High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em E. coli

O objetivo geral do procedimento a seguir é usar um protocolo de triagem de expressão de alto rendimento para quantificar em e coli o nível de proteínas solúveis usando um robô automatizado de manuseio de líquidos. Isso é feito pela primeira inoculação.96. Pré-culturas de poços com células transformadas com plasmídeos que codificam as proteínas de fusão alvo no dia seguinte, 24 placas de poços preenchidas com meios de autoindução são inoculadas com as pré-culturas durante a noite para gerar expressão.

As culturas após a colheita e as proteínas solúveis congeladas das culturas de expressão são então purificadas por cromatografia de afinidade de metais imobilizados. Em última análise, os níveis de solubilidade para cada fusão de alvo intacto podem ser medidos para determinar as condições ideais de expressão para a produção de proteínas e a geração de alvos bem-sucedidos. A partir das vantagens desta técnica dos métodos tradicionais de maior eficiência, a radiação limitada em lote e a simplicidade do manuseio e rastreamento de dados A demonstração visual deste método é crítica.

As etapas automatizadas podem parecer assustadoras e difíceis de compreender apenas no formato de texto, pois o texto não transmite a rapidez ou simplicidade do procedimento. Após a transformação das bactérias, comece usando a pinça robótica para colocar de lado a tampa da primeira placa de ágar LB de 24 poços. Em seguida, use o braço de manuseio de líquidos de oito canais para misturar e aspirar 50 microlitros de mistura de transformação de uma placa de transformação de 96 poços.

Dispense a mistura de transformação dentro dos primeiros quatro canais do braço de manuseio de líquidos na primeira coluna da placa de ágar LB e as transformações dentro dos últimos quatro canais na segunda coluna da placa de ágar LB Lave bem todas as pontas após a distribuição e, em seguida, continue transferindo a mistura de transformação da placa de 96 poços para todos os poços nas próximas quatro colunas da placa de ágar LB até essa placa está terminada. Assim que a transferência para a primeira placa estiver concluída, recoloque a tampa e inicie a transferência para a próxima placa. Uma vez que todas as transformações tenham sido plaqueadas, agite todas as placas por um minuto a 1200 RPM para gerar uma distribuição homogênea da mistura de transformação.

Em seguida, após a mistura, use o braço multicanal 96 para aspirar 60 microlitros da mistura de transformação restante da placa de 96 poços e dispense a mistura em uma placa de 96 poços profundos contendo caldo LB. Sele as pré-culturas do poço profundo 96 com filme adesivo respirável para permitir a aeração da aeração da cultura e, em seguida, coloque a placa em uma incubadora de agitação de 37 graus Celsius na velocidade máxima durante a noite. Assim que as pré-culturas estiverem na incubadora, coloque as placas de ágar LB em um capuz com as tampas abertas por cerca de 10 minutos.

Em seguida, inverta as placas em uma incubadora de placas de 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use o braço de manuseio de líquidos para aspirar 100 microlitros da pré-cultura durante a noite em uma placa de 96 poços profundos para inocular as culturas de expressão em uma diluição de um 40º, usando o mesmo esquema de antes, lavando bem o braço de manuseio de líquidos na estação de lavagem entre cada coluna das pré-culturas. Quando a inoculação terminar, colocar as culturas de expressão em uma incubadora de agitação de 37 graus Celsius, selada com adesivo respirável por quatro horas.

Em seguida, reduza a temperatura para 17 graus Celsius para uma incubação noturna. Na manhã seguinte, centrifugue as placas do poço profundo 24 por 10 minutos a 3000 Gs.Descarte o sobrenadante em um recipiente de resíduos contendo um agente antimicrobiano e, em seguida, bata as placas de cabeça para baixo em papel absorvente para remover qualquer meio residual para verificar se as culturas cresceram corretamente. Verifique a presença de pellets no poço profundo.

Em seguida, aspire 125 microlitros de tampão de lise e dispense o tampão duas vezes em cada poço das 24 placas do poço profundo com quatro pontas em cada poço. Para atingir o volume final de um mililitro de tampão de lise para ressuspender os pellets, agite as placas a 1200 RPM por cinco minutos. No robô, transfira as suspensões de células de volta para os poços apropriados de uma placa de poço profundo 96 e armazene as placas seladas a 80 graus Celsius negativos por no mínimo uma hora.

Para esta demonstração, utilizaremos o protocolo com 50 microlitros de esferas de níquel para purificação das proteínas de fusão alvo. Primeiro, descongele a placa do poço profundo 96 em banho-maria por aproximadamente 15 minutos. Em seguida, suspender os lisados celulares na incubadora agitada na velocidade máxima por mais 10 minutos, as culturas devem se tornar viscosas.

