Name: Coleta e identificação de helmintos da vida selvagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-14T20:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a coletar, preservar e identificar helmintos de vertebrados selvagens através de necropsia sistemática, extração de órgãos e técnicas de coloração. Este protocolo padronizado permite avaliar a diversidade parasitária em populações de vida silvestre.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Joe N. Caudell, biólogo de doenças do Programa de Serviços de Vida Selvagem APHIS do USDA de Indiana na Universidade de Purdue, por fornecer espécimes usados para a coleta de helmintos para a produção deste vídeo. Jennifer Serafin preparou todas as soluções químicas.

Os animais usados nos experimentos a seguir foram encontrados mortos como atropelamentos.
1. Necropsia Animal e Triagem de Órgãos Principais para Coleta de Helmintos
<ol>
	<li>Posicione o animal em uma superfície plana e examine todas as aberturas externas, incluindo orelhas, cavidade oral e olhos com uma lupa quanto à presença de nematóides (redondos) e trematódeos (planos e não segmentados) (ver Figura 1).</li>
	<li>Se estiver trabalhando com pássaros, lave com água da torneira para umedecer as penas antes de dissecar.</li>
	<li>Usando uma lâmina afiada ou faca e com o auxílio de um par de pinças de dissecação, faça uma incisão sobre a cavidade abdominal, tomando cuidado para não romper nenhum órgão. Para tartarugas com carapaça dura, use uma serra manual para cortar o osso na área da ponte entre os escudos peitorais e abdominais.</li>
	<li>Abra a cavidade torácica como acima; para animais grandes, cortadores de ossos ou uma pequena serra manual podem ser necessários para cortar as costelas.</li>
	<li>Se estiver trabalhando com pássaros, examine os sacos aéreos in situ antes de remover qualquer órgão. Use uma lupa, se necessário.</li>
	<li>Examine ambas as cavidades em busca de lombrigas filariais e trematódeos grandes.</li>
	<li>Antes de remover o trato gastrointestinal da cavidade abdominal, amarre um fio próximo ao início do esôfago e outro no final do intestino grosso (reto).</li>
	<li>Separe os seguintes órgãos torácicos em placas de Petri (ou bandejas de vidro, se os órgãos forem muito grandes) para exame ao microscópio estereoscópico (10-30X): coração e vasos sanguíneos principais, traqueia e pulmões.</li>
	<li>Remova o fígado, a vesícula biliar e o ducto, o pâncreas, o baço, os rins e a bexiga urinária e examine conforme descrito na etapa 1.8.</li>
	<li>Remova todo o sistema digestivo e coloque cada seção em pratos/bandejas de vidro.</li>
	<li>Após a remoção dos órgãos, lave a cavidade corporal com uma mangueira ou frasco de esguicho cheio de solução salina a 0,9% em uma peneira de malha de 106 μm e examine o conteúdo da peneira em um microscópio estéreo quanto à presença de vermes filariais ou trematódeos sanguíneos.</li>
	<li>Abra cada seção do trato digestivo com uma tesoura, raspe a mucosa e examine cuidadosamente a presença de parasitas grandes (>1 cm). Use uma lupa, se necessário. A tromba dos acantocéfalos geralmente está profundamente enraizada na parede do intestino e pode ter que ser cuidadosamente retirada do tecido com uma pinça e / ou uma pequena tesoura.</li>
	<li>Coloque cada seção aberta sob água corrente e lave todo o conteúdo em uma peneira de 106 μm conforme descrito na etapa 1.11.</li>
	<li>Abra o coração e os principais vasos sanguíneos (pulmonar e aorta), traqueia e vesícula urinária e biliar e examine o conteúdo da mesma maneira.</li>
	<li>Corte e separe órgãos sólidos, como pulmões, fígado, rins, baço e pâncreas, usando uma lâmina afiada e uma pinça. Lave-os em água corrente para uma peneira de 106 μm, conforme descrito na etapa 1.11.</li>
	<li>Registre os tipos de parasitas encontrados, o número de cada tipo e o(s) órgão(s) em que são encontrados. Os métodos de fixação e coloração estão listados abaixo.</li>
	<li>Rotule os frascos/frascos colocando um pequeno pedaço de um cartão de índice comum escrito com lápis (tinta e cartões de índice pautados "escorrerão" em amostras de álcool e manchas).</li>
</ol>
2. Preservação de helmintos
<ol>
	<li>Para helmintos que precisam ser preservados para estudos genéticos posteriores, coloque-os diretamente em etanol a 80-90% (sem glicerina). O etanol deve ser feito diluindo etanol a 95%, preferencialmente grau reagente (Tabela 1). Nunca permita que essas amostras sejam expostas à formalina, pois a formalina degrada o DNA a um estado inutilizável.</li>
	<li>Coloque trematódeos vivos em uma lâmina de microscópio de vidro em uma gota de solução salina, coloque uma lamínula de vidro e passe a lâmina sobre uma chama sem ferver a solução salina.
