Nanofibras ECM proteínas e Nanoestruturas Engineered Usando Assembléia iniciou-Surface

O objetivo geral deste procedimento é projetar nanofibras, nanoestruturas e matrizes 2D independentes a partir de proteínas de matriz extracelular simples ou múltiplas usando montagem iniciada na superfície. Isso é feito primeiro preparando selos de poli dimetil soano ou PDMS, despejando o pré-polímero PDMS em um molde mestre com padrão topográfico e permitindo que ele cure. O segundo passo é cortar os selos PDMS curados e revesti-los com uma solução contendo as proteínas da matriz extracelular desejadas.

Em seguida, os selos são lavados, secos e impressos em microcontato em uma acrilamida de polipropileno iso propila ou lamínula de vidro revestida com PAM de tubo. A etapa final é hidratar a lamínula com água deionizada morna a 40 graus Celsius e permitir que ela esfrie gradualmente, reduzindo a solução. A temperatura abaixo de cerca de 32 graus Celsius desencadeia a dissolução da camada PAM do tubo termicamente sensível e a liberação de nanofibras de proteína montadas ou nanoestruturas.

Em última análise, as nanofibras e nanoestruturas montadas são independentes em solução, conforme confirmado por contraste de fase e/ou microscopia de fluorescência, e podem ser usadas em outras aplicações, como andaimes de engenharia de tecidos. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como separação facial ou eletrofiação, é a capacidade de projetar nanofibras de proteína ECM usando uma técnica que realmente imita a maneira como as células normalmente constroem fibras ECM in vivo. A técnica de montagem iniciada na superfície tem uma série de vantagens exclusivas, incluindo a capacidade de controlar a composição da proteína, a morfologia da fibra e a arquitetura do andaime.

Além disso, podemos projetar nanofibras de proteína ECM a partir de proteínas de matriz extracelular, como laminado de fibra nin e colágeno tipo quatro, o que se mostrou difícil usando outros tipos de métodos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da engenharia de tecidos, permitindo que os pesquisadores desenvolvam construtos com pistas físicas e químicas específicas e bem definidas para direcionar uma variedade de comportamentos celulares, como adesão e diferenciação. Se você é novo nessa técnica, lembre-se de inspecionar continuamente a qualidade de suas hastes, bem como a fidelidade dos padrões impressos de microcontato.

Isso é essencial para obter a montagem adequada das nanofibras e nanoestruturas da ECM. Para iniciar este procedimento, prepare o pré-polímero polidimetil soano ou PDMS combinando a base de elastômero e o agente de cura em uma proporção de 10 para um peso por peso, normalmente 80 gramas de base e oito gramas de agente de cura são usados para garantir que haja PDMS suficiente para cobrir o molde mestre em uma mistura de camada de um centímetro de espessura e DGAs o PDMS usando um misturador centrípeto ajustado para a seguinte mistura em 2000 RPM por dois minutos, DGAs a 2000 RPM por dois minutos. Pobre o suficiente.

PDMS pré-polímero sobre o molde mestre para formar uma camada de um centímetro de espessura aqui, o PDMS assando a 65 graus Celsius por quatro horas. Depois de curado, use um bisturi para cortar a região que contém o padrão para formar o carimbo PDMS. Para distinguir o lado do recurso do verso do carimbo PDMS.

Corte um entalhe em um dos cantos na parte de trás do carimbo. Comece este procedimento limpando as lamínulas de vidro de 25 milímetros de diâmetro, sonice as lamínulas em etanol a 95% por uma hora e seque-as em um forno a 65 graus Celsius. Em seguida, prepare a solução de poli e isopropil acrilamida ou piam para dissolver o piam em um butanol na concentração de 10% Centralize uma lamínula de vidro limpa no mandril de vácuo do spin coer e pipete 200 microlitros da solução de Pam do tubo na superfície do vidro para cobrir totalmente a superfície.

