Nanofibras ECM proteínas e Nanoestruturas Engineered Usando Assembléia iniciou-Surface

O objetivo geral deste procedimento é produzir fibras, nanoestruturas e matrizes bidimensionais autossustentáveis a partir de proteínas da matriz extracelular únicas ou múltiplas, utilizando montagem iniciada em superfície. Isso é realizado primeiramente preparando carimbos de poli(dimetilsiloxano) ou PDMS, despejando o pré-polímero de PDMS em um molde-mestre com padrão topográfico e deixando curar. O segundo passo consiste em recortar os carimbos de PDMS curados e revesti-los com uma solução contendo as proteínas da matriz extracelular desejadas.

Em seguida, os carimbos são lavados, secos e impressos por microcontato em uma lamínula de vidro revestida com poli N iso propil acrilamida, ou pipe PAM. O passo final é hidratar a lamínula com água desionizada morna a 40 graus Celsius e permitir que esfrie gradualmente, reduzindo a temperatura da solução. Abaixo de aproximadamente 32 graus Celsius, ocorre a dissolução da camada de pipe PAM termossensível e a liberação das nanoestruturas ou nanofibras proteicas montadas.

No final, as nanoestruturas e nanofibras montadas são autossustentáveis em solução, conforme confirmado por microscopia de contraste de fase e/ou fluorescência, e podem ser utilizadas em aplicações posteriores, como esqueletos para engenharia de tecidos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como separação por face ou eletrofiação, é a capacidade de projetar nanofibras de proteínas da matriz extracelular usando um método que realmente imita a maneira como as células normalmente constroem fibras da matriz extracelular in vivo. A técnica de montagem iniciada na superfície apresenta diversas vantagens únicas, incluindo a capacidade de controlar a composição proteica, a morfologia da fibra e a arquitetura do esqueleto.

Além disso, podemos produzir nanofibras de proteínas da matriz extracelular a partir de proteínas da matriz extracelular, como a fibronectina em lâminas e o colágeno tipo quatro, o que tem se mostrado difícil utilizando outros tipos de métodos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da engenharia de tecidos, permitindo aos pesquisadores desenvolver construtos com sinais físicos e químicos específicos e bem definidos, capazes de orientar diversos comportamentos celulares, como adesão e diferenciação. Se você é novo nesta técnica, deve lembrar-se de inspecionar continuamente a qualidade de seus filamentos, bem como a fidelidade dos padrões impressos por microcontato.

Isso é essencial para obter a montagem adequada das nanoestruturas e nanofibras da matriz extracelular. Para iniciar este procedimento, prepare o pré-polímero de poli(dimetilsiloxano) ou PDMS combinando a base elastomérica e o agente de cura em uma proporção de 10 para 1 em peso por peso; normalmente, utilizam-se 80 gramas da base e oito gramas do agente de cura para garantir quantidade suficiente de PDMS para cobrir o molde-mestre com uma camada de um centímetro de espessura. Misture e desgaseifique o PDMS usando um misturador centrífugo ajustado para o seguinte ciclo: mistura a 2000 RPM por dois minutos, desgaseificação a 2000 RPM por dois minutos. Despeje com cuidado.

Polímero pré-PDMS sobre o molde mestre para formar uma camada com um centímetro de espessura aqui, o PDMS por meio de aquecimento a 65 graus Celsius durante quatro horas. Após a cura, utilize um bisturi para recortar a região contendo o padrão e formar o carimbo de PDMS. Para distinguir o lado com características do lado oposto do carimbo de PDMS.

Corte um entalhe em um dos cantos do lado posterior do carimbo. Inicie este procedimento limpando as lamínulas de vidro com diâmetro de 25 milímetros; sonique as lamínulas em etanol 95% durante uma hora e, em seguida, seque-as em uma estufa a 65 graus Celsius. Em seguida, prepare a solução de poli e isopropilacrilamida ou piam, dissolvendo piam em butanol-1 numa concentração de 10%. Centralize uma lamínula de vidro limpa no porta-lâmina a vácuo do espinador e pipete 200 microlitros da solução de piam sobre a superfície de vidro para cobrir completamente a superfície.