	<ol>
		<li>Solte a lâmina em uma placa de Petri contendo AFA (álcool-formalina-ácido acético, consulte a Tabela 1) e deixe a tampa flutuar.</li>
		<li>Fixe em AFA por um a vários dias, enxágue com água da torneira e transfira para frascos de vidro de 5 ml (ou frasco / frasco de vidro maior, dependendo do tamanho e da quantidade de parasitas) preenchidos com etanol a 70% para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fixe os trematódeos mortos em AFA ou formalina tamponada a 10% por 48 horas e, em seguida, transfira para frasco / frasco cheio de etanol a 70% para armazenamento de longo prazo.</li>
	<li>Relaxe os cestóides vivos em uma placa de Petri despejando água quase fervente sobre eles e, em seguida, transfira para um frasco / frasco cheio de etanol a 70% para armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Relaxe os acantocéfalos vivos colocando em uma placa de Petri por uma a várias horas em água da torneira na geladeira (~ 4 ° C) até que a tromba esteja totalmente evertida (isso pode levar até 24 horas). Transfira para frasco/frasco cheio de etanol 70% ou AFA para armazenamento de longo prazo.</li>
	<li>Trate cestóides e acantocéfalos mortos da mesma forma que trematódeos mortos (veja acima).</li>
	<li>Mate os nematóides vivos pequenos (<5 mm) ou frágeis (por exemplo, tricostrongilídeos, capilarídeos) em etanol a 70% quente (quase em ebulição) e conserve em frasco/frasco cheio de etanol a 70% com glicerina a 5% (Tabela 1) adicionada para preservar os vermes em caso de evaporação.</li>
	<li>Mate (e limpe) nematóides médios a grandes (>5 mm) (por exemplo, ascarídeos, espiurídeos, oxiurídeos, filarídeos) colocando em uma placa de Petri com ácido acético glacial frio (Tabela 1) e após 15 minutos transfira para frasco / frasco cheio de etanol a 70% e glicerina a 5%. O ácido acético pode ser usado repetidamente dessa maneira.</li>
	<li>Coloque os nematóides mortos diretamente em frasco/frasco cheio de etanol a 70% e glicerina a 5%.</li>
</ol>
3. Identificação taxonômica de helmintos
<ol>
	<li>Prepare a hematoxilina de Harris dissolvendo a hematoxilina em álcool e dissolvendo o sulfato de alumínio e amônio em água com calor. Misture as duas soluções e leve para ferver.
	<ol>
		<li>Adicione iodato de sódio e ferva por 2-3 min. Solução de filtro (papel de filtro 541) depois de voltar à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cubra trematódeos, cestóides e acantocéfalos, deixando-os em hematoxilina de Harris diluída (1:10) ou carmim de Semichon durante a noite (ver Tabela 1).
