Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos Plasmodium berghei ANKA infectadas Mice

O objetivo geral deste procedimento é isolar leucócitos inflamatórios aderentes dos vasos sanguíneos cerebrais de camundongos infectados com plasmodium burge eye anca para induzir a malária cerebral experimental. Os camundongos são infectados com plasmodium berge eye e parasitam glóbulos vermelhos por injeção. Depois que os camundongos começam a mostrar sinais da doença, as células circulantes dos camundongos infectados com malária são removidas por perfusão intraoral.

Os cérebros são então colhidos e o tecido é digerido com enzimas para permitir o isolamento de leucócitos inflamatórios. A citometria de fluxo multicolorida é então realizada para o fenótipo imunológico. A análise de leucócitos sequestrados no cérebro dos dados resultantes revela a porcentagem e o número absoluto de leucócitos que migram para o cérebro de camundongos infectados com malária.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da patogênese da malária, como que tipo de células inflamatórias migram para o local de sequestro do parasita no cérebro de animais infectados sob diferentes condições experimentais. A demonstração visual deste método é crítica. As etapas de perfusão são difíceis de aprender, pois exigem velocidade e cuidado para não danificar nenhum vaso sanguíneo significativo Demonstrando algumas partes deste procedimento estarão Leanna Mcic, uma técnica em animais, Ms.Victoria, Rick, uma estudante de doutorado, e Dra. Lisa Aez, uma pós-doutoranda do meu laboratório.

Comece este protocolo infectando os camundongos com olho de p berge e descongelar uma alíquota criopreservada de glóbulos vermelhos parasitados por olho de P berge anca ou pbcs, permitindo que ele atinja a temperatura ambiente. Remova um camundongo doador de oito a 12 semanas de idade de sua gaiola e coloque-o em uma estação de trabalho. Segure a nuca entre o indicador e o polegar.

Vire o mouse e injete 100 a 200 microlitros de plasmodium berge eye na cavidade peritoneal. Rotineiramente, dois camundongos doadores são injetados com pbcs. Após a injeção, coloque os camundongos em sua gaiola quatro a cinco dias após a infecção.

Remova um camundongo doador de sua gaiola e coloque-o em uma estação de trabalho. Coloque uma gota de sangue da veia da cauda do camundongo perto do final de uma lâmina de microscópio com extremidade fosca. Coloque uma segunda lâmina em um ângulo de 45 graus e volte para a gota de sangue.

Assim que o sangue se espalhar ao longo da borda, empurre a lâmina espalhadora uniformemente pela lâmina do microscópio para fazer o esfregaço de sangue. Deixe o esfregaço secar ao ar para corrigir os esfregaços de sangue. Mergulhe as lâminas em 100% de metanol por 30 segundos.

Em seguida, pinte as lâminas em GIM ZA recém-preparado por 10 minutos após a coloração com gim za, enxágue a lâmina com água corrente por 30 segundos. Deixe a lâmina secar ao ar e, em seguida, examine-a ao microscópio usando a lente de imersão em óleo 100 x. Enumere o PRBC dentro de mil eritrócitos e calcule a porcentagem para se o camundongo doador atingiu os níveis necessários de 2,5 a 5% Parsit Colete sangue do camundongo doador por punção cardíaca sob anestesia ou sangramento retroorbital usando um tubo capilar de microhematócrito heparinizado.

Dissolva o sangue em meio RPMI em uma concentração final de uma vez 10 elevado a seis CH por 0,2 mililitros por camundongo. Considere que um hematócrito normal de camundongo é cerca de seis vezes 10 elevado ao nono glóbulo vermelho por mililitro. De fato, oito a 12 semanas de idade experimental C 57 preto seis camundongos injetando uma vez 10 no sexto PRBC em 0,2 mililitros intraperitoneal como antes.

Para monitorar os níveis de para de camundongos infectados, prepare um esfregaço de sangue como antes. Para deve ser determinado a cada dois ou três dias, começando no segundo ou terceiro dia após a infecção a partir do quinto dia. Pós-infecção em diante.

Os camundongos são monitorados diariamente quanto a sinais de malária grave, uma vez que os níveis de para são superiores a 5% e os camundongos apresentam sintomas neurológicos por volta do sexto dia após a infecção. Os camundongos infectados são sacrificados por inalação de CO2 e imediatamente perfundidos com PBS, conforme descrito no documento anexo. O aspecto mais difícil desse procedimento é a perfusão intracardíaca.

Uma série de dicas de solução de problemas são descritas aqui: Com o mouse preso em uma placa de dissecação de isopor. Dentro de uma bandeja de dissecação. Limpe o lado ventral com etanol a 70% e, em seguida, use uma tesoura grande e uma pinça para abrir a pele ao longo da linha média para expor a cavidade torácica, dobrar e prender a pele para os lados.

Segure o esterno com uma pinça fina e corte o diafragma e ao longo de ambos os lados do esterno, cortando as costelas. Tome cuidado para não danificar nenhum vaso sanguíneo grande. Prenda a caixa torácica pelo esterno frouxamente ao lado da cabeça.

