Bioenergética e os oxidativo estourou: Protocolos para o Isolamento e Avaliação de leucócitos humanos e plaquetas

No protocolo a seguir, será demonstrada a medição dos perfis bioenergéticos e respostas de explosão oxidativa de monócitos, linfócitos, neutrófilos e plaquetas do sangue humano. Isso é conseguido coletando primeiro as frações de plasma rico em plaquetas e revestimento leucocitário do sangue recém-coletado. Como segunda etapa, a população heterogênea de glóbulos brancos é separada em camadas de células mononucleares e polimorfonucleares por gradiente de densidade.

Em seguida, as populações de neutrófilos e linfócitos de monócitos puros são isoladas por separação máxima e, em seguida, plaqueadas para fluxo extracelular ou análise de XF. Em última análise, a medição sensível e reprodutível da função mitocondrial em monócitos, linfócitos e plaquetas, bem como a explosão oxidativa das taxas de consumo de oxigênio de monócitos e neutrófilos, podem ser medidas pela tecnologia XF. A vantagem da técnica que vamos mostrar hoje é que você pode preparar a partir de uma pequena amostra de sangue todas as principais células que estão no sangue do paciente.

Estas são plaquetas e leucócitos em uma forma pura inativada e medem sua função mitocondrial. Isso, pensamos, pode refletir várias doenças e estados dentro do paciente em tempo real. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre o metabolismo, como qual é o papel do estilo de vida, dieta e estresse patológico na função mitocondrial.

Este protocolo combina múltiplas tecnologias para o isolamento e determinação da bioenergética celular em várias populações de leucócitos e em plaquetas. Esta etapa do protocolo é muito crítica porque o gradiente de densidade e a separação magnética requerem pipetagem precisa. Além disso, você precisa estar ciente de onde estão as populações de células durante o fracionamento.

Demonstraremos o isolamento de células do sangue periférico e a análise da bioenergética celular no analisador de fluxo extracelular de 24 poços ou no XF 24. No entanto, este método também pode ser realizado no XF 96, Pelo menos duas horas antes de iniciar o procedimento. Hidrate as sondas do cartucho do sensor XF com a solução de cran XF.

Em seguida, gire o sangue total recém-coletado por 15 minutos a 500 vezes G e temperatura ambiente em uma centrífuga com um rotor de balde oscilante. Use uma pipeta de transferência para remover a camada superior contendo o plasma rico em plaquetas até que um centímetro de plasma permaneça acima da camada de revestimento leucocitário e reserve o plasma em temperatura ambiente para processamento posterior. Em seguida, transfira o revestimento de Buffy para um tubo cônico estéril de 50 mililitros e dilua os glóbulos brancos para 24 mililitros.

Com o RPMI basal em seguida, adicione três mililitros de baixa densidade, seu opaco 1.077 a cada um dos três tubos cônicos de 15 mililitros. Em seguida, coloque a ponta de uma pipeta estreita de cinco mililitros no fundo de cada tubo. Por sua vez, e lentamente liberar três mililitros de alta densidade, seu opaco 1.119.

Agora, use uma pipeta automatizada na configuração de baixa potência para adicionar cuidadosamente oito mililitros de sangue diluído a cada gradiente sem perturbar as camadas. O corante azul foi adicionado ao gradiente de baixa densidade para visualização de todas as camadas de gradiente. Depois de separar as células por centrifugação separadamente, recolher as células mononucleares e polimorfonucleares com pipetas de vidro estéreis, sem perturbar as outras bandas celulares.

Agrupe as populações de células mononucleares e polimorfonucleares de cada tubo em tubos cônicos estéreis de 50 mililitros para cada tipo de célula e adicione quatro volumes de RPMI a ambos os tubos. Depois de girar as células, transfira os pellets para um tubo de 1,5 mililitro, regue o pellet e ressuspenda em 80 microlitros de RPMI fresco suplementado com BSA. Em seguida, adicione 20 microlitros de anticorpos anti CD 14 e anti CD 15 marcados com esferas magnéticas às frações de células mononucleares e polimorfonucleares, respectivamente.