	<ol>
		<li>Remova a coloração com etanol ácido a 70% até que os órgãos fiquem visíveis (pode levar de alguns segundos a mais de uma hora e deve ser observado de perto).</li>
		<li>Interrompa a descoloração transferindo amostras para etanol básico a 70% por pelo menos 30 min. Em seguida, desidrate-os em uma série de etanoles graduados (80%, 95%, 100%) e limpe-os em xileno ou salicilato de metila.</li>
		<li>Monte as amostras em uma lâmina de microscópio depois de adicionar uma gota de bálsamo do Canadá e uma lamínula. Deixe secar durante a noite.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Limpe nematóides e acantocéfalos pequenos a médios por 15-30 min em montagens temporárias de lactofenol em uma lâmina de microscópio com uma lamínula.
	<ol>
		<li>Use fenol a 80% por até 60 min para nematóides grandes (ascarídeos e espirúridos) e acantocéfalos. Examine sob um microscópio óptico (40-400X) para avaliação de estruturas menores (espículas e ganchos masculinos).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Use as seguintes abordagens para examinar estruturas especiais.
	<ol>
		<li>Para cestóides, corte o escólex e coloque em uma lâmina de microscópio lactofenol e "abóbora" com uma lamínula para medir e contar ganchos roestelares (ver Figura 1B).</li>
		<li>Para nematóides, corte a extremidade anterior e monte em uma lâmina de microscópio em algumas gotas de lactofenol (sem lamínula) ou em geléia de glicerina para uma montagem permanente (com lamínula) e observe as peças bucais sob um microscópio de luz (35-400X) (ver Figura 1D).</li>
		<li>Corte as caudas de nematóides grandes e monte em uma lâmina de microscópio em lactofenol com uma lamínula para observar as papilas ventrais e a morfologia da espícula dos machos sob um microscópio óptico (ver Figura 1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identifique parasitas para espécies usando uma combinação de literatura primária e referências taxonômicas padrão, como:
	<ol>
		<li>Trematódeos: Yamaguti (1958, 1971)3,4 e Gibson et al. 5-7</li>
		<li>Acantocéfalos: Yamaguti8</li>
		<li>Cestodes: Yamaguti9, Schmidt10 e Khalil et al. 11</li>
		<li>Nematóides: Yamaguti12 e Anderson et al. 13</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Depositário de Helmintos na Coleção Nacional de Parasitas dos EUA
<ol>
	<li>Deposite espécimes representativos de helmintos na Coleção Nacional de Parasitas dos EUA (USNPC). Isso é obrigatório para a maioria dos diários de parasitas. Após a submissão, cada espécie de helmintos recebe um número de acesso para inclusão nos manuscritos.</li>
	<li>Inclua as seguintes informações ao enviar amostras: 1) Nome científico do parasita; 2) informações do hospedeiro (espécies, coordenadas de longitude/latitude ou localização geográfica); 3) órgão encontrado no hospedeiro; 4) nome de quem coletou os espécimes e data da coleta; 5) tipo de fixador, mancha ou meio de limpeza/montagem utilizado; 6) localização de outras coleções (números de museu e acesso) se espécimes adicionais forem enviados em outro lugar; e 7) informações sobre publicação e periódico. Esses dados também devem ser enviados junto com as amostras e em capa separada.</li>
	<li>Embale as amostras em recipientes fortes com material absorvente à prova de choque. Tape / Parafilm tampas de rosca em frascos de vidro e coloque cada frasco em um saco plástico separado. Embrulhe as lâminas em papel e coloque em uma caixa de lâminas com material absorvente de choque entre elas.</li>
	<li>Envie amostras e carta separada com informações sobre amostras para: U.S. National Parasite Collection, USDA, ARS, ANRI, Bldg. 1180, BARC-East, 10300 Baltimore Avenue, Beltsville, MD 20705-2350.</li>
</ol>