Gire a lamínula a 6.000 RPM por um minuto. Limpe os selos PDMS por sonicação em etanol a 50% por 30 minutos e, em seguida, seque sob uma corrente de secagem de nitrogênio e todas as etapas subsequentes devem ser executadas em um gabinete de biossegurança para manter a esterilidade para aplicações onde a matriz extracelular ou nanoestruturas ECM serão usadas com células. A etapa de impressão por microcontato é o aspecto mais difícil deste procedimento.

É importante inspecionar os carimbos PDMS quanto a defeitos visíveis antes do uso. Além disso, não use solução de proteína com mais de duas semanas de idade. A tampa revestida com PIAM desliza dentro de uma placa de Petri fechada e esteriliza usando exposição UV.

45 minutos sob a luz ultravioleta em um gabinete de biossegurança são suficientes. Cubra a superfície do padrão de cada carimbo PDMS com 200 microlitros da solução de proteína. A fibronectina ou FN é usada aqui em uma concentração de 50 microgramas por mililitro em água destilada estéril.

Incube por uma hora em temperatura ambiente, após uma hora lave os selos PDMS e a água destilada para remover o excesso de proteína e seque completamente sob uma corrente de nitrogênio. É importante remover completamente a água para evitar a dissolução prematura do tubo. Revestimento Pam na lamínula e transferência inadequada de proteínas.

Execute a impressão de micro contato colocando o lado do recurso do carimbo PDMS em contato com a lamínula revestida com PAM do tubo, se necessário. Use uma pinça para bater levemente na parte de trás dos carimbos para remover quaisquer bolhas de ar e garantir um contato uniforme após cinco minutos. Retire o carimbo PDMS da lamínula.

Nesta fase. Dependendo do estudo, proteínas ECM adicionais podem ser padronizadas para criar estruturas mais complexas e multicomponentes. Uma vez que o padrão ECM tenha sido impresso, coloque a lamínula revestida com PAM de tubo padronizado em uma placa de Petri de 35 milímetros e inspecione a fidelidade do padrão usando microscopia de contraste de fase.

Dependendo do padrão, uma câmera CCD pode ser necessária para resolver os recursos do padrão. A microscopia de fluorescência também pode ser usada para inspecionar o padrão, desde que as proteínas ECM sejam marcadas com fluorescência. Depois de verificar a fidelidade do padrão, adicione três mililitros de água destilada a 40 graus Celsius à placa de Petri e deixe a água esfriar gradualmente a dissolução do tubo.

A camada PAM e a liberação dos padrões proteicos da MEC podem ser monitorados usando microscopia de contraste de fase. Normalmente, para garantir que as nanoestruturas da proteína ECM tenham sido liberadas, a água é resfriada à temperatura ambiente bem abaixo da temperatura crítica mais baixa da solução do tubo, pam, que é de 32 graus Celsius. Se a aplicação não permitir o uso de técnicas ópticas, a liberação pode ser monitorada medindo a temperatura da solução.

Nano fibras e outras nanoestruturas estarão flutuando na água após a liberação da camada PAM do tubo. Para outras aplicações, os nano tecidos e outras nanoestruturas precisam ser manipulados, mas a abordagem exata dependerá do objetivo experimental. Resultados representativos são apresentados aqui para demonstrar que a montagem iniciada pela superfície ou SIA é capaz de projetar nanofibras de proteína ECM com controle preciso sobre as dimensões da fibra.

Uma série de retângulos de fibronectina, com 50 micrômetros de comprimento e 20 micrômetros de largura, foi padronizada em uma lamínula revestida com piam, adição de água DI de 40 graus Celsius e subsequente resfriamento abaixo da solução crítica inferior. A temperatura do piam desencadeou a dissolução do piam e a liberação das nanofibras de fibroína após a liberação. As fibras se contraíram porque estavam sob uma protensão inerente.

