Name: Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprenda a rotular células ganglionares da retina em preparações de montagem total usando injeção de corante indicador de cálcio no coto do nervo óptico. Este método permite estudar a dinâmica do cálcio em neurônios retinianos.

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Agradecemos ao Dr. S. Stella e Helen Vuong para contribuições para o protocolo de imagem de cálcio. Agradecemos Sheets Dr. K. para filmar as cenas de entrevista. Agradecemos ao Dr. Arlene Hirano por seus comentários sobre o manuscrito. Este projeto de pesquisa e desenvolvimento foi realizado pelos autores na Geffen de Medicina David na UCLA e é possível graças a um acordo de contrato que foi concedido e administrado pela Research &amp; Material Médico Comando do Exército dos EUA (USAMRMC) ea Telemedicina e Tecnologia Avançada Centro de Pesquisa (TATRC), em Fort Detrick, Maryland sob Número do Contrato: W81XWH-10-2-0077. O suporte para esses estudos também vieram NIH EY04067 e uma revisão Mérito VA (NB). BCN é uma VA Carreira de Investigação Scientist.

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações para o bem-estar dos animais experimentais de emissão da Política de Serviço de Saúde Pública dos EUA em Cuidado Humano e Uso de Animais de Laboratório e da Universidade da Califórnia-Los Angeles (UCLA) Comitê de Pesquisa Animal. Foram utilizados Macho e fêmea adultos ratos Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) entre a idade de 3-5 semanas. 1. Animais e Preparação de tecidos para Wholemount Retina e imunohistoquímica Protocolo <ol><li> Prepare os seguintes materiais e ferramentas: um microscópio de dissecação, 2 pinças com pontas muito finas, tesouras, papel de filtro de celulose, pipeta de plástico e uma lâmina de microscópio. </li><li> Eutanásia o rato numa câmara fechada por profundamente anestesiar os animais com 1-3% de isoflurano seguido por decapitação com uma guilhotina. Remover os olhos com um par de tesouras e de íris lugar em uma placa de Petri contendo a solução extracelular. Hibernate A, Ames-medium ou soluções fisiológicas são recomendados. </li><li> [Etapa opcional se aterro de CGR com Fluo-4 é desejado]. Realizar a rotulagem de Fluo-4, conforme descrito no 2,3-2,4 passos. </li><li> Utilizando o microscópio de dissecação (intensidade de luz: 1,6 x 10 8 fotões / mm 2 ⋅sec), remover a córnea cortando a parte dianteira do globo ocular. Retirar a lente e vítreo a partir da superfície interior da retina com uma pinça. Para remover o vítreo, estabilizar o globo ocular, mantendo a esclera firmemente com uma pinça. Descascar delicadamente a base vítrea para o centro da retina com a outra pinça. A preparação nesta fase é chamada a ocular, a qual é usada para criocortes. Mais detalhes sobre criocortes podem ser encontradas em referências 14,15. </li><li> Retire a retina do ocular. Em seguida, faça quatro cortes para permitir a retina para colocar o plano. Gentilmente montar a retina numa lâmina de microscópio com o fotorreceptor camada de cima. Adicionar uma gota de solução para a retina e colocar cepapel de filtro llulose na retina. Uma vez que a retina atribui ao papel de filtro, colocar a retina para trás em solução. Se necessário, achatar a retina com uma escova ou uma pinça. </li><li> Coloque as retinas wholemounted em PFA 4% por 10-15 min para fixação. </li><li> Lavam-se as retinas wholemounted três vezes durante 30 min em tampão fosfato 0,1 M (PB), pH 7,4. Bloquear as retinas com 5% de soro normal de cabra ou soro de burro em PB 0,1 contendo 0,3% de Triton X-100 a 0,1% e NaN 3 a 4 ° C durante a noite. Recomendamos um volume final de 500 mL para todas as etapas para salvar soluções de bloqueio e anticorpos. </li><li> No dia seguinte, incubar as wholemounts retinas com os anticorpos primários 5-7 dias a 4 ° C. As diluições ótimas deve ser determinado pelo usuário. </li><li> Lava-se a retina 3 x 30 min em 0,1 M PB e incubar durante a noite a 4 ° C, em que o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo correspondente que é dirigido contra a espécie de anticorpo primário (concentração de 1: 1000). </li><li> Após três lavagens final de 30 min cada um com PB, montar as retinas em meio de montagem. Vedar as lamelas com unha polonês para o armazenamento prolongado. Armazene as amostras a 4 ° C e proteger da luz. </li></ol> 2 