שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להמיר תאים שמקורם בטפילי מוח אנושיים לנוירונים מושרים. זה מושג על ידי בידוד ותרבית של תאים שמקורם בטפילים מדגימות מוח כירורגיות. לאחר מכן, לאחר ההתרחבות, תאים במבחנה מסומנים כסמנים טפיליים, מה שמאפשר אפיון והעשרה נוספת של התאים.

לאחר מכן תאים שמקורם בטפיל עוברים טרנספורמציה עם וקטורים רטרו-ויראליים המקודדים גורל עצבי על מנת להמיר אותם ישירות לנוירונים מושרים. מתקבלות תוצאות המראות נוירונים מושרים המתקבלים מתאים שמקורם בטפיל מתוכנתים מחדש על סמך צביעה חיסונית לסמן העצבי בטא שלוש טובולין. היתרון העיקרי של גישה זו על פני שיטות קיימות כמו תכנות מחדש של פיברובלסטים או התמיינות של תאי גזע עובריים לתאי עצב הוא שאנו מכוונים לתאים אנדוגניים למוח, מה שעשוי בסופו של דבר לסלול את הדרך להמרת שושלת ישירה בתוך המוח מבלי שנצטרך להשתיל את התאים.

הפרוטוקול הבא פותח בהתאם לאישור הוועדה האתית של הפקולטה לרפואה של LMU מינכן והסכמה מדעת בכתב של כל המטופלים החל מביופסיה טרייה של מוח אנושי. שמור על קרח ב-HBSS וערימות מפרקות את הרקמה לתאים בודדים על ידי העברתה לצלחת פטרי בגודל 65 מילימטר ובאמצעות שני אזמלים סטריליים לשימוש חד פעמי, טוחנים אותה לחתיכות קטנות. העבירו את הרקמה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר והוסיפו שלושה עד שישה מיליליטר של טריפ לה אינקובאט למשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.

לאחר תגובת העיכול, הוסף נפח אחד של מדיום גידול טרום חם כדי להקל על האסוציאציה והשתמש בפיפטה חד פעמית של חמישה מיליליטר ואחריה פיפטה מרעה מזכוכית כדי לדרג בעדינות את תרחיף התאים. סובב את התמיסה ב-157 Gs למשך חמש דקות. השהה מחדש את הגלולה במצע הגידול והעביר את התרבית לבקבוק T 75.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-5% חמצן. החלף מחצית מהמדיום כל שלושה עד ארבעה ימים עד שהתאים הגיעו לשטף פעולה. כאשר התאים הגיעו לשטף פעולה, שאפו את מדיום התרבית ושטפו עם PBS בטמפרטורת החדר לפני הוספת שלושה מיליליטר של טריפל.

לאחר דגירה של חמש עד 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. הקש בעדינות על הבקבוק כדי לעזור להרים את התאים. לאחר מכן הוסף שלושה נפחים של מצע גידול לאחר סיבוב התרחיף והחייאת התאים במדיום הגידול, העביר אותם ביחס של אחד לשלושה לתשואה אופטימלית לתוך צלוחיות תרבית T 75 חדשות.

התאים הועברו עד חמש פעמים ללא כל סימנים של תכנות מחדש מופחת ומספר תאי האנדותל יהפוך לזניח עם כל מעבר לביצוע זרעי כימיה של ציטו חיסוני כ-60,000 תאים על פולי D ליזין. כיסוי זכוכית מצופה מחליק ב-500 מיקרוליטר של מצע גידול טרי ב-24. ובכן צלחות תרבית רקמות ותרבות.

התאים למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-5% חמצן. לניתוח אימונוכימי של תאי המוח האנושיים המתורבתים, הסר את המדיום ושטוף שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS. מוסיפים 500 מיקרוליטר של 4% פרלדהיד ב- PBS ודוגרים למשך 15 דקות.

בטמפרטורת החדר. העבירו את החלקות מכסה הזכוכית לתא צביעה לח מתאים והוסיפו 80 מיקרוליטר של בלוק P-B-S-B-S-A Triton X 100 למשך שעה בטמפרטורת החדר לפני הוספת נוגדנים ראשוניים מדוללים באותה תמיסה ודגירה של שעה בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים לפני הוספת נוגדנים משניים ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר הכביסה שלוש פעמים, יש למרוח מדיום נגד דהייה ולהרכיב את החלקות הכיסוי. השתמש במיקרוסקופיה אפי פלואורסצנטית או קונפוקלית כדי לנתח את הדגימות. הקפידו על הנחיות הבטיחות הביולוגית המקומיות בעת טיפול בחלקיקים רטרו-ויראליים 24 שעות לפני זרעי התמרה רטרו-ויראליים, כ-60,000 תאים למעלה.

