Name: Geração de Quimeras de Almofada de Gordura de Linfonodo para o Estudo da Origem das Células Estromais de Linfonodos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a gerar quimeras de almofada de gordura de linfonodo para estudar a origem das células estromais de linfonodos em camundongos. Este método permite analisar a contribuição do tecido adiposo para o desenvolvimento do estroma linfonodal.

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Somos gratos ao pessoal da Unidade de Serviços Biomédicos da Universidade de Birmingham por cuidar de nossas colônias de animais. Este trabalho foi apoiado pelo projeto integrado do 7º PQ da UE INFLACARE to JC.

Os camundongos foram criados e mantidos em condições de FPS na Unidade de Serviços Biomédicos da Universidade de Birmingham, de acordo com os regulamentos do Ministério do Interior do Reino Unido e do comitê de ética local. Todos os procedimentos descritos neste protocolo são cobertos por uma Licença de Projeto aprovada pelo comitê de ética local e pelo Ministério do Interior.
1. Isolamento de LNs recém-nascidos
<ol>
	<li>Sacrifique os camundongos recém-nascidos por luxação cervical.</li>
	<li>Corte a cabeça e abra o corpo com uma tesoura do topo da região torácica até a parte inferior da região abdominal e remova cuidadosamente todas as vísceras (coração, pulmões, fígado, intestino, rim, bexiga) da cavidade abdominal.</li>
	<li>Transferir o corpo para uma placa de Petri de 90 mm contendo meio RF10 (meio RPMI1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina e 2 mM de L-glutamina). A partir desta etapa, os tecidos serão mantidos em condições estéreis e manuseados em uma capa de cultura de tecidos.</li>
	<li>Transfira o corpo para uma nova placa de Petri de 90 mm contendo RF10.</li>
	<li>Sob o microscópio de dissecação, retire cuidadosamente o peritônio da pele na região inguinal. O LN inguinal está situado na interseção de três vasos sanguíneos na almofada de gordura.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o LN. Certifique-se de que todo o tecido adiposo seja removido. Transfira o LN para uma placa de Petri de 50 mm contendo meio RF10. Mantenha os tecidos no gelo enquanto continua com o procedimento.</li>
</ol>
2. Isolamento de almofadas de gordura E18.5
<ol>
	<li>Para gerar embriões de camundongos no dia 18,5 da gestação (E18.5), configure gestações programadas colocando uma fêmea e um macho por gaiola durante a noite. Separe os camundongos pela manhã e verifique se há tampões vaginais (dia gestacional E0,5).
	<ol>
		<li>Eutanasiar as fêmeas obstruídas no dia 18,5 da gravidez por luxação cervical.</li>
		<li>Remova os embriões e coloque-os em uma placa de Petri de 90 mm contendo RF10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>A partir desta etapa, os tecidos devem ser manuseados usando técnica estéril na capa de cultura de tecidos. Sob o microscópio de dissecação, corte a cabeça, abra os embriões com uma tesoura da região torácica até o fundo da região abdominal e remova cuidadosamente todas as vísceras (coração, pulmões, fígado, intestino, rim, bexiga) da cavidade corporal.</li>
	<li>Limpe o corpo de todos os tecidos viscerais restantes e lave-o em PBS para eliminar todos os vestígios de sangue que possam dificultar a dissecação.</li>
	<li>Transferir os corpos limpos para uma nova placa de Petri de 90 mm contendo RF10.</li>
	<li>Separe cuidadosamente o peritônio da pele na região inguinal. O LN inguinal está situado na interseção de três vasos sanguíneos na almofada de gordura.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o LN e descarte-o. É muito importante remover completamente o LN para garantir que a almofada de gordura usada para as quimeras não esteja contaminada por nenhuma célula estromal linfoide.</li>
	<li>Remover a almofada de gordura inguinal e transferi-la para uma placa de Petri de 50 mm contendo meio RF10. Mantenha os tecidos no gelo enquanto continua com o procedimento.</li>
</ol>
3. Geração da Quimera da Almofada LN-fat
<ol>
	<li>Preparar o sistema de cultura de órgãos in vitro 15.
	<ol>
		<li>Preparação de esponjas e filtros: Isso pode ser feito com antecedência e esponjas e filtros armazenados estéreis em uma placa de Petri na capela de cultura.
		<ol>
			<li>Corte o Vulkan Underwrap em 1-1,5 cm2 pedaços</li>