Em seguida, use uma pipeta manual de oito canais para dispensar DNAs e sulfato de magnésio Misture em cada poço da placa 96 do poço profundo até uma concentração final de 10 microgramas por mililitro e 20 milimolares, respectivamente. Agite a placa selada por mais 15 minutos, momento em que a cultura deve se tornar não viscosa. Para evitar o entupimento da placa filtrante durante a purificação, é fundamental verificar cuidadosamente se nenhum dos lisados é mais viscoso.

No robô de manuseio de líquidos, use pontas de furo largo de 200 microlitros para misturar completamente a pasta de resina antes de transferir 200 microlitros da pasta para a placa de poço profundo 96 contendo o lisado. Agite a placa 96 do poço profundo a 1400 RPM e temperatura ambiente por 10 minutos para permitir a ligação e, em seguida, use as pontas de furo largo para misturar e transferir os 1200 microlitros completos de pasta de lisado de resina em alíquotas de 200 microlitros para a placa do filtro. Agora ligue o aspirador por aproximadamente 30 segundos para filtrar o lisado através da placa, coletando o fluxo em um poço profundo.

96 abaixo do poço profundo 96 contendo o fluxo é removido de baixo da placa filtrante e armazenado em uma prateleira até o final do experimento. Em seguida, lave a resina duas vezes com 800 microlitros de tampão de ligação cada vez após a segunda lavagem, use a pinça robótica para colocar uma placa 96 fresca, profunda e bem sob a placa do filtro para coletar a lavagem de 50 milimolares I midaz. Adicione 150 microlitros de tampão de lavagem na placa do filtro e aplique o vácuo novamente até que o tampão tenha passado pelo poço profundo 96 contido.

A lavagem é removida por baixo da placa filtrante e armazenada em uma prateleira até o final do experimento. Então, depois de lavar mais duas vezes com 800 microlitros de tampão de lavagem, conforme demonstrado para o tampão de ligação, as lavagens usaram a garra robótica para transferir a microplaca para a mesa de trabalho e colocaram o bloco SPE e a placa filtrante de volta em cima da microplaca para coletar o elucian. Em seguida, adicione 190 microlitros de tampão eluciano à resina na placa filtrante.

Após três minutos, aplique o vácuo por um minuto para permitir a passagem de todo o tampão. Verifique rapidamente e visualmente se os volumes Ellucianos estão corretos. Finalmente, amostras em bloco da lavagem Ellucian e fluxo através de placas para a quantificação do nível de expressão solúvel.

Analise primeiro a placa ellucian e somente quando necessário, verifique a lavagem relevante e o fluxo através das frações. Esses dados ilustram um resultado de eletroforese do sistema de chip de laboratório paquímetro. As proteínas de fusão clivadas intactas são representadas pelas bandas superiores com os fragmentos de proteína clivados representados como as bandas inferiores.

Os rendimentos de fusão para cada proteína-alvo foram determinados dentro dos intervalos de 0,1 a dois, dois a 10 e 10 a 25 microgramas por litro de cultura ou, em alguns casos, não foram detectados. A avaliação do sucesso da expressão da proteína pelo número de ligações dissulfeto presentes em cada fragmento de proteína de fusão demonstra um sucesso razoável para todos os números de ligações dissulfeto testadas, com o nível de sucesso mais baixo sendo de 66% para alvos contendo seis ligações dissulfeto. A análise da distribuição do sucesso da expressão com base no ponto isoelétrico e no número de resíduos não indica nenhum viés particular para a técnica com alvos expressos com sucesso e alvos que não foram detectados espalhados por toda a parcela.

Uma vez que as fusões tenham sido detectadas e clivadas, os alvos purificados passam por controle de qualidade por ionização por eletrospray, espectrometria de massa. Aqui, o alvo representativo mostrado é uma proteína de veneno rica em dissulfeto de 5,7 kilodalton com quatro ligações dissulfeto. Este espectro mostra os resultados para a proteína antes da redução com DTT, assim como após a clivagem e dessalinização sem intervenção adicional.

Este espectro mostra a proteína após a redução com TDT seguida de dessalinização para remover qualquer excesso de DTT. As setas indicam os íons correspondentes às massas experimentais e a designação de cada íon é indicada em verde. As massas parentais experimentais calculadas para esses íons são mostradas na tabela e correspondem a uma diferença de massa de oito Daltons, equivalente a quatro ligações sulfeto oxidadas.

Quando configurado, o protocolo completo pode ser realizado em mais de mil culturas em uma semana. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar culturas de e coli em pequena escala para identificar as condições bem-sucedidas necessárias para a produção de proteínas solúveis usando métodos de alto rendimento.