Rotulagem de células ganglionares e axônios Rat Wholemount Retinas com Cálcio Indicador Dye <ol><li> Preparar 1000 ml de Ringer de mamífero contendo (em mM) 125 de NaCl, 3 de KCl, 2 CaCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 de MgCl2, 25 de NaHCO3, 10 de glucose e borbulhado com 95% de O2 / 5% de CO &#173; 2. </li><li> Efectuar a dissecção como descrito no 1,2-1,4 passos. </li><li> Para carregar as células ganglionares da retina (RGCs) e seus axónios com um corante indicador de cálcio, injectar 0,5 ul de Fluo-4 sal pentapotássio (40 mM em H 2 O) para o coto do nervo óptico de cerca de 1 mm posterior ao globo ocular, utilizando uma seringa . Para medir um aumento dinâmico em células ganglionares da [Ca2 + </sup&gt;] i um indicador com elevada afinidade, tais como Fluo-4 com o seu K d de 345 nM, é óptima. Fluo-4 oferece a vantagem adicional de possuir uma elevada eficiência quântica, resultando num aumento das emissões de&gt; 100 vezes quando ligado ao cálcio. </li><li> Coloque a ocular no borbulhar com 95% de O2 / 5% de CO de Ringer de mamífero &#173; 2, durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro. </li></ol> 3. Cálcio imagem Protocolo de células ganglionares da retina e axônios. <ol><li> Remover o olho, da lente e vítreo, tal como descrito nos passos 1,1-1,4. Isolar a retina do ocular e divida em quadrantes. Montagem lado de células ganglionares um quadrante se numa lâmina de vidro e usar uma grade fatia harpa para estabilizá-la. Mantenha as outras peças escuro adaptado em aeradas com 95% de O2 / 5% CO mamíferos de Ringer &#173; 2 em gelo para posterior utilização. </li><li> Superfuse a câmara grava com solução de Ringer e mamíferosmanter a solução borbulhar continuamente com 95% O2 / 5% de CO 2. </li><li> Imagem do tecido sob o microscópio. Realizar experiências à temperatura ambiente (~ 23 ° C), ou atingir temperaturas fisiológicas por aquecimento da fase, o aquecimento do banho de água por baixo da amostra, ou a aplicação de ar quente para a superfície do espécime. Nota: É importante notar que muitas funções celulares são regulados pela temperatura, que desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase intracelular 16. No entanto, a introdução de medidas de aquecimento pode aumentar a taxa de fotodegradação, a evaporação do desvio médio e foco causada pela expansão térmica 17. Utilização de temperatura ambiente diminui compartimentalização intracelular de Fluo-4 18. </li><li> Executar um controlo de dois de K + pulsos emparelhados elevados na ausência de drogas. Despolarizar RGCs e RGC axónios através do aumento da [K +] o de 3 mM a 60 mM durante 33 segundos, durante cada pulso para activarVGCCs com um sistema de superfusão impulsionado oito gravidade canal. Reduzir o Na + por 57 mM para manter isosmolarity na solução de elevado K +. </li><li> Avaliar a contribuição de diferentes VGCCs ao sinal de cálcio com o uso de bloqueadores dos canais de Ca gerais ou específicas. Por exemplo, a redução no sinal de cálcio após a administração de um bloqueador do canal de cálcio não-específica, o cobalto, fornecida uma medida semi-quantitativa da contribuição dos VGCCs ao sinal -evoked cálcio de K + elevado. </li><li> Adquirir os valores de intensidade de fluorescência através da colocação de uma região de interesse (ROI) em torno das CGR de interesse (Figura 2). </li><li> Normalizar a mudança na intensidade de fluorescência produzida pelo segundo pico de K + elevado para a alteração produzida por o primeiro pico de K + elevado. Em seguida, para o teste de bloqueadores dos canais de cálcio específicos, aplicar drogas apenas durante o segundo pulso de K + elevado de um par e normalizar este pico contrao primeiro valor de pico. Para medir o efeito do fármaco sobre a K + elevado pico, dividir a amplitude do segundo pico de K + pelo que a do primeiro. A análise deve ser executada em estes valores em relação aos seus controlos correspondentes derivados de K + elevado emparelhado picos medidos na ausência de fármaco. </li><li> Adquira imagens em intervalos de 5 seg. Para evitar a foto-branqueamento, manter o laser de excitação o mais baixo possível. Fornecer excitação pela linha 488 nm do laser de árgon, enquanto o tubo fotomultiplicador recolhe a emissão de fluorescência através de um filtro PB de 505 nm. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm divulgações.