			<li>Ferva as esponjas por 2 horas em água destilada.</li>
			<li>Deixe as esponjas secarem por algumas horas na capa de cultura de células.</li>
			<li>Ferva os filtros por 20 min.</li>
			<li>Deixe os filtros secarem por algumas horas na coifa de cultura de células.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Prepare o meio DMEM complementado com 10% de soro fetal bovino, HEPES 10 mM, 1x solução de aminoácidos não essenciais MEM, 2-mercaptoetanol 50 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/ml e L-glutamina 2 mM.</li>
		<li>Adicionar 2 ml de meio numa placa de Petri de 50 mm.</li>
		<li>Disponha uma esponja no fundo da placa de Petri. Molhe os dois lados da esponja submergindo-os no meio.</li>
		<li>Coloque um filtro em cima da esponja. O filtro é posicionado na interface líquido-ar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sob o microscópio de dissecação, reassocie cuidadosamente um recém-nascido</li>
	<li>Coloque a quimera da almofada de gordura LN em cima do filtro.</li>
	<li>Transfira a placa de Petri em uma caixa de plástico retangular com alguns orifícios na tampa e contendo água no fundo para garantir a umidade.</li>
	<li>Feche a tampa da caixa com fita adesiva. Deixe os dois orifícios da tampa abertos.</li>
	<li>Transfira a caixa para uma incubadora de cultura de células a 37 °C com 5% de CO2. Deixe a caixa se equilibrar por 2 horas, antes de selar os orifícios da tampa com fita adesiva.</li>
	<li>Incube os tecidos por pelo menos 2 dias para permitir que o LN se fixe à almofada de gordura e seja transferível sob a cápsula renal.</li>
</ol>
4. Transferência da quimera da almofada de gordura LN sob a cápsula renal de camundongos hospedeiros
<ol>
	<li>Colete as quimeras da almofada de gordura LN do filtro e transfira-as para baixo da cápsula renal dos camundongos hospedeiros. O método de transferência da cápsula renal já foi descrito 16.</li>
</ol>
5. Isolamento dos LNs transferidos
<ol>
	<li>Após 3-4 semanas sob a cápsula renal, as quimeras das almofadas de gordura LN estão prontas para serem colhidas. Eutanasiar os camundongos hospedeiros usando orientações aprovadas.</li>
	<li>Remova o rim dos camundongos hospedeiros.</li>
	<li>Sob o microscópio de dissecação, isole a quimera da almofada de gordura LN e disseque a NL.</li>
</ol>
6. Digestão enzimática dos LNs transferidos para análise por citometria de fluxo
<ol>
	<li>Faça uma incisão no LN com uma pequena tesoura para permitir que as enzimas penetrem no órgão e facilitem a digestão.</li>
	<li>Coloque um LN em 1,5 ml de Eppendorf contendo 600 μl de tampão de digestão (RPMI 1% FCS, 2,5 mg / ml de colagenase D, 100 μg / ml de DNase I).</li>
	<li>Incubar durante 30 min a 37 °C num bloco térmico agitador. Pipete para cima e para baixo para ajudar na dissociação dos tecidos a cada 10 minutos.</li>
	<li>Adicione 6 μl de EDTA 0,5 M ao tubo e pipete para cima e para baixo para terminar a dissociação dos tecidos.</li>
	<li>Centrifugue por 5 min a 490 x g.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet celular na solução de coloração (PBS, BSA 0,1%, soro de rato a 5% e soro de camundongo a 5%) contendo a combinação de anticorpos primários.</li>
	<li>Incube por 30 min no gelo.</li>
	<li>Lave duas vezes em PBS</li>
	<li>Incube com anticorpos secundários por 20 minutos, se necessário.</li>
	<li>Lave 2x em PBS.</li>
	<li>Analisar com citómetro de fluxo.</li>
</ol>
7. Análise dos LNs transferidos por imunofluorescência
<ol>
	<li>Fixação para conservação do EYFP durante o processo de congelamento e criossecção: Coloque o LN em uma solução de PBS, 4% de PFA e 10% de sacarose e deixe por 3-4 horas.</li>
	<li>Coloque uma única gota pequena de composto OCT frio em um pequeno pedaço de papel alumínio. Evite bolhas de ar. Coloque cuidadosamente o LN sem nenhum líquido no meio da gota.</li>
	<li>Congele o órgão colocando a folha de alumínio em gelo seco.</li>
	<li>Corte seções de 8 a 10 μm em lâminas de vidro adesivas extras usando um criostato. Deixe as lâminas secarem por 2 horas antes de armazená-las a -20 °C.</li>
	<li>Os procedimentos de coloração podem variar de acordo com os anticorpos primários usados e podem ser otimizados a partir do protocolo a seguir. Manchar as secções com solução de coloração (PBS, 1% BSA) contendo a combinação de anticorpos primários.</li>