כיסוי זכוכית מצופה פולי דה ליזין מחליק ב-500 מיקרוליטר של מצע גידול טרי ב-24. ובכן צלחות תרבית רקמות ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת.

החלף את מצע הגידול ב-500 מיקרוליטר של מצע גידול טרי וטרום חם והוסף מיקרוליטר אחד של הסופרנטנטים המרוכזים בהתאמה המכילים חלקיקים רטרו-ויראליים. יש לנער בעדינות את הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד של חלקיקים נגיפיים בכל הבאר. יום לאחר מכן, הסר את המדיום עם חלקיקים נגיפיים מהתאים והוסף מיליליטר אחד של חום טרי.

מדיום התמיינות B 27 כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, שומר על התאים בתרבית במשך ארבעה עד שמונה שבועות מבלי לשנות את המדיום מכיוון שהדבר עלול לפגוע בנוירונים מושרים כשהם מתבגרים כדי להדגים רכישת פנוטיפ עצבי. בצע כימיה של ציטו חיסוני כנגד אנטיגנים עצביים כגון בטא שלוש, טובולין, מפה שתיים ו-nen. כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, כימיה של ציטו חיסוני המבוצעת על תרביות מבוססות בהצלחה מקליפת המוח האנושית הבוגרת חושפת מידה ניכרת של הטרוגניות בין תרביות שמקורן בדגימות של חולים שונים כפי שכומתו על ידי ציטומטריית זרימה.

יש חלק ניכר מהתאים המבטאים P, DG, FR, בטא וסמני טפילים אחרים כגון CD 1, 46, NG 2 ו-CD 13 מתבטאים ברמות נמוכות יותר. כמו כן, SMA מתבטא בתת-אוכלוסייה מינורית של תאים מתורבתים במעבר אפס, בדרך כלל יש פחות מ-10% מתאי אנדותל חיוביים ל-CD 34 והם יורדים מתחת לזיהוי עם אריזה נוספת. באופן דומה, אסטרוציטים מהווים רק זיהום זניח במעברים מוקדמים יותר.

נתוני פיטוכימיה אימונוכימית וזרימה ציטומטרית מאומתים במלואם על ידי R-T-P-C-R-A כמותית. העשרה נוספת של תאים שמקורם בטפילים יכולה להיות מושגת על ידי עובדות בשלב זה. זה רלוונטי במיוחד כאשר טוהר התרבית נמצא בקצה התחתון של הספקטרום כפי שמשתקף ברמת ביטוי הבטא של P-D-G-F-R.

לפיכך, השתמשנו בנוגדנים כנגד P-D-G-F-R בטא CD אחד 40B לבד או בשילוב עם נוגדן נגד CD 1 46 תוך אי הכללת כל מזהמים חיוביים CD 34 למיון עובדות. באופן ספציפי, טפילים המתמירים תרביות אלה עם נגיפי ביקורת אינם משנים את פרופיל הביטוי שלהם, מה שמצביע על כך שהם נשארים בשושלת הטפילים. כמו כן, ביטוי מתווך רטרו-וירוס של SOX 2 לבדו אינו גורם לשינויים במורפולוגיה ואינו גורם לביטוי בטא שלוש טובולין.

לעומת זאת, כ-10% מהתאים הומרו עם A SCL המקודד רטרו-וירוס בלבד. הפגינו ביטוי בטא שלושה טובולין, אך לא רוכשים מורפולוגיה עצבית באופן בולט כמעט 50% מכולם, אז שניים ו-SCL עריסה אחת. תאים מותמרים מראים ביטוי בטא שלושה טובולין, ושליש מהם מציגים גם תהליכים עצביים המעידים על גורלם המרה ל-PNS לביצוע הליך זה.

ניתן להשתמש בטכניקות אחרות כמו אלקטרופיזיולוגיה של תיקון ggl על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות להתבגרות ולפונקציונליות של נוירונים מושרים.