<ol><li>Atkinson, C. T., Thomas, N. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtkinson%2C+CT+%22Parasitic+Diseases+of+Wild+Birds%22">Parasitic Diseases of Wild Birds</a>. Hunter, D. B. , John Wiley & Sons, Blackwell Press. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Parasitic+Diseases+of+Wild+Mammals%22">Parasitic Diseases of Wild Mammals</a>. Samuel, W. M., Pybus, M. J., Kocan, A. A. , Second Edition, Iowa State University Press. Ames, Iowa, USA. (2001).</li>
<li>Yamaguti, S. Parts 1 and 2. The Digenetic Trematodes of Vertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYamaguti%2C+S+%22Systema+Helminthum%22">Systema Helminthum</a>. I, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1958).</li>
<li>Yamaguti, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYamaguti%2C+S+%22Synopsis+of+Digenetic+Trematodes+of+Vertebrates%22">Synopsis of Digenetic Trematodes of Vertebrates</a>. I and II, Keigaku Publishing Company. Tokyo, Japan. (1971).</li>
<li>Gibson, D. I., Jones, A., Bray, R. A. Keys to the Trematoda. 1, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2002).</li>
<li>Jones, A., Bray, R. A., Gibson, D. I. Keys to the Trematoda. 2, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2005).</li>
<li>Bray, R. A., Gibson, D. I., Jones, A. Keys to the Trematoda. 3, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2008).</li>
<li>Yamaguti, S. Acanthocephala of Vertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYamaguti%2C+S+%22Systema+Helminthum%22">Systema Helminthum</a>. V, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1963).</li>
<li>Yamaguti, S. The Cestodes of Vertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYamaguti%2C+S+%22Systema+Helminthum%22">Systema Helminthum</a>. II, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1959).</li>
<li>D, G. Keys to the Cestode Parasites of Vertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aD%2C+G+%22CRC+Handbook+of+Tapeworm+Identification%22">CRC Handbook of Tapeworm Identification</a>. , CRC Press Inc. Boca Raton, Florida, USA. (1986).</li>
<li>Khalil, L. F., Jones, A., Bray, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhalil%2C+LF+%22Keys+to+the+Cestode+Parasites+of+Vertebrates%22">Keys to the Cestode Parasites of Vertebrates</a>. , CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (1994).</li>
<li>Yamaguti, S. The Nematodes of Vertebrates. Parts 1 and 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYamaguti%2C+S+%22Systema+Helminthum%22">Systema Helminthum</a>. III, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1961).</li>
<li>Anderson, R. C., Chabaud, A. G., Willmott, S. Keys to the Nematode Parasites of Vertebrates: Archival Volume (Nos). 1-10. , CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2009).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar

É extremamente difícil identificar parasitas helmínticos, mesmo para gênero, com base em material pobre. Cestóides e trematódeos, em particular, tendem a morrer e se deteriorar rapidamente após a morte do hospedeiro. A taxonomia dos cestóides depende muito do número, tamanho e forma dos ganchos rostelares, que muitas vezes se perdem no material congelado. O mesmo se aplica a certos trematódeos com espinhos ao redor da ventosa oral, como equinostomas e heterofídeos, que também são freqüentemente perdidos. Por causa de sua...

Os vertebrados são parasitados por quatro grupos principais de helmintos (vermes). Dois dos grupos, trematódeos, ou vermes, e cestóides, ou tênias, se enquadram no filo Platyhelminthes. Os outros dois grupos são os nematóides, ou lombrigas, (Nematoda) e os acantocéfalos, ou vermes de cabeça espinhosa (Acanthocephala). Muitos desses parasitas têm sido documentados como causas de morbidade e mortalidade em aves e mamíferos silvestres1,2.