	<li>Incube por 1 hora em temperatura ambiente em uma câmara umidificada.</li>
	<li>Lave duas vezes em PBS por 5 min</li>
	<li>Incubar com anticorpos secundários durante 1 hora.</li>
	<li>Lave duas vezes em PBS por 5 min.</li>
	<li>Monte as lâminas em uma mídia de montagem contendo DAPI.</li>
	<li>Capture imagens usando um microscópio de fluorescência ou confocal.</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+contributions+to+the+homeostasis+and+functionality+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 618-629 (2009).</li>
<li>Roozendaal, R., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-immune cell interactions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 23-43 (2011).</li>
<li>Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal+and+haematopoietic+antigen-presenting+cells+that+reside+in+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 813-825 (2010).</li>
<li>Katakai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizer-like+reticular+stromal+cell+layer+common+to+adult+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Organizer-like reticular stromal cell layer common to adult secondary lymphoid organs.</a> J. Immunol. 181, 6189-6200 (2008).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+in+lymph+nodes+regulate+the+homeostasis+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells.</a> Nat. Immunol. 8, 1255-1265 (2007).</li>
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<li>Vondenhoff, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTbetaR+signaling+induces+cytokine+expression+and+up-regulates+lymphangiogenic+factors+in+lymph+node+anlagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">LTbetaR signaling induces cytokine expression and up-regulates lymphangiogenic factors in lymph node anlagen.</a> J. Immunol. 182, 5439-5445 (2009).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes Dev. 13, 2412-2424 (1999).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peripheral+lymph+node+genesis+by+the+tumor+necrosis+factor+family+member+TRANCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE.</a> J. Exp. Med. 192, 1467-1478 (2000).</li>
<li>Carragher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stroma-derived+defect+in+NF-kappaB2-%2F-+mice+causes+impaired+lymph+node+development+and+lymphocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A stroma-derived defect in NF-kappaB2-/- mice causes impaired lymph node development and lymphocyte recruitment.</a> J. Immunol. 173, 2271-2279 (2004).</li>
<li>White, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+a-dependent+and+-independent+signals+regulate+stromal+organizer+cell+homeostasis+during+lymph+node+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin a-dependent and -independent signals regulate stromal organizer cell homeostasis during lymph node organogenesis.</a> Blood. 110, 1950-1959 (2007).</li>
<li>Benezech, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin-beta+receptor+signaling+through+NF-kappaB2-RelB+pathway+reprograms+adipocyte+precursors+as+lymph+node+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin-beta receptor signaling through NF-kappaB2-RelB pathway reprograms adipocyte precursors as lymph node stromal cells.</a> Immunity. 37, 721-734 (2012).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J. Vis. Exp. (9), e404(2007).</li>
<li>Krautler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+dendritic+cells+emerge+from+ubiquitous+perivascular+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Follicular dendritic cells emerge from ubiquitous perivascular precursors.</a> Cell. 150, 194-206 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste artigo apresentamos um método para testar e quantificar a contribuição das células progenitoras do tecido adiposo para o desenvolvimento de LNs e duas técnicas que permitem a análise de sua progênie. Dissecção de almofadas de gordura embrionárias e recém-nascidos Os LNs são delicados e requerem habilidades manuais adquiridas por muita prática antes da geração da quimera real da almofada de gordura LN. Para controlar a qualidade das dissecções, a análise por citometria de fluxo pode ser realizada nas bolsas de gordu...