Segure os ventrículos com uma pinça fina e faça uma incisão cuidadosa no átrio direito com uma tesoura fina. Insira uma agulha de calibre 23 conectada ao sistema de perfusão por gravidade no ventrículo esquerdo em direção à aorta ascendente. Enquanto o PBS estiver funcionando, insira apenas 0,5 centímetros da ponta da agulha e perfunda o mouse por cinco minutos ou até que o efluente esteja limpo.

Após a perfusão interal, disseque o cérebro e coloque-o em um tubo de centrífuga de 10 mililitros contendo RPMI. Média. Coloque o cérebro recém-colhido em cima de um filtro de células de aço inoxidável de 40 a 60 mesh em uma placa de Petri contendo três a cinco mililitros de meio de cultura de tecidos RPMI. Corte o tecido cerebral em pequenos pedaços.

Em seguida, usando um êmbolo de cristal, empurre pequenos pedaços de tecido cerebral através do filtro celular. Transferir o homogeneizado cerebral para um tubo de 10 mililitros e centrifugá-lo a 250 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, rejeitar o sobrenadante e dissolver o pellet em três mililitros de RPMI.

Meio contendo colagenase D e cisne de DNA. Gire a mistura por 30 minutos em temperatura ambiente. Remova quaisquer detritos celulares empurrando a mistura através de um filtro de células de náilon de 70 mícrons.

Em seguida, incubar no gelo durante cinco minutos após a incubação num tubo de 10 mililitros. Cubra cuidadosamente o homogeneizado cerebral em uma centrífuga de almofada de chamada de sete mililitros a 30% por chamada a 400 vezes G por 20 minutos em temperatura ambiente com a interrupção. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em um mililitro de lise de glóbulos vermelhos, tampone e incube no gelo por cinco minutos.

Para lisar pbcs aderentes, que não são removidos do cérebro por perfusão intraoral. Adicione nove mililitros de células de lavagem do meio RPMI e centrifugue a 250 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Resus suspende os leucócitos sequestrados cerebrais ou BSL contendo pellet em 50 a 100 microlitros de meio RPMI e transfere células para um tubo de microcentrífuga, conta células viáveis ao microscópio usando um hemocitômetro e exclusão de azul trian.

Seis dias após a infecção, 20.000 a 100.000 BSLs podem ser recuperados assim que as contagens de células viáveis forem obtidas. As células são preparadas para análise por citometria de fluxo. Os detalhes desse procedimento são fornecidos no documento anexo, mas são resumidos aqui primeiro.

Todas as células isoladas de cada cérebro são centrifugadas em um tubo de microfuga de 1,5 mililitro e são ressuspensas em tampão de coloração com anticorpos bloqueadores anti CD 16 e CD 32. Após uma incubação de 10 minutos no gelo, as células são lavadas com tampão de coloração centrifugado novamente e ressuspenso em tampão de coloração contendo anticorpos fluorescentes anti CD quatro, anti CD oito, anti TCR e anti NK 1.1. As células são incubadas em gelo por uma hora lavadas com coloração, tampão e centrífuga.

Após o spin, as células são ressuspensas em PBS e pelo menos 5.000 a 10.000 eventos são adquiridos em um citômetro de fluxo. Os dados resultantes são analisados usando o software de citometria de fluxo apropriado. As populações de BSL foram recuperadas de cérebros de camundongos perfundidos ou perfundidos pela ONU, infectados com malária e controle virgens e corados com anticorpos pe, anti NK 1.1 e PC anti TCR beta.

Esses gráficos de pontos representam porcentagens de células NK, linfócitos T, células positivas para TCR NK 1.1 e células duplamente negativas. NK 1.1 TCR negativo negativo em camundongos de controle perfundidos ou não fundidos, infectados com malária e virgens, consistentes com achados anteriores. As células T positivas para alfa beta TCR compreenderam uma alta proporção do pool de BSL em cérebros de camundongos infectados com malária perfundidos no sexto dia após a infecção.

Essa população pareceu estar significativamente sub-representada em cérebros de animais não perfundidos. A aparente redução das frequências de células T em cérebros não perfundidos foi associada a uma porcentagem consideravelmente maior e número total de células duplamente negativas nesses animais. Altas porcentagens e números de células duplamente negativas em cérebros não perfundidos não foram detectados apenas em camundongos infectados com malária, mas também em controles virgens, sugerindo que essas células são leucócitos não inflamatórios presentes nos vasos sanguíneos cerebrais que são recuperados junto com as células inflamatórias se a perfusão intracardíaca não for realizada.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar uma extensa profusão intracardio de camundongos infectados antes da extração do órgão para evitar a contaminação de leucócitos sequestrados com células circulantes não inflamatórias. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e analisar leucócitos sequestrados pelo cérebro de camundongos infectados com plasmodium virga por geometria fluida.