Geração de Quimeras de Almofada de Gordura de Linfonodo para o Estudo da Origem das Células Estromais de Linfonodos

O objetivo geral deste procedimento é gerar uma quimera de almofada de gordura linfonodal para avaliar a contribuição do tecido adiposo para a formação do estroma dos gânglios linfáticos. Isso é feito primeiro isolando os gânglios linfáticos de camundongos recém-nascidos e as bolsas de gordura dos embriões de camundongos do dia 18,5. O linfonodo é removido da almofada de gordura embrionária e substituído pelo linfonodo recém-nascido.

A quimera da almofada de gordura do linfonodo é montada reassociando e depois cultivando um linfonodo recém-nascido com uma almofada de gordura embrionária in vitro. A quimera é então enxertada sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro. Três semanas após o transplante, o rim é colhido e a quimera é recuperada.

Em última análise, a contribuição das células derivadas do coxim de gordura para o estroma do linfonodo pode ser avaliada por citometria de fluxo e análise microscópica de imunofluorescência. Então, tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos procurando uma maneira de avaliar se as células da almofada de gordura estão contribuindo para a formação dos gânglios linfáticos para isolar os linfonodos inguinais recém-nascidos. Depois de seccionar a cabeça, use uma tesoura para abrir o corpo do animal do topo da região torácica até a parte inferior do abdômen.

Depois de remover cuidadosamente todas as vísceras da cavidade abdominal, coloque o corpo em uma placa de Petri de 90 milímetros contendo meio RF 10. Coloque o prato em uma capa de cultura de tecidos estéril e, em seguida, transfira o corpo para uma nova placa de Petri estéril de 90 milímetros contendo RF 10 fresco. Em seguida, descole cuidadosamente o peritônio da pele na região inguinal e localize os gânglios linfáticos inguinais situados na interseção de três vasos sanguíneos na almofada de gordura.

Remova cuidadosamente os gânglios linfáticos, certificando-se de que todo o tecido adiposo seja removido. Em seguida, coloque os gânglios linfáticos em uma placa de Petri de 50 milímetros contendo meio RF 10 no gelo para isolar as bolsas de gordura inguinais dos embriões do dia 18,5. Depois de remover as vísceras como acabamos de demonstrar, lave os corpos em PBS estéril para eliminar todos os vestígios de sangue.

Transfira os corpos limpos para uma placa de Petri fresca de 90 milímetros e, em seguida, retire o peritônio, localize o linfonodo inguinal e remova-o como acabamos de demonstrar. Descarte o tecido isolado. Tome cuidado para remover todo o linfonodo para evitar a contaminação da quimera da almofada de gordura.

Em seguida, remova a almofada de gordura inguinal e coloque-a em uma placa de Petri de 50 milímetros contendo meio RF 10 no gelo. Para configurar o sistema de cultura de órgãos in vitro, primeiro corte um pouco de Vulcano em pedaços de um a 1,5 centímetro quadrado. Em seguida, ferva as esponjas por duas horas e os filtros por 20 minutos em água destilada e deixe-os secar por várias horas em uma capa de cultura de células.

Quando os materiais estiverem secos, coloque uma esponja em uma placa de Petri de 50 milímetros contendo dois mililitros de mídia. Mergulhe cada esponja no meio para molhar ambos os lados e, em seguida, coloque um filtro por sistema de cultura de órgãos in vitro na interface líquido-ar. Em seguida, reassocie cuidadosamente uma almofada de gordura embrionária a um linfonodo recém-nascido diretamente na parte superior de cada filtro.

Transfira as placas de Petri para uma caixa de plástico retangular com água no fundo e orifícios na tampa. Cole a tampa na caixa deixando os orifícios abertos. Em seguida, coloque a caixa em uma incubadora de cultura de células de 37 graus Celsius 5% CO2.

Deixe a caixa se equilibrar por duas horas e, em seguida, sele os orifícios da tampa com fita adesiva. Incube os tecidos por pelo menos dois dias para permitir que os gânglios linfáticos se fixem nas bolsas de gordura antes da transferência sob a cápsula renal, três a quatro semanas após o transplante. Isole cada quimera da almofada de gordura do linfonodo dentro de cada rim e disseque os gânglios linfáticos.

Em seguida, para cada linfonodo, use uma pequena tesoura para fazer uma única incisão no tecido para ajudar na digestão enzimática. Em seguida, coloque um linfonodo em tubos individuais de 1,5 mililitro contendo 600 microlitros de tampão de digestão. Incube os tubos por 30 minutos a 37 graus Celsius em um bloco térmico agitador, pipetando para cima e para baixo a cada 10 minutos para ajudar a dissociar o tecido.

Em seguida, adicione seis microlitros de EDTA aos tubos e triture a suspensão celular algumas vezes para terminar a dissociação. As células podem então ser coradas com os anticorpos desejados de interesse e analisadas por citometria de fluxo para preservar a expressão aprimorada da proteína fluorescente amarela ou EYFP. Fixe os gânglios linfáticos por três a quatro horas.

Em seguida, para cada linfonodo, coloque uma única gota de composto OCT frio em um pequeno pedaço de papel alumínio. Evitando bolhas de ar, coloque cuidadosamente um linfonodo no meio de cada gota e, em seguida, coloque a folha em gelo seco para congelar os tecidos. Os linfonodos podem então ser seccionados, corados e analisados por microscopia fluorescente.

P O isolamento cuidadoso do linfonodo permite uma análise mais aprofundada da progênie de células derivadas de tecido adiposo positivas para EYFP. A análise criogênica e imunofluorescente do linfonodo revela que as células derivadas do tecido adiposo positivo para EYFP migram para o linfonodo, onde contribuem para o fluxo da rede de células estromais do linfonodo positivo GP 38 positivo E RTR sete linfonodos positivos A análise citométrica confirma que uma fração importante das células estromais do linfonodo deriva de células progenitoras locais do tecido adiposo positivo para EYFP, contribuindo para 30% do CD 45 negativo G 38 positivo CD 31 negativo FIBROBLÁSTICO fração e 10% da fração fibroblástica negativa de CD 45 negativa GP 38 negativa CD 31 positiva até 80% da fração fibroblástica negativa de CD 45, negativa G 38 positiva CD 31 negativa podem ser derivadas de células precursoras do tecido adiposo, demonstrando o papel crucial desempenhado pelo tecido adiposo na sustentação do crescimento do estroma linfonodal. Então, uma vez que dominou esta técnica com um pesquisador na área de organogênese linfóide para explorar o papel de diferentes moléculas envolvidas no trauma linfóide.