Os linfonodos (LNs) são órgãos-chave do sistema imunológico situados em locais estratégicos do corpo, ao longo da rede de vasculatura linfática. Eles permitem a filtração de antígenos e patógenos e fornecem um local para apresentação de antígenos aos linfócitos e indução de respostas imunes adaptativas. O estroma, que forma a estrutura básica do LN e orquestra o movimento dos diferentes participantes hematopoiéticos da resposta imune adaptativa, é central para a função desses órgãos. Diferentes populações de células estromais fornecem pistas essenciais e específicas para os movimentos, localização, sobrevivência, proliferação e maturação do componente hematopoiético do sistema imunológico1-3. As células estromais LN adultas se enquadram em três categorias: as células endoteliais do sangue, as células endoteliais linfáticas e os fibroblastos. Essas três categorias abrangem populações heterogêneas. As populações fibroblásticas contêm células reticulares fibroblásticas (CRF), células dendríticas foliculares (FDC), células reticulares marginais (MRC), enquanto os fibroblastos formam a cápsula, a medula e outras células ainda nãoidentificadas1-5. As origens e os mecanismos que governam a maturação das diferentes populações de células estromais LN não são claros e a ausência de marcadores específicos que permitam o mapeamento do destino de populações específicas de células estromais LN torna seu estudo particularmente difícil. No entanto, uma compreensão completa da ontogenia das células estromais LN é necessária para a compreensão das respostas imunes adaptativas, os mecanismos que contribuem para a tolerância e está na base do desenvolvimento de LNs artificiais.
Até agora, o estudo da origem e desenvolvimento das células estromais LN tem sido limitado principalmente à avaliação direta do desenvolvimento da LN em embriões e recém-nascidos em camundongos selvagens e diferentes linhagens de camundongos knockout6-9. Essas abordagens são limitadas pela letalidade embrionária e perinatal de algumas das cepas de camundongos portadoras de deleções em genes importantes para o desenvolvimento de LN. Além disso, alguns dos genes essenciais para o desenvolvimento do tecido linfóide também estão envolvidos em uma ampla gama de processos biológicos, como é o caso do RANK10-11 ou NF-κB212. Para resolver essas questões, o isolamento e o transplante de LNs embrionários sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiroforam realizados 12-13. Essa técnica permite, por exemplo, a transferência de LNs embrionários geneticamente modificados em um ambiente selvagem para avaliar o desenvolvimento de órgãos e o recrutamento e organização de células hospedeiras. No entanto, o crescimento de LN embrionário enxertado sob a cápsula renal de um hospedeiro adulto é prejudicado, limitando assim o uso dessa técnica.
LNs e depósitos de gordura estão anatomicamente intimamente associados e se desenvolvem simultaneamente durante a embriogênese. Recentemente, demonstramos que a associação LN/tecido adiposo desempenha um papel crucial no fornecimento de progenitores de células estromais para os LNs. Em particular, a sinalização através do LTβR controla o destino das células precursoras de adipócitos, bloqueando a adipogênese e, em vez disso, promovendo a maturação em direção a um fenótipo de célula estromal LN14. Aqui descrevemos um método baseado na geração de quimeras de almofada de gordura LN permitindo o rastreamento de células derivadas do tecido adiposo no LN em desenvolvimento. Este método será útil para determinar a contribuição dos tecidos adiposos para diferentes populações de células estromais LN e combinado com o uso de tecidos de linhagens de camundongos geneticamente modificados, permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos que controlam a diferenciação dos diferentes subconjuntos de células estromais LN.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Placa de Petri Esterilizada</td><td>Appleton Woods</td><td>SC265</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Placa de Petri Esterilina</td><td>Appleton Woods</td><td>SC260</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas adesivas</td><td>Surgipath</td><td>00202</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31 eFluor 450 eBioscience</td><td></td><td>48-0311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD4 Alexa 647</td><td>eBioscience</td><td>51-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgM Rodamina Vermelha</td><td>Stratech</td><td>715-296-020-JIR</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Podoplanina PE / Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127411</td><td></td></tr><tr><td>Podoplanina Anti-rato purificada</td><td>eBioscience</td><td>14-5381</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase D</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11088858001</tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps Inox Biologie</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Pinça extra fina para dissecções embrionárias e neonatais</td></tr><tr><td>Solução EDTA 0,5 M</td><td>Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>ERTR-7</td><td>Biogênese</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de íris fina endurecida reta 11 cm</td><td>FST</td><td>14090-11</td><td>Tesoura pequena para dissecção</td></tr><tr><td>Solução HEPES</td> Filtros de membrana de isóporos <td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>0,8 &mu; m ATTP</td><td>Millipore</td><td>ATTPO 1300</td><td></td></tr><tr><td>Solução de L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de plástico com tampa</td><td>Watkins e Doncaster</td><td>E6052</td><td>Caixa de sanduíche para cultura de órgãos in vitro. Faça dois furos na tampa para permitir a troca gasosa na incubadora CO2.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas Vulkan Underwrap</td><td>Patterson Medical</td><td>004383</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>LEICA MZ95</td><td>Microscópio de dissecação com zoom</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5436</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Meio de montagem com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de quimeras de almofada de gordura de linfonodo para o estudo da origem das células estromais de linfonodos

