Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

O objetivo geral deste procedimento é rotular seletivamente as células ganglionares da retina em toda a preparação da montagem por meio de uma injeção de coto do nervo óptico de um corante indicador de cálcio. Isso é feito injetando primeiro um corante indicador de cálcio de alta afinidade, como o fluxo quatro no coto do nervo óptico. Em seguida, a retina é isolada da ocular e dividida em quadrantes para montar em uma lâmina de vidro Em uma câmara de gravação configurada para imitar condições fisiológicas, as contribuições dos canais de cálcio dependentes de voltagem para o sinal de cálcio.

Nas células ganglionares da retina podem ser medidas em células despolarizadas usando bloqueadores de canais. Em última análise, os resultados podem fornecer medições semiquantitativas da contribuição dos canais de cálcio educados em voltagem para um sinal, como um sinal de cálcio evocado por potássio alto. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como eletroporação e carregamento em massa, é a capacidade de rotular seletivamente as células ganglionares da retina e seus axônios em uma preparação de montagem inteira Armazene, disseque olhos radicais e hiberne um meio de mira ou solução semelhante.

Agora, se você pretende realizar experimentos de imagem de cálcio, preencha as células ganglionares da retina com fluxo quatro. Injete 0,5 microlitros de sal de quatro pentapotássio de fluxo milimolar de 40 milimolares, reconstituído em água no nervo óptico, coto aproximadamente um milímetro posterior ao globo ocular. Transfira o globo ocular para toques de mamíferos.

Borbulhou com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono ou uma hora em temperatura ambiente. Mantenha a preparação no escuro. Disseque os olhos ao microscópio com intensidade de luz controlada.

Usando uma lâmina de barbear, faça suavemente uma pequena incisão na frente do globo ocular e remova a córnea. Em seguida, remova a lente da superfície interna da retina usando uma pinça. Segure a esclera com firmeza.

Ao remover o vítreo com a outra pinça, descasque suavemente a base do vítreo em direção ao centro da retina. A preparação resultante, chamada de copo I, pode ser processada para preparação imuno-histoquímica de montagem inteira, preparação de imagem de cálcio ou preparada para seções transversais da retina para fazer uma preparação imuno-histoquímica de montagem completa. Primeiro, faça quatro cortes na retina para que ela fique plana.

Coloque a retina na lâmina de cobertura de vidro com a camada de células ganglionares voltada para baixo. Em segundo lugar, adicione uma gota de solução à retina e cubra-a com papel de filtro de celulose, se necessário, alise a retina com uma escova ou fórceps. Terceiro, quando a retina estiver completamente plana e se desprender do papel de filtro, coloque-a de volta na solução.

Para processar a preparação primeiro, transfira-a para aldeído paraforme a 4% por 10 a 15 minutos. Em seguida, lave as retinas três vezes em tampão fosfato 0,1 molar a pH 7,4 por 30 minutos por lavagem por um total de 90 minutos. Em seguida, incube as retinas em 500 microlitros de solução de bloqueio durante a noite a quatro graus Celsius.

Esta solução é 5% de soro de cabra normal ou soro de burro em tampão fosfato com 0,3% de tritton e 0,1% de azida de sódio nos próximos cinco a sete dias, incubar as retinas na solução de anticorpo primário a quatro graus Celsius. A composição dessa solução deve ser alcançada empiricamente. Lave a solução de anticorpo primário assim que o fixador foi lavado.

Em seguida, incube as retinas em anticorpo secundário a uma concentração de um a 1000 durante a noite a quatro graus Celsius. Remova o anticorpo secundário com mais três lavagens e tampão fosfato. Em seguida, monte as retinas para visualização e sele com esmalte.

Essas lâminas devem ser armazenadas no escuro a quatro graus Celsius. Comece fazendo uma preparação de montagem inteira de imagem de cálcio a partir do copo I em toques. Primeiro, corte o tecido da retina em quadrantes.

Coloque um quadrante plano na câmara de registro com a camada ganglionar voltada para cima e, portanto, a camada fotorreceptora voltada para baixo. Seque cuidadosamente a área circundante com um lenço umedecido e coloque delicadamente a harpa untada no lenço de papel. Agora carregue a preparação retiniana no equipamento e termine de configurar o sistema de superfusão acionado por gravidade de oito canais.

Se a retina montada se mover depois que a harpa for colocada, remova e limpe cuidadosamente a harpa. Seque a área ao redor da retina e monte novamente a harpa super. Funda a câmara de registro com solução de ringer de mamíferos e mantenha a solução borbulhando continuamente com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono.

Primeiro, como um controle sem drogas, execute dois pulsos de potássio alto emparelhados de três milimolares a 60 milimolares por 33 segundos. Despolarizando, o RGC deve ativar os canais de cálcio dependentes de voltagem se a preparação estiver funcionando. Agora prossiga com os experimentos.

O bloqueador de canais de cálcio dependentes de nifedipina e voltagem tipo L é comumente usado para avaliar a contribuição dos canais de cálcio dependentes de voltagem tipo L para o cobalto do sinal de cálcio evocado por despolarização. Um bloqueador de canais de cálcio não específico pode ser usado para bloquear seletivamente os canais de cálcio dependentes de voltagem. Digitalize a preparação a cada cinco segundos para visualizar e adquirir imagens do rgc fluorescente.

Use a menor potência de laser possível. A excitação deve ser ajustada para 488 nanômetros e a emissão deve ser coletada com um filtro LP de 505 nanômetros. Usando os protocolos descritos, a imunomarcação foi realizada contra a proteína de células ganglionares R-B-P-M-S, que é uma proteína de ligação ao RNA com fluxo de splicing múltiplo. Quatro.

A coloração foi de fato limitada às células ganglionares com base na especificação do anticorpo. Em seguida, a contribuição dos canais de cálcio dependentes de voltagem para o sinal de cálcio nos GCs R foi estudada usando os valores de intensidade fluorescente adquiridos do rgc. Nos níveis basais, os axônios RGC e RGC podem ser vistos marcados com fluxo quatro.

Para adquirir valores de intensidade fluorescente, as ROIs foram colocadas nas células ganglionares, somata e/ou axônios. Após a aplicação de alto teor de potássio em toda a preparação da montagem, o sinal fluorescente do RG C'S aumentou. Isso foi seguido por uma redução subsequente nos valores de intensidade de fluorescência na presença de cobalto durante o segundo pulso de alto potássio.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como carregar seletivamente as células ganglionares da retina com uma matriz indicadora de cálcio sintético em uma preparação de montagem inteira.