Geração de Quimeras de Almofada de Gordura de Linfonodo para o Estudo da Origem das Células Estromais de Linfonodos

O objetivo geral deste procedimento é gerar uma quimera de coxim adiposo de linfonodo para avaliar a contribuição do tecido adiposo na formação da estroma dos linfonodos. Isso é realizado primeiramente isolando linfonodos de camundongos recém-nascidos e coxins adiposos de embriões de camundongos no dia 18,5. O linfonodo é removido do coxim adiposo embrionário e substituído pelo linfonodo de camundongo recém-nascido.

A quimera do coxim adiposo linfático é montada pela reassociação e posterior cultivo de um linfonodo de recém-nascido com um coxim adiposo embrionário in vitro. A seguir, a quimera é enxertada sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro. Três semanas após o transplante, o rim é coletado e a quimera é recuperada.

No fim das contas, a contribuição de células derivadas do tecido adiposo para o estroma do linfonodo pode ser avaliada por meio de análise citométrica de fluxo e microscopia de imunofluorescência. Assim, tivemos inicialmente a ideia deste método quando estávamos procurando uma maneira de avaliar se células do tecido adiposo estavam contribuindo para a formação dos linfonodos. Para isolar linfonodos inguinais de recém-nascidos, após seccionar a cabeça, use uma tesoura para abrir o corpo do animal desde o topo da região torácica até a parte inferior do abdômen.

Após remover cuidadosamente todas as vísceras da cavidade abdominal, coloque o corpo em uma placa de Petri de 90 milímetros contendo meio RF 10. Coloque a placa em uma cabine de cultura estéril e, em seguida, transfira o corpo para uma nova placa de Petri estéril de 90 milímetros contendo RF 10 fresco. Em seguida, desprenda cuidadosamente o peritônio da pele na região inguinal e localize os linfonodos inguinais situados na interseção de três vasos sanguíneos no tecido adiposo.

Remova cuidadosamente os linfonodos, certificando-se de que todo o tecido adiposo seja retirado. Em seguida, coloque os linfonodos em uma placa de Petri de 50 milímetros contendo meio RF 10 sobre gelo para isolar os coxins adiposos inguinais de embriões do dia 18,5. Após remover as vísceras conforme demonstrado, lave os corpos em PBS estéril para eliminar todos os vestígios de sangue.

Transfira os corpos limpos para uma nova placa de Petri de 90 milímetros e, em seguida, desprenda o peritônio, localize o linfonodo inguinal e remova-o conforme demonstrado anteriormente. Descarte o tecido isolado. Tenha cuidado para remover todo o linfonodo, evitando a contaminação do quimera do coxim adiposo.

Em seguida, remova o coxim de gordura inguinal e coloque-o em uma placa de Petri de 50 milímetros contendo meio RF 10 sobre gelo. Para montar o sistema de cultura de órgãos in vitro, primeiro corte o Vulcan sob filme em pedaços de um a 1,5 centímetro quadrado. Em seguida, ferva as esponjas por duas horas e os filtros por 20 minutos em água destilada e deixe-os secar por várias horas em uma cabine de cultura celular.

Uma vez que os materiais estejam secos, coloque uma esponja em cada placa de Petri de 50 milímetros contendo dois mililitros de meio. Mergulhe cada esponja no meio para umedecer ambos os lados e, em seguida, posicione um filtro por sistema de cultura de órgãos in vitro na interface líquido-ar. Em seguida, reassocie cuidadosamente uma almofada adiposa embrionária com um linfonodo recém-nascido diretamente na parte superior de cada filtro.

Transfira as placas de Petri para uma caixa plástica retangular com água no fundo e furos na tampa. Fixe a tampa à caixa com fita adesiva, mantendo os furos abertos. Em seguida, coloque a caixa em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de CO₂.

Deixe a caixa equilibrar por duas horas e, em seguida, feche os orifícios na tampa com fita adesiva. Incube os tecidos por pelo menos dois dias para permitir que os linfonodos se fixem aos coxins de gordura antes da transferência sob a cápsula renal, três a quatro semanas após o transplante. Isole cada quimera de linfonodo e coxim de gordura em cada rim e dissecione os linfonodos.

Em seguida, para cada linfonodo, utilize uma pequena tesoura para fazer um único corte no tecido, facilitando a digestão enzimática. Em seguida, coloque um linfonodo em cada tubo individual de 1,5 mililitro contendo 600 microlitros de solução de digestão. Incube os tubos por 30 minutos a 37 graus Celsius em um bloco térmico agitador, pipetando para cima e para baixo a cada 10 minutos para auxiliar na dissociação do tecido.

Em seguida, adicione seis microlitros de EDTA aos tubos e triture a suspensão celular algumas vezes para finalizar a dissociação. As células podem então ser coradas com os anticorpos de interesse desejados e analisadas por citometria de fluxo para preservar a expressão da proteína fluorescente amarela melhorada ou EYFP. Fixe os linfonodos por três a quatro horas.

Em seguida, para cada linfonodo, coloque uma única gota de composto OCT frio sobre um pequeno pedaço de papel de alumínio. Evitando bolhas de ar, posicione cuidadosamente um linfonodo no centro de cada gota e, então, coloque o papel de alumínio sobre gelo seco para congelar os tecidos. Os linfonodos podem então ser seccionados, corados e analisados por microscopia de fluorescência.

O cuidado no isolamento do linfonodo permite uma análise adicional da linhagem de células derivadas do tecido adiposo positivas para EYFP. Cortes criogênicos e análise por imunofluorescência do linfonodo revelam que as células derivadas do tecido adiposo positivas para EYFP migram para o interior do linfonodo, onde contribuem para a rede de células estromais GP38 positivas e ERTR7 positivas. A análise por citometria de fluxo confirma que uma fração significativa das células estromais do linfonodo deriva de células precursoras locais do tecido adiposo positivas para EYFP, contribuindo com 30% para a fração fibroblástica CD45 negativa, GP38 positiva, CD31 negativa, e com 10% para a fração de células endoteliais sanguíneas CD45 negativa, GP38 negativa, CD31 positiva. Até 80% da fração fibroblástica CD45 negativa, GP38 positiva, CD31 negativa pode originar-se de células precursoras do tecido adiposo, demonstrando o papel crucial desempenhado pelo tecido adiposo na manutenção do crescimento do estroma linfático. Assim, após dominar esta técnica, um pesquisador na área de organogênese linfóide poderá explorar o papel de diferentes moléculas envolvidas na formação dos tecidos linfoides.