A maioria dos helmintos tem ciclos de vida complexos envolvendo mais de um hospedeiro1,2 . Por exemplo, os trematódeos têm um ou dois hospedeiros intermediários (geralmente invertebrados) e um hospedeiro final. Todos os hospedeiros precisam estar disponíveis para que o ciclo seja concluído e, portanto, para que os helmintos adultos estejam presentes nos hospedeiros finais (que são o tópico deste manuscrito). Portanto, é importante ter em mente que podem ocorrer flutuações sazonais na prevalência e intensidade de algumas espécies de helmintos e o monitoramento de longo prazo é desejável para capturar o helmintos completos de auna de um hospedeiro específico.
O método ideal para coletar helmintos é examinar um hospedeiro que foi sacrificado. Isso permite a coleta de helmintos enquanto ainda estão vivos e seu relaxamento e fixação adequados. O material de hospedeiros que estão mortos há mais de 24 horas, ou que foram congelados e descongelados para exame, geralmente é inferior e difícil de identificar. Trematódeos e cestóides de hospedeiros congelados ou formalizados são frequentemente muito contraídos e perderam estruturas cruciais para a identificação, como espinhos orais em trematódeos ou ganchos no escólex de tênias. No entanto, a realidade é que a maior parte do material disponível de hospedeiros vertebrados hoje em dia é congelado ou preservado.
Bancos de dados contendo informações de sequência de DNA para helmintos estão crescendo rapidamente e, portanto, a identificação taxonômica já é possível para muitas espécies. Portanto, os helmintos devem ser preservados para possíveis análises de DNA, tanto quanto possível. No entanto, o DNA de boa qualidade não é possível se as amostras forem fixadas em formalina. Os métodos descritos aqui para coletar e matar helmintos produzirão material adequado para extração de DNA e análises genéticas.
Abaixo, descrevemos métodos detalhados sobre como necropsiar vertebrados (anfíbios, répteis, aves e mamíferos; trematódeos monogênicos de peixes não estão incluídos) para a coleta de helmintos, seguidos de procedimentos sobre como preservá-los e processá-los para identificação taxonômica.

<table><tbody><tr><td><forte>Fixação</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Álcool-Formalina-Ácido Acético (AFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A407-1 (etanol) F75F-1GAL (formaldeído) BP2401500 (ácido acético glacial)</td><td>Etanol 85% (85 ml) + formaldeído 37% (10 ml) + ácido acético glacial (5 ml)</td></tr><tr><td>Etanol para abate e preservação a longo prazo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A407-1</td><td>Etanol 100% (70 ml) + água destilada (30 ml)</td></tr><tr><td>Etanol para fixação e estudos de DNA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0010</td><td>Etanol 80-90% (80-90 ml) + água destilada (20-10 ml), respectivamente</td></tr><tr><td>Tamponado com formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>Formalina 10% (10 ml) + água destilada (90 ml)</td></tr><tr><td>Glicerina-álcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>A407-1 (etanol) AC15365-1000 (glicerina)</td><td>Etanol 70% (95 ml) + glicerina (5 ml)</td></tr><tr><td><forte>Limpeza, coloração e montagem</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol para desidratação durante a coloração</td><td>Fisher Scientific</td><td>A407-1</td><td>Etanol 80%, 95%, 100% (80 ml, 95 ml, 100 ml) + água destilada (20 ml, 5 ml, 0 ml)</td></tr><tr><td>Lactofenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>R400-27-Fenol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>A931I-1 (fenol) A407-1 (etanol)</td><td>Fenol 100% (80 ml) + etanol 100% (20 ml)</td></tr><tr><td>Harris' Hematoxilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25347 (hematoxilina) A407-1 (etanol) A567-500 (sulfato de alumínio e amônio) S25553 (iodato de sódio)</td><td>Hematoxilina (5 g) + etanol 100% (50 ml) + sulfato de alumínio e amônio (100 g) + iodato de sódio (0,37 g) + água destilada (1.000 ml)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Semichon' s carmim acético</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401500 (ácido acético glacial) S25236 (carmim) A407-1 (etanol)</td><td>Ácido acético glacial (100 ml) + carmim (1,5 g) + água destilada (100 ml). Aqueça em banho-maria fervente por 15 min e deixe esfriar. Filtre para fazer a solução estoque. Misture 1:2 com álcool 70% para colorir.