Quando padronizado na superfície piam, a análise de Alice das dimensões da nanofibra de fibronectina pré-liberação revelou que elas eram monodispersas com um comprimento médio de 50,19 mais ou menos 0,49 micrômetros e largura média de 19,98 mais ou menos 0,17 micrômetros. Após a liberação, as nanofibras se contraíram sensivelmente, mas permaneceram monodispersas com um comprimento médio de 14,15 mais ou menos 0,92 micrômetros e largura média de 2,65 mais ou menos 0,32 micrômetros. A microscopia de força atômica forneceu uma perspectiva de maior resolução das mudanças dimensionais da fibra associadas ao processo de liberação da AIS.

Notavelmente, as fibras de pré-liberação tinham uma espessura uniforme de cerca de cinco nanômetros, enquanto as fibras de pós-liberação tinham uma espessura da ordem de várias centenas de nanômetros, enquanto o comprimento e a largura diminuíam. Usando o processo SIA, é possível projetar uma variedade de nanoestruturas de proteínas ECM com tamanho, forma e composição ajustáveis. Por exemplo, nanofibras de fibronectina inicialmente com 20 micrômetros de largura e um centímetro de comprimento foram padronizadas em um tubo.

Lamínula revestida com PAM após resfriamento e tubulação. Pam, as nanofibras foram liberadas formando longos fios com largura reduzida de cerca de três micrômetros. Além disso, uma vez que o padrão é definido pela topografia da superfície do carimbo PDMS usado para impressão de micro contato, é possível projetar nanoestruturas complexas de proteínas ECM como prova de conceito.

Estrelas de fibroína com vários braços foram criadas. A liberação térmica resultou na contração dos braços, mas não na região central da estrela onde os braços se uniram. O SIA também funciona com outras proteínas ECM, como laminado ou LN, e várias proteínas ECM podem ser incorporadas à mesma estrutura.

Neste exemplo, linhas ortogonais interconectadas de 20 micrômetros de largura de fibronectina mostradas em vermelho e linhas de 50 micrômetros de largura de laminina mostradas em verde integradas em um tecido nano 2D foram padronizadas e, em seguida, liberadas após a liberação, ambos os tipos de nanofibras se contraíram, mas a interconectividade geral e a estrutura da rede quadrada foram mantidas. Esses resultados demonstram que o SIA pode ser usado para projetar materiais de ECM com uma variedade de composições e estruturas. Por fim, alguns casos de falha na SIA de nanofibras ECM são mostrados.

Uma causa é a liberação inadequada de um padrão incompleto devido à má transferência da proteína ECM para a superfície do piam. Durante a impressão por microcontato, a presença de furos, bordas irregulares e outros defeitos criará nanofibras e nanoestruturas incompletas e propensas a quebras e fragmentação após a liberação. A rápida dissolução do PAM do tubo também pode causar baixa fidelidade do padrão após a liberação.

Por exemplo, usando água a 20 graus Celsius, uma temperatura já abaixo da solução crítica inferior. A temperatura do piam fará com que o piam inche e se dissolva rapidamente. Isso pode fazer com que as nanofibras se quebrem e quebrem, conforme ilustrado na 32ª imagem, e formem configurações aleatórias desorganizadas, conforme ilustrado na imagem de 52 segundos.

Antes de iniciar este procedimento, a condição do PDMS é decorrente de defeitos e também certifique-se de que todas as superfícies estejam livres de poeira. Caso contrário, impedirá a transferência adequada de proteínas e levará a uma má montagem das estruturas A CM. Portanto, seguindo este procedimento, as nanofibras ou nanoestruturas de liberação podem ser usadas para fazer uma série de coisas, como analisar as propriedades mecânicas das fibras proteicas ou usadas como andaimes para engenharia de tecidos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar nanofibras e nanoestruturas de proteína ECM com composição, geometria e arquitetura ajustáveis. Especificamente, você deve entender como micro padrões de impressão de contato de proteínas ECM em lamínulas de vidro revestidas de python e, em seguida, acionar termicamente a dissolução da superfície para montar as estruturas de ECM.