Neste artigo, descrevemos duas técnicas diferentes: 1) Imunohistoquímica para mostrar Fluo-4 de localização para as células ganglionares da retina em wholemounts, e 2) Imagem de cálcio para analisar a dinâmica de cálcio em células ganglionares da retina e seus axônios. A imuno-histoquímica utilizando wholemounts foi usado para revelar a localização de proteínas no roedor retina 20-23. No entanto, existem algumas limitações. A qualidade da coloração depende muito da capacidade do a...

As células ganglionares da retina (RGCs) expressar L, N, P / Q e T-tipo VGCC como determinado por meio do bloqueio farmacológico desses componentes de toda a célula actual canal Ca 1,2. VGCC são proteínas transmembrana multimï¿½icos que estão envolvidos na liberação do transmissor, a transcrição do gene, regulação celular e sináptica 3,4,5 plasticidade. VGCCs funcionais são compostos de pelo menos três classes distintas de subunidades: grandes, transmembrana α 1 poro formando subunidades que estabelecem propriedades biofísicas e farmacológicas do canal, principalmente extracelular α auxiliar 2 δ subunidades e subunidades β intracelulares. Os dois últimos formam complexos heteromï¿½icas com diferentes α um subunidades e alterar a cinética de propagação e tráfico de canais para a membrana plasmática 6. Nas últimas décadas, várias técnicas têm sido empregadas para estudar expre proteínassion, tais como imuno-histoquímica, ligada ensaio imunoenzimático, análise de Western e citometria de fluxo. Estas técnicas requerem a utilização de anticorpos específicos para a detecção de uma determinada proteína de interesse e fornecem ferramentas poderosas para a localização e distribuição de proteínas específicas em diferentes tecidos. As técnicas usadas para detectar e quantificar níveis de uma proteína particular de expressão de ARNm, tais como a análise de manchas de Northern, RT-PCR, em tempo real quantitativa de RT-PCR, hibridação in situ, de microarrays e ensaio de protecção de ribonuclease proporcionam uma abordagem alternativa, quando os anticorpos não são prontamente os níveis de expressão ou se disponíveis de uma proteína particular são baixos 7. No entanto, uma limitação para a utilização de tais técnicas moleculares é necessária a identificação da sequência do gene. Para localizar as proteínas na retina, imuno-histoquímica pode ser realizada em retinas wholemount. Devido à acessibilidade das CGR, a wholemountpreparação fornece uma plataforma excelente para o estudo da localização de proteínas específicas para o RGC somata e seus axónios. Em adição à sua localização, algumas propriedades funcionais dos VGCCs em CGRs pode ser demonstrada através da utilização de técnicas de imagiologia de cálcio. Descreve-se um protocolo de imagens de cálcio para etiquetar selectivamente CGR com um corante indicador de cálcio para medir a dinâmica de cálcio intracelulares. A contribuição de diferentes VGCCs ao sinal de cálcio em diferentes compartimentos celulares podem ser isoladas com o uso de bloqueadores dos canais de Ca específicos do subtipo. Talvez um dos aspectos mais benéficos da técnica de imagiologia de cálcio descritos aqui é a capacidade de gravar, simultaneamente e de forma independente a partir de múltiplas CGR e seus axónios. Embora muitas técnicas fisiológicas, como a correção de células gravação braçadeira todo, proporcionar gravações de alta resolução temporal das correntes de membrana, o somático ou fonte axonal de these correntes gravados não podem ser discriminados e gravações só pode ser feita a partir de um único neurónio de cada vez. Matrizes multieletrodo (AMA) são capazes de gravar simultaneamente picos de muitas células, mas podem detectar e nem discriminar a ativação de, por exemplo, diferentes subtipos de canais de cálcio. Meas preferencialmente gravar a partir de células que estão localizadas na proximidade de um determinado eletrodo 8 e gravar a partir de células que geram grandes picos de 9. Métodos de imagem Optical fornecer uma estratégia alternativa para permitir que as gravações simultâneas e independentes de populações inteiras de células que podem ser integrados com as informações obtidas a partir de uma única célula de microeletrodos e remendo gravação de fixação e gravação de MEA. Embora tenham sido empregues as técnicas de imagiologia de cálcio descritos aqui para estudar a dinâmica de cálcio de CGRs, sujeição do emplastro e AAM também podem ser utilizados em paralelo para elucidar as correntes iónicas e propriedades spiking de CGRs. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Como as células amácrinas deslocadas compõem cerca de 60% ​​da população dos neurônios da camada de células ganglionares da retina do rato 10, o nosso objetivo era usar uma técnica de carga que rotula seletivamente CGR com um corante indicador de cálcio sintético em um preparação wholemount. Embora corantes indicadoras de cálcio sintéticos fornecem uma excelente plataforma para o estudo da dinâmica de cálcio intracelular, a sua utilização generalizada tem sido dificultado pela incapacidade para carregar de forma eficaz as populações específicas de neurónios no interior de uma determinada rede. Muitas técnicas, tais como volume de carga 11 e eletroporação 8,12 foram realizados para carregar populações inteiras de células, no entanto, essas técnicas não discriminar entre tipos específicos de células. Geneticamente codificado indicadores de cálcio fornecem a capacidade para identificar selectivamente populações específicas de células, no entanto, estes métodos requerem a geração de animais transgénicos 13. Nossa técnica descreve uma metod etiquetar seletivamente CGR na preparação wholemount via óptica injeção coto do nervo de um corante indicador de cálcio. Tomadas em conjunto, as técnicas estruturais e fisiológicas descritas neste artigo fornecer uma plataforma para o estudo da localização e da contribuição dos VGCCs para o sinal de cálcio no CGR e seus axônios.