Centrifugar a lamínula a 6.000 RPM durante um minuto. Limpe os carimbos de PDMS por sonicacao em etanol 50% durante 30 minutos e, em seguida, seque sob fluxo de nitrogênio. Todas as etapas subsequentes devem ser realizadas em uma cabine de segurança biológica para manter a esterilidade em aplicações nas quais a matriz extracelular ou nanoestruturas de ECM forem utilizadas com células. A etapa de microimpressão por contato é o aspecto mais difícil deste procedimento.

É importante inspecionar as cunhas de PDMS quanto a quaisquer defeitos visíveis antes do uso. Além disso, não utilize solução de proteína com mais de duas semanas. Coloque as lamínulas revestidas com PIAM dentro de uma placa de Petri fechada e esterilize por exposição à radiação UV.

45 minutos sob luz UV em uma cabine de segurança biológica é suficiente. Revestir a superfície com padrão de cada carimbo de PDMS com 200 microlitros da solução proteica. A fibronectina ou FN é usada aqui numa concentração de 50 microgramas por mililitro em água destilada estéril.

Incube por uma hora à temperatura ambiente. Após uma hora, lave os carimbos de PDMS com água destilada para remover a proteína em excesso e seque completamente sob um fluxo de nitrogênio. É importante remover toda a água completamente para evitar a dissolução prematura do canal. Revestimento de Pam na lamínula e transferência inadequada de proteína.

Realize a microimpressão por contato colocando o lado com características do carimbo de PDMS em contato com a lamínula revestida com PAM, se necessário. Use pinças para bater levemente na parte traseira dos carimbos a fim de remover quaisquer bolhas de ar e garantir um contato uniforme após cinco minutos. Remova cuidadosamente o carimbo de PDMS da lamínula.

Nesta etapa, dependendo do estudo, proteínas adicionais da matriz extracelular podem ser padronizadas para criar estruturas mais complexas e multicomponentes. Uma vez que o padrão da matriz extracelular tenha sido impresso, coloque a lamínula revestida com PAM e com o padrão impresso em uma placa de Petri de 35 milímetros e verifique a fidelidade do padrão utilizando microscopia de contraste de fase.

Dependendo do padrão, pode ser necessário um câmera CCD para resolver as características do padrão. A microscopia de fluorescência também pode ser utilizada para inspecionar o padrão, desde que as proteínas da matriz extracelular estejam marcadas com fluorescência. Após verificar a fidelidade do padrão, adicione três mililitros de água destilada a 40 graus Celsius à placa de Petri e permita que a água esfrie gradualmente para a dissolução do tubo.

A camada de PAM e a liberação dos padrões de proteínas da matriz extracelular podem ser monitoradas usando microscopia de contraste de fase. Normalmente, para garantir que as nanoestruturas de proteínas da matriz extracelular tenham sido liberadas, a água é resfriada até a temperatura ambiente, bem abaixo da temperatura crítica inferior de solução do PAM, que é de 32 graus Celsius. Se a aplicação não permitir o uso de técnicas ópticas, a liberação pode ser monitorada mediante a medição da temperatura da solução.

As nano fibras e outras nanoestruturas estarão flutuando na água após a liberação da camada de PAM do tubo. Para aplicações adicionais, as nanoestruturas e as nano tecelagens precisam ser manipuladas, mas a abordagem exata dependerá do objetivo experimental. Resultados representativos são apresentados aqui para demonstrar que a montagem iniciada em superfície ou SIA é capaz de produzir nano fibras de proteínas da matriz extracelular com controle preciso sobre as dimensões das fibras.

Um arranjo de retângulos de fibronectina, com 50 micrômetros de comprimento e 20 micrômetros de largura, foi padronizado sobre uma lamínula revestida com piam mediante a adição de água DI a 40 graus Celsius e posterior resfriamento abaixo da temperatura crítica inferior de solução. A temperatura do piam desencadeou a dissolução do piam e a liberação das nanofibras de fibroína após a liberação. As fibras contraíram-se porque estavam sob uma pré-tensão inerente.