</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>X4-4</td><td>Use apenas sob um exaustor químico.</td></tr><tr><td>Salicilato de metila</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25437-Etanol</td><td></td></tr> <tr><td>básico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A407-1 (etanol) S25159A (hidróxido de amônio concentrado)</td><td>Etanol 70% (100 ml) + hidróxido de amônio (0,1 ml)</td></tr><tr><td>Ácido etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A407-1 (etanol) SA9233-100 (ácido clorídrico)</td><td>Etanol 70% (99,5 ml) +&nbsp; ácido clorídrico (0,5 ml)</td></tr><tr><td>Bálsamo do Canadá</td><td>Fisher Scientific</td><td>B10-100</td><td>-</td></tr></tbody></table>

coleta e identificação de helmintos da vida selvagem

Helminth Collection and Identification from Wildlife

Animais selvagens são comumente parasitados por uma ampla gama de helmintos. Os quatro principais tipos de helmintos são "lombrigas" (nematóides), "vermes de cabeça espinhosa" (acantocéfalos), "vermes" (trematódeos) e "tênias" (cestóides). O método ideal para coletar helmintos é examinar um hospedeiro que está morto há menos de 4-6 horas, já que a maioria dos helmintos ainda estará viva. Uma necropsia completa deve ser realizada e todos os principais órgãos examinados. Os órgãos são lavados sobre uma peneira de 106 μm em água corrente e o conteúdo examinado em um microscópio estereoscópico. Todos os helmintos são contados e um número representativo é fixado (em etanol a 70%, formalina tamponada a 10% ou álcool-formalina-ácido acético). Para a identificação das espécies, os helmintos são eliminados em lactofenol (nematóides e pequenos acantocéfalos) ou corados (trematódeos, cestóides e grandes acantocéfalos) usando hematoxilina de Harris ou carmim de Semichon. Os helmintos são ligados às espécies examinando diferentes estruturas (por exemplo, espículas masculinas em nematóides ou o rostelo em cestóides). Os protocolos descritos aqui podem ser aplicados a qualquer animal vertebrado. Eles exigem alguma experiência no reconhecimento dos diferentes órgãos e na capacidade de diferenciar helmintos de outros detritos teciduais ou conteúdos intestinais. Coleta, preservação e coloração são técnicas simples que requerem equipamentos e reagentes mínimos. A identificação taxonômica, especialmente para espécies, pode ser muito demorada e pode exigir a submissão de espécimes a um especialista ou análise de DNA.

Utilizando os métodos descritos acima, foi realizada uma pesquisa sobre os helmintos da musaranha-mascarada, Sorex cinereus, no condado de Missoula, Montana, entre 2007 e 2011. Um total de 56 musaranhas foi coletado em armadilhas de queda e examinado dentro de 2 horas após a morte. A prevalência geral de infecção foi de 96%; apenas 2 musaranhas estavam livres de parasitas. Quinze espécies de helmintos foram identificadas, incluindo 9 espécies de cestódeos e 6 espécies de nematódeos. Uma espécie do gênero de cest...

Os animais selvagens são comumente parasitados por uma ampla gama de helmintos. Os quatro principais tipos de helmintos são "lombrigas" (nematóides), "vermes de cabeça espinhosa" (acantocéfalos), "vermes" (trematódeos) e "tênias" (cestóides). Aqui descrevemos como os helmintos são coletados de um animal vertebrado e como eles são preservados e taxonomicamente identificados.

Coleta e identificação de helmintos da vida selvagem

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths. The four major types of helminths are &#34;roundworms&#34; (nematodes), ...

