberação de albumina de soro bovino ocorre mais rapidamente a partir de hidrogéis formados usando PEG DM de maior peso molecular como resultado do maior tamanho da malha dentro do hidrogel.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar o elogio PEG DME usando o método assistido por micro-ondas e como avaliar a funcionalização usando RMN de prótons. Depois de dominar este procedimento, pode-se também utilizar a abertura do anel de grupos degradáveis hidrolíticos para responder a perguntas adicionais sobre como a degradação do hidrogel afeta a função celular. Você também deve ter uma boa compreensão de como essa técnica pode ser usada para incorporar seletivamente as funcionalidades de acrilamida de metanfetamina nas sequências de peptídeos terminais finais e como avaliar essa funcionalização usando espectrometria de massa de tempo de voo múltiplo.Obrigado por assistir.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Geração e recuperação de β-esferóides de células a partir do passo de crescimento-PEG-péptido Hidrogéis

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Fabricando degradáveis hidrogel de Thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação

Este protocolo apresenta três métodos de preparação rápidos e simples que utilizam condições ambientais para desencadear a automontagem de peptídeos em hidrogéis. Além disso, a caracterização de hidrogéis peptídicos é descrita, demonstrando que hidrogéis peptídicos mecanicamente estáveis podem ser formados sob essas condições diretas.

Preparação de hidrogéis de peptídeos automontados mecanicamente estáveis

Microondas assistidas intramoleculares dehydrogenative Diels-Alder (DA) reações fornecer acesso concisa para ciclopenta funcionalizada...

Microondas assistidas Intramoleculares Dehydrogenative Diels Alder-Reações para a síntese de Naftalenos funcionalizados / Corantes solvatocrômico

Aprenda a funcionalização assistida por microondas de PEG e peptídeos para síntese de hidrogéis. Este método rápido e ecológico utiliza anidrido metacrílico e energia de microondas, com análise por RMN e espectrometria de massa MALDI-TOF.

A funcionalização assistida por microondas, de poli (etileno glicol) e Peptídeos On-resina para uso em Polimerizações cadeia e formação de hidrogel (Vídeo) | JoVE Journal

A funcionalização assistida por microondas, de poli (etileno glicol) e Peptídeos On-resina para uso em Polimerizações cadeia e formação de hidrogel

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