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

O estroma é um componente-chave da estrutura e função dos linfonodos. No entanto, pouco se sabe sobre sua origem, composição celular exata e os mecanismos que regem sua formação. Os linfonodos estão sempre encapsulados no tecido adiposo e recentemente demonstramos a importância dessa relação para a formação do estroma linfonodal. As células precursoras de adipócitos migram para o linfonodo durante seu desenvolvimento e, após o envolvimento do receptor de linfotoxina-b, desligam a adipogênese e se diferenciam em células estromais linfóides (Bénézech et al.14). Com base no potencial do estroma linfóide do tecido adiposo, apresentamos um método usando uma quimera de linfonodo/almofada de gordura que permite o rastreamento da linhagem de precursores de células estromais de linfonodos. Mostramos como isolar os gânglios linfáticos do recém-nascido e o tecido adiposo embrionário EYFP+ e fazer uma quimera de almofada de gordura LN/EYFP+. Após a transferência sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro, o linfonodo incorpora células precursoras locais do tecido adiposo e termina sua formação. A análise da progênie de células do coxim adiposo EYFP+ nos linfonodos resultantes pode ser realizada por análise por citometria de fluxo de linfonodos digeridos enzimaticamente ou por análise de imunofluorescência de criossecções de linfonodos. Ao usar almofadas de gordura de diferentes modelos de camundongos knockout, este método fornecerá uma maneira eficiente de analisar a origem das diferentes populações de células estromais de linfonodos.