O objetivo geral deste procedimento é coletar, preservar e identificar escólex de vida selvagem. Isso é realizado inicialmente por meio da necropsia de um animal silvestre. Em seguida, os escólex são coletados de diferentes órgãos e, então, preservados utilizando uma variedade de técnicas para identificação posterior.Por fim, os elmos são clareados, corados e montados, e as espécies são identificadas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram estruturas específicas dos elmos por meio de técnicas de clareamento e/ou coloração, o que pode auxiliar significativamente na identificação das espécies. Embora este método possa ser aplicado para a identificação de elmos de mamíferos, aves, répteis e anfíbios.Ele também pode ser aplicado a outros organismos, como peixes. Para começar, posicione o animal sobre uma superfície plana e use uma lupa para examinar todas as aberturas externas, incluindo ouvidos, cavidade oral e olhos, em busca da presença de nematoides, CSEs, dedos e trematódeos. Utilizando uma lâmina afiada ou faca e um par de pinças de dissecação.Realize uma incisão sobre a cavidade abdominal tendo cuidado para não romper nenhum órgão. Em seguida, com alicate de corte ósseo ou uma pequena serra manual, se necessário, abra a cavidade torácica. Examine ambas as cavidades em busca de vermes redondos, filarias e trematódeos grandes.Em seguida, amarre um fio próximo ao início do esôfago e outro na extremidade do intestino grosso para exame. Sob um microscópio estereoscópico, separe o coração e os principais vasos sanguíneos, traqueia e pulmões em placas de Petri individuais. Remova o fígado, vesícula biliar e ducto pancreático, baço, rins e bexiga urinária, e examine-os sob o microscópio estereoscópico.Em seguida, remova todo o sistema digestivo e coloque cada seção em um recipiente de vidro. Após a remoção dos órgãos, use uma mangueira ou frasco com pulverizador cheio de salina a 0,9% para lavar a cavidade corporal, fazendo com que o líquido passe por uma peneira de malha de 106 micrômetros. Lave com água reversa o conteúdo da peneira para um recipiente de Petri e examine o conteúdo sob um microscópio estereoscópico. Para vermes Fal ou trematódeos sanguíneos, abra cada seção do trato digestivo usando tesoura.Remova cuidadosamente a mucosa e examine-a com atenção para verificar a presença de parasitas grandes. Os psci de encanto cephas geralmente estão profundamente embutidos na parede do intestino. Portanto, se necessário, utilize pinças e/ou tesouras pequenas para removê-los cuidadosamente do tecido.Coloque cada seção aberta sob água corrente e lave o conteúdo para uma peneira de 106 micrômetros. Em seguida, abra o coração e os principais vasos sanguíneos, traqueia e bexigas urinária e biliar, e examine o conteúdo da mesma forma. Use uma lâmina afiada e uma pinça para cortar e separar cuidadosamente órgãos sólidos, como fígado, pulmões, rins, baço e pâncreas, e lave e examine os conteúdos. Registre os tipos de parasitas.Encontrou o número de cada tipo e os órgãos nos quais são encontrados. Rotule os frascos ou potes colocando dentro um pequeno pedaço de cartão simples identificado a lápis, para preservar os helmintos para estudos genéticos posteriores. Primeiro, coloque-os diretamente no etanol.Após fixar a amostra por um a vários dias, transfira-a para um frasco de vidro de cinco mililitros contendo etanol a 70% para armazenamento de longo prazo. Para preservar os trematódeos, coloque espécimes vivos em uma lâmina de microscópio de vidro, em uma gota de solução salina, aplique uma lamínula de vidro e passe a lâmina rapidamente por uma chama sem ferver a solução salina. Em seguida, mergulhe a lâmina em uma placa de Petri contendo álcool, ácido fórmico acético ou uma solução de FA e deixe a lamínula soltar-se naturalmente.Fixe trematódeos mortos em FA ou formalina tamponada a 10% por 48 horas antes de transferi-los para um frasco