חיים הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים באמצעות מערכת תרבות 2D

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להתבונן בהתנהגויות תאים במהלך התקדמות השושלת מתאי גזע עצביים לתאי עצב או תאי גליה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום הנוירו-התפתחותי כגון תפקידן של חלוקות תאים סימטריות וא-סימטריות, הארכת מחזור התא ושיעורי גדילת התאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת התבוננות בשושלת התאים לתקופות ארוכות.

זה מאפשר התבוננות במעבר מנוירוגנזה ליצירת גליה בתוך שושלת אחת ושילוב ישיר של אבות עצביים וגליה תת-ליניאריים. התחל בהסרת המוחות מ-5 עד 10 עוברי e14 בצלחת פטרי עם מדיום דיסקציה קרה. השתמש במלקחיים כדי לשלוף בזהירות את העור והגולגולת ולבודד את המוח.

תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ הסטריאו, השתמש במלקחיים לדיסקציה כדי להסיר את קרומי המוח. לאחר מכן, פצלו את הטלנצפלון באמצע כדי להפריד בין ההמיספרות. כדי לבודד את הטלנצפלון הדורסולטרלי, חתוך לאורך העקומה הגבית וגבול הפאליו והתת-פאליום.

העבירו את הטלנצפלונים האחוריים לצינור של 2 מ"ל עם מדיום דיסקציה על הקרח עד שכל המוחות מנותחים. לאחר מיקרו-דיסקציה של הטלנצפלון הדורסולטרלי, הנח את הרקמה בצינור חרוטי של 15 מ"ל. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור המכיל את הרקמה שנאספה במדיום דיסקציה קרה למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ופי 340 G כדי לזרז את הרקמה.

לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט בעזרת פיפטה והוסף 1 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס 0.05% טריפסין-EDTA לעיכול כימי. דגירה למשך 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הוסף 2 מ"ל של מדיום התפשטות כדי לעכב את פעילות הטריפסים.

לאחר מכן, יש ללטש את קצה פיפטת פסטר מזכוכית מעל מבער גז או מבער בונסן למשך מספר שניות כדי לצמצם מעט את הצמצם. Asperate FCS לציפוי קצה הפיפטה. לאחר מכן נתק מכנית את התאים עם פיפטת פסטר מלוטשת ומצופה FCS על ידי פיפטה למעלה ולמטה תוך הקפדה על יצירת בועות.

צנטריפוגה של התאים המנותקים למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ב-340 פעמים G.הסר את הסופרנטנט בעזרת פיפטה, ואז הוסף מילימטר אחד של מדיום התפשטות והשהה מחדש את התאים באמצעות פיפטה. הסר את ה-PBS מהצלחת המטופלת מראש עם Poly-D-Lysine. לאחר מכן צייר שלט בתחתית הצלחת שיכול לשמש כהתייחסות לקביעת נקודת האפס.

לאחר השעיית התאים במדיום התפשטות בפעם השנייה, הכינו דילול אחד לאחד של תרחיף התאים באמצעות תמיסה כחולה של 0.4%. טען לשקופיות תא הספירה וספור את מספר התאים הלא מוכתמים. תאים שאינם ברי קיימא יהיו כחולים.

לדלל את התאים במדיום התפשטות כדי לקבל 10 עד שישי תאים למילימטר. הוסף 500 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל באר של צלחת תרבית רקמה של 24 בארות ודגר תאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כדי לדמות תאים שעברו התמרת רטרו-וירוס, הנח את לוחית תרבית הרקמה בתא הדמיה המחובר לבקרי טמפרטורה ופחמן דו חמצני כדי לשמור על התאים בתנאים קבועים של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

בחר מיקום בציר xy שישמש כנקודת אפס וכייל את נקודת האפס. בחר 10 עד 15 מיקומים לכל באר להדמיה בהגדלה פי 10. הגדר את התוכנה לדרוש תמונות ניגודיות פאזה כל חמש דקות ותמונות פלואורסצנטיות כל שלוש שעות כדי להפחית את הפוטוטוקסיות.