Três semanas após o transplante, a quimera de GL/gordura é recuperada do rim. A quimera agora é muito semelhante a um GL normal em seu próprio tecido adiposo, e o GL é visível no centro do tecido adiposo (Figura 1). Se o GL não puder ser identificado, é possível que tenha sido perdido durante o transplante no rim. Ao avaliar o papel de genes potencialmente importantes no desenvolvimento do GL, os GLs recuperados podem permanecer muito pequenos e mais difíceis de encontrar. Esse é o caso quando o tecido a...

A geração de quimeras de linfonodos/fat pad para o estudo da origem das células estromais dos linfonodos é descrita. O método envolve o isolamento de linfonodos de camundongos recém-nascidos e bolsas de gordura embrionárias, a geração de bolsas de gordura quiméricas para linfonodos e sua transferência sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro.

Geração de Quimeras de Almofada de Gordura de Linfonodo para o Estudo da Origem das Células Estromais de Linfonodos

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar uma quimera de coxim adiposo de linfonodo para avaliar a contribuição do tecido adiposo na formação da estroma dos linfonodos. Isso é realizado primeiramente isolando linfonodos de camundongos recém-nascidos e coxins adiposos de embriões de camundongos no dia 18,5. O linfonodo é removido do coxim adiposo embrionário e substituído pelo linfonodo de camundongo recém-nascido.A quimera do coxim adiposo linfático é montada pela reassociação e posterior cultivo de um linfonodo de recém-nascido com um coxim adiposo embrionário in vitro. A seguir, a quimera é enxertada sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro. Três semanas após o transplante, o rim é coletado e a quimera é recuperada.No fim das contas, a contribuição de células derivadas do tecido adiposo para o estroma do linfonodo pode ser avaliada por meio de análise citométrica de fluxo e microscopia de imunofluorescência. Assim, tivemos inicialmente a ideia deste método quando estávamos procurando uma maneira de avaliar se células do tecido adiposo estavam contribuindo para a formação dos linfonodos. Para isolar linfonodos inguinais de recém-nascidos, após seccionar a cabeça, use uma tesoura para abrir o corpo do animal desde o topo da região torácica até a parte inferior do abdômen.Após remover cuidadosamente todas as vísceras da cavidade abdominal, coloque o corpo em uma placa de Petri de 90 milímetros contendo meio RF 10. Coloque a placa em uma cabine de cultura estéril e, em seguida, transfira o corpo para uma nova placa de Petri estéril de 90 milímetros contendo RF 10 fresco. Em seguida, desprenda cuidadosamente o peritônio da pele na região inguinal e localize os linfonodos inguinais situados na interseção de três vasos sanguíneos no tecido adiposo.Remova cuidadosamente os linfonodos, certificando-se de que todo o tecido adiposo seja retirado. Em seguida, coloque os linfonodos em uma placa de Petri de 50 milímetros contendo meio RF 10 sobre gelo para isolar os coxins adiposos inguinais de embriões do dia 18,5. Após remover as vísceras conforme demonstrado, lave os corpos em PBS estéril para eliminar todos os vestígios de sangue.Transfira os corpos limpos para uma nova placa de Petri de 90 milímetros e, em seguida, desprenda o peritônio, localize o linfonodo inguinal e remova-o conforme demonstrado anteriormente. Descarte o tecido isolado. Tenha cuidado para remover todo o linfonodo, evitando a contaminação do quimera do coxim adiposo.Em seguida, remova o coxim de gordura inguinal e coloque-o em uma placa de Petri de 50 milímetros contendo meio RF 10 sobre gelo. Para montar o sistema de cultura de órgãos in vitro, primeiro corte o Vulcan sob filme em pedaços de um a 1,5 centímetro quadrado. Em seguida, ferva as esponjas por duas horas e os filtros por 20 minutos em água destilada e deixe-os secar por várias horas em uma cabine de cultura celular.Uma vez que os materiais estejam secos, coloque uma esponja em cada placa de Petri de 50 milímetros contendo dois mililitros de meio. Mergulhe cada esponja no meio para umedecer ambos os lados e, em seguida, posicione um filtro por sistema de cultura de órgãos in vitro na interface líquido-ar. Em seguida, reassocie cuidadosamente uma almofada adiposa