<table><tbody><tr><td>Tesoura reta</td><td>WPI</td><td>14124-G</td><td>Ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>Pinça reta</td><td>WPI</td><td>501985</td><td>ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>tesoura de íris curva</td><td>WPI</td><td>504487</td><td>ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>Papel de filtro de celulose</td><td>Millipore</td><td>HABP04700</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A</td><td>Invitrogen</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp; productID=A1247501">A12475-01</a></td><td>Media</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp; rct = j & q=& esrc=s& fonte = web & cd=1& cad=rja& sqi=2& ved=0CC0QFjAA& url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279& ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw& usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA& sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg& bvm=bv.48705608,d.cGE">Mídia de montagem para fluorescência</a></td></tr><tr><td>Fluo-4 pentapotássio</td><td>Invitrogen</td><td>F-14200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbott Laboratories</td><td>05260-05</td><td>anestesia</td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 5 Microscópio Pascal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 40X (NA 0,8) objetiva lente</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorpo</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11034</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>ProSci, Poway, CA</td><td></td><td>Um anticorpo policlonal de coelho&nbsp; foi gerado contra o terminal N do RBPMS&nbsp; polipeptídeo (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, por um fornecedor comercial (ProSci, Poway, CA).</td></tr></tbody></table>

os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em wholemount rat retina

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Neste artigo descrevemos as ferramentas, os reagentes e os passos práticos que são necessários para: 1) preparação bem-sucedida de retinas wholemount para imunohistoquímica e, 2) imagens de cálcio para o estudo da tensão fechado de canais de cálcio (VGCC) mediada sinalização de cálcio na retina células ganglionares. O método de imagem de cálcio que descrevem problemas contorna relativas à carga não-específica de células amácrinas deslocadas na camada de células ganglionares.

Imunomarcação com anticorpos específicos proporciona uma plataforma para o estudo da localização de proteínas de interesse particular na retina e na técnica de imagiologia de cálcio permite o estudo da contribuição dos VGCCs para a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axónios. Ao utilizar um anticorpo contra as células ganglionares RBPMS proteína (proteína de ligação de ARN com splicing múltipla) que rotula selectivamente CGRs 19, fomos capazes de demonstra...

Imunohistoquímica protocolos são usados ​​para estudar a localização de uma proteína específica na retina. Técnicas de imagem de cálcio são utilizados para estudar a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axônios.

Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

O objetivo geral deste procedimento é rotular seletivamente as células ganglionares da retina na preparação de montagem inteira por meio de uma injeção no coto do nervo óptico com um corante indicador de cálcio. Isso é realizado primeiramente injetando-se um corante indicador de cálcio de alta afinidade, como o fluo-4, no coto do nervo óptico. Em seguida, a retina é isolada da cúpula ocular e dividida em quadrantes para ser montada em uma lâmina de vidro. Em uma câmara de registro montada para simular condições fisiológicas, são avaliadas as contribuições dos canais de cálcio ativados por voltagem para o sinal de cálcio.Em células ganglionares da retina, é possível medir canais de cálcio dependentes de voltagem em células despolarizadas utilizando bloqueadores de canais. Em última análise, os resultados podem fornecer medidas semi-quantitativas da contribuição desses canais de cálcio ativados por voltagem para um sinal, como um sinal de cálcio induzido por alto potássio. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como eletroporação e carregamento em massa, é a capacidade de rotular seletivamente as células ganglionares da retina e seus axônios em uma prep

immunohistochemical-calcium-imaging-methods-wholemount-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese...

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

O protocolo descrito aqui é para avaliação estrutural de uma preparação retiniana de montagem total. Isso inclui descrições de dissecção tecidual, montagem em uma inserção de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofilizada, carregamento em bolus com marcadores fluorescentes e uma comparação da fixação com carbodiimida e paraformaldeído para análise imuno-histoquímica de componentes celulares e sinápticos.

Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

Nós descrevemos um protocolo para acompanhar a dinâmica de Ca2 + nos terminais do axônio de cones fotorreceptores, utilizando uma preparação fatia ex-vivo da retina mouse. Este protocolo permite que os estudos exaustivos sobre cone Ca 2+ sinalização em um importante sistema de modelo de mamífero, o rato.

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Vamos demonstrar três técnicas de preparação de tecidos diferentes para visualização de imuno-histoquímica de pericitos microvascular da retina do rato, ou seja, crio-seções, todo-montagens e hipotônica isolamento da rede vascular.

Cryo-seções da retina, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada preparações para visualização de imuno-histoquímica de pericitos Microvascular

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

Apresentamos um protocolo para expor o tronco cerebral do rato adulto do lado ventral. Usando uma lente de índice gradiente-refrativo com um microscópio em miniatura, a imagem de cálcio pode ser usada para examinar a atividade de somata neural inferior de oliva in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

O presente protocolo descreve a confecção de uma grande janela craniana (6 x 3 mm2) usando envoltório de alimentos, silicone transparente e vidro de cobertura. Esta janela craniana permite experiências de imagem de cálcio in vivo de campo largo e de dois fótons no mesmo rato.

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Este protocolo detalha o procedimento para obter imagens de respostas de cálcio no colículo superior (CS) de camundongos acordados, incluindo a obtenção de imagens da atividade de um único neurônio com microscopia de dois fótons, deixando o córtex intacto em camundongos selvagens, e a obtenção de imagens de todo o SC com microscopia de campo largo em camundongos mutantes do córtex parcial.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

As próteses retinianas têm a capacidade de gerar percepções visuais. Para avançar no desenvolvimento de novas próteses, são necessários métodos ex vivo para testar os dispositivos antes do implante. Este artigo fornece um protocolo abrangente para o estudo da atividade do cálcio na camada de células ganglionares da retina quando submetido à estimulação elétrica.

Imagem de cálcio em retinas planas eletricamente estimuladas

Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECI) permitem uma análise robusta em nível populacional da sinalização de neurônios sensoriais. Aqui, desenvolvemos uma nova abordagem que permite a visualização in vivo do GECI da atividade dos neurônios dos gânglios trigeminais de ratos.

In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

Este protocolo descreve o procedimento para isolar a retina de camundongo de montagem inteira e realizar imunocoloração para marcar todas as células ganglionares da retina (RGCs). O processo é seguido por imagens e contagem automática de RGCs usando software baseado em IA, fornecendo um método simples, rápido e preciso para quantificar RGCs em toda a retina do camundongo.

Imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina de camundongos

Aprenda a rotular células ganglionares da retina em preparações de montagem total usando injeção de corante indicador de cálcio no coto do nervo óptico. Este método permite estudar a dinâmica do cálcio em neurônios retinianos.

Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

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