בדוק והתאם את המיקוד בשלוש השעות הראשונות של הניסוי מכיוון שהוא עשוי להשתנות בזמן שהטמפרטורה מתאזנת. לאחר שבעה ימים, הפסק את הרכישה והמשך לאימונוציטוכימיה לאחר הדמיה. הפעל את תוכנת המעקב אחר תאים ובחר שם משתמש.

לחץ על בחר את שם המשתמש שלך והמשך. עיין ובחר את תיקיית העבודה tTt כדי לשמור עצי שושלת, סטטיסטיקות ותמונות מיוצאות. לאחר מכן, בחר את הניסוי לניתוח וטעינה.

אם התמונות הומרו בעבר על ידי ממיר tTt, לחץ על ממיר קבצי יומן וציין את מספר השניות בין שתי נקודות זמן רצופות בחלון ממיר קבצי יומן. לחץ על המרת קבצי יומן לכל הניסוי. בחר וטען את התמונות הרצויות באופן ידני או באמצעות האפשרות המוצגת בתוכנית.

בחר קובץ, פתיחה, מושבה חדשה. לחץ על מעקב, ולאחר מכן התחל מעקב כדי להתחיל את המעקב במיקום שנבחר. יופיע חלון סרט.

בחר את התא באמצעות עיגול המעקב ולחץ על מקש האפס. התוכנה תעבור למסגרת הבאה. המשך למקם את מעגל המעקב סביב תא המעקב באמצעות העכבר ולחץ על אפס בכל מסגרת כדי להוסיף סימן מעקב על התא.

השתמש במקשים 1 ו-3 כדי לעבור למסגרת הקודמת או הבאה. כדי למחוק סימן עקובה, פשוט לחץ על המיקום הנכון כדי לסמן ולחץ על אפס. אם התא התחלק, בחר מעקב, סיבת עצירה, חלוקה והמשך לעקוב אחר תא בת אחד על ידי בחירת אחד התאים בחלון עורך התאים, ולאחר מכן בחר מעקב, התחל מעקב.

כדי לעקוב אחר תא הבת השני, בחר אותו בעורך התאים והקש F2. אם התא מת במהלך מיקרוסקופ הווידאו, בחר אפופטוזיס. אם התא עוזב את שדה התצפית או מתערבב עם תאים שכנים ומונע מעקב, בחר אבוד. כדי להפסיק את המעקב ולהמשיך מאוחר יותר, לחץ על הפסקה.

בחלון עורך התאים, עץ ייווצר במהלך המעקב. כדי לשמור את עץ השושלת, בחר קובץ, שמור, עץ נוכחי בחלון עורך התאים. כדי לייצא את הסרט עם נתוני המעקב, כבו את מצב המעקב, ובחלון הסרט בחרו 'ייצוא סרט'.

הגדר את טווח הפורמט של המסגרות, מספר הפריימים לשנייה וקצב הסיביות. לחץ על התחל ייצוא. הפוטומיקרוגרפים הבאים מראים ניגודיות פאזה בתמונות פלואורסצנטיות GFP של תרבית תאי קליפת המוח הראשונית.

ביטוי GFP נעדר במהלך השעות הראשונות של ההדמיה. מספר התאים המבטאים GFP גדל עם הזמן ועוצמת הקרינה של GFP עולה כפי שמצוין על ידי החץ הצהוב בתמונות אלה. תמונת הגדלה גבוהה יותר זו באזור הקופסה של התמונה הקודמת מציגה את ה-GFP המבטא תאים בפירוט.

תמונות ניגודיות פאזה אלה מציגות דוגמה לחלוקת תאים. עיגול תאי אבות נראה כאן ואחריו התכווצות קרום התא ולבסוף, השלמת מיטוזה. זוהי דוגמה לעץ שושלת תאים בודדים.

חיצים צבעוניים מציינים מצבים שונים של חלוקת תאים, חלוקה פרוליפרטיבית סימטרית מוצגת על ידי החץ הצהוב. חלוקה אסימטרית מסומנת על ידי החץ הכחול. חלוקה סופית סימטרית מוצגת על ידי החץ האדום ו-X מציין מוות של תאים.

מספרים מציינים את אורך מחזור התא של תאי האבות. ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה עד שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להראות התנהגויות של תאים במהלך התקדמות שושלת התאים של תאי גזע לתאי עצב או לתאי גליה.