contendo etanol a 70% para armazenamento de longo prazo. Para fixar estos, relaxe os animais vivos em uma placa de Petri derramando água próxima à fervura sobre eles e, em seguida, transfira-os para um frasco contendo etanol a 70% para armazenamento prolongado. Relaxe encanto cephas vivos colocando-os em uma placa de Petri com água da torneira na geladeira por uma a várias horas, até que o probóscide esteja completamente retraído.Transfira-os para um frasco contendo etanol 70% ou FA para armazenamento de longo prazo. Elimine nematoides pequenos ou frágeis com etanol quente a 70% e conserve-os em um frasco contendo etanol 70% com 5% de glicerina para eliminação. Nematoides de tamanho médio a grande.Coloque-os em ácido acético glacial frio e, após 15 minutos, transfira para um frasco contendo etanol 70% e glicerina 5%. Prepare a hematina de Harris dissolvendo hematina e álcool e dissolvendo sulfato de amônio e alumínio em água sob aquecimento. Misture ambas as soluções e aqueça até fervura.Em seguida, adicione iodato de sódio e aqueça em ebulição por dois a três minutos. Após o resfriamento da solução, utilize papel de filtro 5 41 para filtrar a solução com o objetivo de destacar trematódeos e decantar Cephas. Coloque em hematina de Harris ou carmim semiconciliar durante a noite para fixar as amostras. Transfira para etanol ácido a 70% até que os órgãos fiquem visíveis.Para interromper a coloração com DES, transfira os espécimes para etanol básico a 70% por pelo menos 30 minutos. Desidrate as amostras em uma série de etanol e utilize xileno ou salicilato de metila para clareá-las. Para montar os espécimes em uma lâmina de microscópio, adicione uma gota de bálsamo do Canadá e uma lamínula. Deixe secar durante a noite. Clareie nematoides pequenos a médios e encisto cefas colocando-os em montagens com fenol láctico em uma lâmina de microscópio e cobrindo com uma lamínula por 15 a 30 minutos para nematoides grandes e encisto cefas.Coloque em fenol a 80% por até 60 minutos. Examine ao microscópio óptico para verificar a clareação das estruturas menores para examinar os átomos de Culex. Corte e coloque sobre uma quantidade de fenol láctico.Em uma lâmina de microscópio. Use uma lamínula para esmagar o culex a fim de permitir a medição e a contagem dos ganchos estelares rosados. Corte a extremidade anterior e monte em Foss em um microscópio.Deslize sob algumas gotas de fenol láctico ou em geleia de glicerina para montagem permanente. Observe as peças bucais ao microscópio óptico. Após cortar as caudas de nematoides grandes e montá-los em fenol láctico, observe o paolo ventral e a morfologia das espículas dos machos ao microscópio óptico utilizando os métodos descritos neste vídeo.Um levantamento dos capacetes dos cenários de musaranho máscara Sox foi conduzido no condado de Missoula, Montana, entre 2007 e 2011. Um total de 56 musaranhos foram coletados em armadilhas de queda e examinados dentro de duas horas após a morte.A prevalência geral da infecção foi de 96%. Apenas dois musaranhos estavam livres de parasitas. Foram identificadas 15 espécies de helmintos, incluindo nove espécies de cestódeos e seis espécies de nematoides. Uma espécie do gênero Esto, Staphylocephalus, era previamente desconhecida.Os órgãos encontrados infectados incluíram o intestino delgado, estômago, pulmões e bexiga urinária. As intensidades totais de infecção variaram de sete a 234 vermes por espécie de hospedeiro infectado, ou o número de espécies de capacetes por hospedeiro infectado variou de um a oito, com uma média de 4,1. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um a dois Rs em um pequeno mamífero como um esquilo, e em quatro a cinco Rs em um mamífero maior como um guaxinim.Após assistir a este vídeo, você deverá ter um entendimento muito bom de como coletar, preservar e identificar capacetes de animais silvestres.

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