Quando padronizadas sobre a superfície de piam, a análise de Alice das dimensões das nanofibras de fibronectina antes da liberação revelou que elas eram monodispersas, com um comprimento médio de 50,19 ± 0,49 micrômetros e largura média de 19,98 ± 0,17 micrômetros. Após a liberação, as nanofibras contraíram-se significativamente, mas permaneceram monodispersas, com um comprimento médio de 14,15 ± 0,92 micrômetros e largura média de 2,65 ± 0,32 micrômetros. A microscopia de força atômica forneceu uma perspectiva de maior resolução das alterações dimensionais das fibras associadas ao processo de liberação por SIA.

Notavelmente, as fibras pré-liberação tinham uma espessura uniforme de cerca de cinco nanômetros, enquanto as fibras pós-liberação apresentavam uma espessura da ordem de várias centenas de nanômetros, ao passo que o comprimento e a largura diminuíram. Utilizando o processo SIA, é possível engenhar uma variedade de nanoestruturas de proteínas da MEC com tamanho, forma e composição ajustáveis. Por exemplo, nanofibras de fibronectina inicialmente com 20 micrômetros de largura e um centímetro de comprimento foram padronizadas sobre um tubo.

Deslize de cobertura revestido com PAM após resfriamento e pipeta. Com a dissolução do PAM, as nanoestruturas foram liberadas, formando longos filamentos com uma largura reduzida de cerca de três micrômetros. Além disso, como o padrão é definido pela topografia da superfície do carimbo de PDMS utilizado para impressão por microcontato, é possível projetar nanoestruturas complexas de proteínas da matriz extracelular como prova de conceito.

Foram criadas estrelas multi-ramificadas de fibroína. A liberação térmica resultou na contração dos braços, mas não na região central da estrela, onde os braços se unem. A SIA também funciona com outras proteínas da matriz extracelular, como laminina ou LN, e múltiplas proteínas da matriz extracelular podem ser incorporadas na mesma estrutura.

Neste exemplo, linhas ortogonais interconectadas, com 20 micrômetros de largura de fibronectina mostradas em vermelho e linhas de 50 micrômetros de largura de laminina mostradas em verde integradas a uma malha nano bidimensional foram padronizadas e, em seguida, liberadas; após a liberação, ambos os tipos de nanofibras contraíram, mas a interconectividade geral e a estrutura da rede quadrada foram mantidas. Esses resultados demonstram que a SIA pode ser utilizada para engenhar materiais de MEC com diversas composições e estruturas. Por fim, são apresentados alguns casos de falha na SIA de nanofibras de MEC.

Uma causa é a liberação inadequada de um padrão incompleto devido à transferência deficiente da proteína da matriz extracelular para a superfície de piam. Durante a microimpressão por contato, a presença de buracos, bordas irregulares e outros defeitos cria nanofibras e nanoestruturas incompletas, propensas a quebra e fragmentação após a liberação. A dissolução rápida do PAM de tubo também pode causar baixa fidelidade do padrão após a liberação.

Por exemplo, utilizando água a 20 graus Celsius, uma temperatura já abaixo da temperatura crítica inferior da solução, o piam sofrerá inchaço rápido e se dissolverá. Isso pode fazer com que as nano fibras retornem abruptamente e se quebrem, conforme ilustrado na imagem de 32 segundos, e formem configurações aleatórias e desorganizadas, conforme ilustrado na imagem de 52 segundos.

Antes de iniciar este procedimento, verifique a condição das hastes de PDMS quanto a defeitos e certifique-se de que todas as superfícies estejam livres de poeira. Caso contrário, isso impedirá a transferência adequada de proteínas e levará a uma má montagem das estruturas de CM-A. Após seguir este procedimento, as nanoestruturas ou nanofibras liberadas podem ser utilizadas para diversas finalidades, como analisar as propriedades mecânicas das fibras proteicas ou serem usadas como scaffolds para engenharia de tecidos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar nanofibras e nanoestruturas de proteínas da MEC com composição, geometria e arquitetura ajustáveis. Especificamente, você entenderá como imprimir por microcontato padrões de proteínas da MEC sobre lamínulas de vidro revestidas com polímero, e então acionar termicamente a dissolução da superfície para montar as estruturas da MEC.