embrionária com um linfonodo recém-nascido diretamente na parte superior de cada filtro.Transfira as placas de Petri para uma caixa plástica retangular com água no fundo e furos na tampa. Fixe a tampa à caixa com fita adesiva, mantendo os furos abertos. Em seguida, coloque a caixa em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de CO₂.Deixe a caixa equilibrar por duas horas e, em seguida, feche os orifícios na tampa com fita adesiva. Incube os tecidos por pelo menos dois dias para permitir que os linfonodos se fixem aos coxins de gordura antes da transferência sob a cápsula renal, três a quatro semanas após o transplante. Isole cada quimera de linfonodo e coxim de gordura em cada rim e dissecione os linfonodos.Em seguida, para cada linfonodo, utilize uma pequena tesoura para fazer um único corte no tecido, facilitando a digestão enzimática. Em seguida, coloque um linfonodo em cada tubo individual de 1,5 mililitro contendo 600 microlitros de solução de digestão. Incube os tubos por 30 minutos a 37 graus Celsius em um bloco térmico agitador, pipetando para cima e para baixo a cada 10 minutos para auxiliar na dissociação do tecido.Em seguida, adicione seis microlitros de EDTA aos tubos e triture a suspensão celular algumas vezes para finalizar a dissociação. As células podem então ser coradas com os anticorpos de interesse desejados e analisadas por citometria de fluxo para preservar a expressão da proteína fluorescente amarela melhorada ou EYFP. Fixe os linfonodos por três a quatro horas.Em seguida, para cada linfonodo, coloque uma única gota de composto OCT frio sobre um pequeno pedaço de papel de alumínio. Evitando bolhas de ar, posicione cuidadosamente um linfonodo no centro de cada gota e, então, coloque o papel de alumínio sobre gelo seco para congelar os tecidos. Os linfonodos podem então ser seccionados, corados e analisados por microscopia de fluorescência.O cuidado no isolamento do linfonodo permite uma análise adicional da linhagem de células derivadas do tecido adiposo positivas para EYFP. Cortes criogênicos e análise por imunofluorescência do linfonodo revelam que as células derivadas do tecido adiposo positivas para EYFP migram para o interior do linfonodo, onde contribuem para a rede de células estromais GP38 positivas e ERTR7 positivas. A análise por citometria de fluxo confirma que uma fração significativa das células estromais do linfonodo deriva de células precursoras locais do tecido adiposo positivas para EYFP, contribuindo com 30% para a fração fibroblástica CD45 negativa, GP38 positiva, CD31 negativa, e com 10% para a fração de células endoteliais sanguíneas CD45 negativa, GP38 negativa, CD31 positiva. Até 80% da fração fibroblástica CD45 negativa, GP38 positiva, CD31 negativa pode originar-se de células precursoras do tecido adiposo, demonstrando o papel crucial desempenhado pelo tecido adiposo na manutenção do crescimento do estroma linfático. Assim, após dominar esta técnica, um pesquisador na área de organogênese linfóide poderá explorar o papel de diferentes moléculas envolvidas na formação dos tecidos linfoides.

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Research

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Produção de Quimera de Nódulo Linfático-Almofada de Gordura para o Estudo da Origem das Células Estromais dos Nódulos Linfáticos

Neste vídeo a preparação de 2-dGuo tratados reaggregate culturas timo é demonstrada.

Reaggregate Culturas Thymus

O isolamento de células estromais de linfonodos é um procedimento de várias etapas, incluindo digestão enzimática e desagregação mecânica para obter células reticulares fibroblásticas, células linfáticas e endoteliais sanguíneas. No procedimento descrito, uma digestão curta é combinada com desagregação mecânica automatizada para minimizar a degradação do marcador de superfície das células estromais viáveis dos linfonodos.

Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

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Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

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Agregação celular encapsulada da matriz da membrana basal para investigação da formação do tecido do baço murino

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