Incube cada suspensão celular por 15 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, lave cada tubo com um mililitro de meio R-P-M-I-B-S-A ressuspenda os pellets em 500 microlitros de R-P-M-I-B-S-A. Em seguida, aplique as suspensões de células em colunas LS lavadas com R-P-M-I-B-S-A individuais e lave cada coluna três vezes com três mililitros de meio R-P-M-I-B-S-A Colete o fluxo de suspensão celular e lavagens de coluna em tubos estéreis para isolar os monócitos e neutrófilos, remova as colunas do campo magnético após a lavagem final e elua as células selecionadas positivamente em um tubo estéril com cinco mililitros de R-P-M-I-B-S-A. Para isolar os linfócitos, faça uma pastilha de pellet através da fração de lavagem da coluna celular, ressuspenda a pastilha celular em 80 microlitros de R-P-M-I-B-S-A e incube as células em 20 microlitros de anticorpos CD 61 e CD 2 35 A por 15 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, repita a separação máxima como antes e colete o fluxo contendo os linfócitos para isolar as plaquetas, centrifugue, o plasma rico em plaquetas reservado e, em seguida, remova o plasma e lave o pellet celular uma vez com cinco mililitros de PBS estéril suplementado com um micrograma por mililitro de prostaglandina I dois ressuspendem o pellet de plaquetas em um mililitro de prostaglandina PBS fresca I dois tampão para plaquear os monócitos isolados, linfócitos, neutrófilos e plaquetas. Primeiro conte as células e leve-as a um volume apropriado em meio de ensaio XF para permitir uma densidade de semeadura de 2,5 vezes 10 elevado ao quinto células por poço em um volume de 200 microlitros. Em uma microplaca de cultura de células XF de 24 poços revestida com célula T para plaquetas, semeie 2,5 vezes 10 a sete células por poço em um volume de 200 microlitros.

Depois de girar as células na placa, traga os volumes finais do poço até 660 microlitros com meio XF e incube as placas a 37 graus Celsius por 30 minutos antes do ensaio XF durante a carga de incubação, 75 microlitros dos reagentes do ensaio na ordem listada nas portas de injeção do cartucho do sensor XF. Se as medições de explosão oxidativa forem obtidas, o PMA pode ser injetado após a antimicina, um carregamento da porta de injeção seguinte coloque o cartucho no analisador de fluxo extracelular para iniciar o ensaio. Os perfis bioenergéticos de leucócitos e plaquetas podem ser determinados usando o analisador de fluxo extracelular XF do cavalo-marinho, que mede o consumo de oxigênio em tempo real nas células de forma não invasiva.

Cada tipo de célula é plaqueado na microplaca XF 24 com cinco réplicas, conforme demonstrado na tabela. Os valores representativos de explosão basal e oxidativa, medidos durante o ensaio, e as concentrações médias de proteína por poço são demonstrados por tipo de célula Os valores da taxa de consumo de oxigênio são normalizados para o conteúdo total de proteína nos poços correspondentes e expressos como p moles por minuto por micrograma de proteína. A taxa de consumo basal de oxigênio é então estabelecida pelas três primeiras medições.

A oligomicina, um inibidor da mitocondrial A TP sintase, é injetada no meio XF para estimar a taxa de consumo de oxigênio acoplada a uma síntese de TP e é representada como uma TP ligada à taxa de consumo de oxigênio residual menos a taxa de consumo de oxigênio não mitocondrial pode ser atribuída ao vazamento de prótons. A adição do FCCP de desacoplamento permite a determinação da taxa máxima de consumo de oxigênio, seguida pela injeção de antimicina a e um inibidor da respiração mitocondrial para medir as fontes não mitocondriais de consumo de oxigênio. A capacidade de reserva é uma medida da quantidade de trabalho adicional que as mitocôndrias podem realizar sob demanda aumentada de energia e pode ser calculada como a diferença entre a taxa máxima de respiração e a basal, a fim de determinar a capacidade de explosão oxidativa de monócitos e neutrófilos.

O agonista P-M-A-A-P-K-C é injetado e o aumento da taxa de consumo de oxigênio está ligado à produção de oxidantes pela N-A-D-P-H oxidase Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de três horas após a coleta de sangue, sem incluir o ensaio em si, se for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante manter as condições estéreis executando cada etapa em um gabinete de segurança biológica e usando tampões e meios estéreis à temperatura ambiente. Seguindo este procedimento, podemos fazer outros protocolos, como análise por fax para determinar a pureza das células, o estado de ativação dos leucócitos e também para determinar a bioenergética celular em subpopulações de leucócitos.

Depois de assistir a este vídeo, agora você deve ter uma ideia bastante clara sobre como preparar plaquetas, linfócitos, monócitos e neutrófilos, colocá-los no cavalo-marinho e medir a explosão oxidativa e a função mitocondrial a partir desses dados. Em seguida, você pode analisar suas populações de pacientes e determinar como sua bioenergética está mudando em tempo real. Não se esqueça de que trabalhar com amostras de pacientes humanos pode ser extremamente perigoso.

Portanto, você precisa usar equipamento de proteção individual, bem como usar um gabinete de segurança biológica durante este procedimento.