Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Este sistema experimental usa a infiltração agrícola para fornecer efetivamente construções gênicas às folhas para a produção de altos níveis de proteína recombinante. Primeiro, cultive as plantas de hamana em um ambiente controlado por seis semanas, três dias antes da infiltração. Preparar as culturas de agrobactérias que contêm o gene alvo a expressar nas plantas no dia da infiltração.

Introduza as culturas de agrobactérias no tecido vegetal por seringa ou infiltração a vácuo. Resultados como a intensidade da fluorescência verde de GFP em folhas de tabaco sob luz ultravioleta demonstram uma expressão robusta de proteínas recombinantes em plantas que rivaliza com a dos atuais sistemas de expressão baseados em bactérias e insetos de mamíferos. A infiltração agrícola é uma maneira eficaz de introduzir genes trans nas células vegetais, o que leva a um alto nível de expressão de proteínas recombinantes.

Pode ser usado para uma ampla gama de espécies de plantas. Mais importante ainda, pode ser ampliado para a produção comercial de proteínas farmacêuticas. Portanto, esse método pode fornecer informações sobre a cinética e a expressão da GFP e pode ser aplicado a outras proteínas, como vacinas de subunidades, anticorpos monoclonais recombinantes e pode ser usado em tratamentos para câncer e doenças infecciosas.

Um experimento bem-sucedido requer condições ideais tanto para a cultura de bactérias quanto para o material das plantas. Esse processo de infiltração é mais fácil de replicar após a demonstração visual. Comece colocando até 60 pellets de turfa em uma bandeja de propagação.

Adicione quatro litros de água da torneira e deixe os pellets de ervilha absorverem a água por duas horas. Agora, adicione duas sementes de hamana em cada pellet de turfa e cubra a bandeja com uma cúpula de plástico transparente para germinação. Coloque as sementes em um ambiente de 25 graus Celsius, 84% de umidade.

Duas semanas após a semeadura, remova a cúpula e transfira as plantas para uma nova bandeja. Em seguida, adicione dois litros de 1,48 gramas por litro. Fertilizante de Jack Continue a cultivar as plantas em um 25 graus Celsius.

ambiente 50%humidity cada dois dias. Forneça dois litros de fertilizante jack's por bandeja. Na quarta semana, transfira as plantas com pellets de turfa para uma nova bandeja que hospede seis plantas para um crescimento posterior até as seis semanas de idade.

Escolha plantas de quatro, seis semanas e hamama com cinco a seis folhas cada três folhas para infiltração completa com as cepas agrobacterianas que abrigam os genes de interesse. Uma folha para o controle negativo e uma folha para infiltração de manchas. Crie um pequeno corte com uma agulha na epiderme na parte de trás da folha, certificando-se de não perfurar a folha em ambos os lados.

Segure firmemente a parte da frente da primeira folha enquanto aplica uma leve contrapressão no pescoço. Com o polegar de uma mão. Injete as misturas de agrobactérias em tampão de infiltração no pescoço com uma seringa, uma agulha.

Continue a injetar as misturas de agrobactérias no nick até que o círculo verde mais escuro pare de se expandir. Em seguida, crie outro corte e repita as injeções até que toda a folha seja infiltrada e toda a folha fique verde mais escura. Infiltrações completas das três primeiras folhas e da última folha para a quarta folha de cada infiltrado de planta com combinações vetoriais de todos os quatro vetores virais de Gêmeos ou três vetores magcon.

Além disso, faça um corte para cada combinação de cepas de agrobacterium e infiltre cada corte com uma combinação. Após a infiltração, mova as plantas de volta para a sala de crescimento e monitore a expressão da proteína entre dois e 15 dias. Após a infiltração, coloque uma banheira em um dessecador a vácuo e transfira três litros de tampão de infiltração contendo as cepas de agrobactérias.

Em seguida, conecte o dessecador a uma bomba de vácuo de diafragma da marca de vácuo. Agora coloque uma planta de cabeça para baixo na placa dessecadora e abaixe a placa com a planta até que todo o sistema de folhas e caules esteja submerso no tampão de infiltração com a placa apoiada no topo da banheira. Em seguida, posicione o anel de vedação desidratado ao longo do aro.

Depois de colocar a tampa desidratada na câmara, ligue a bomba de vácuo e comece a cronometrar quando o vácuo atingir 100 milibar. Depois de desligar a bomba de vácuo, abra lentamente a válvula de liberação no dessecador após um minuto a 100 milibar para permitir a entrada de agrobactérias nos espaços intersticiais do tecido vegetal submerso. Repita essa infiltração.

Passos para garantir uma boa infiltração. Em seguida, remova a planta do desidratado e coloque-a de volta na posição vertical. Mova as plantas de volta para a sala de crescimento e monitore a expressão da proteína entre dois e 15 dias após a infiltração.

Para demonstrar a eficácia da seringa, infiltração de agrobacterium no tecido vegetal, testamos a expressão de duas proteínas fluorescentes, GFP e Ds red por dois vetores virais vegetais desconstruídos diferentes, Gemini, viral e magcon para final. Folhas de Hamana que foram totalmente infiltradas com agrobactérias contendo vetores virais de Gêmeos. A expressão de GFP foi observada em toda a área foliar sob luz UV, começando a partir de 2D PI e atingindo o pico de acúmulo em quatro DPI.

Em contraste, as folhas infiltradas com combinações de agrobactérias contendo vetor magcon apresentaram fluorescência de GFP somente após cinco DPI e atingiram seu acúmulo máximo em sete DPI. Nenhuma fluorescência verde foi observada nas folhas infiltradas com misturas de agrobactérias de controle negativo de EP one 10 mais P 19, indicando que a fluorescência era específica do gene GFP e não era o resultado da fluorescência de fundo das folhas. Em seu pico de acumulação, a fluorescência do vetor magcon expressa para GFP é mais intensa do que a do vetor viral Gemini.

Nenhuma necrose importante foi observada nas folhas infiltradas com construções GFP quando ambas as proteínas fluorescentes foram expressas na mesma folha por meio de vetores virais Gemini com infiltração de manchas de seringa, elas foram detectadas com sua cor fluorescente esperada no local onde foram infiltradas. Curiosamente, a co-infiltração de GFP e DS RED resultou em fluorescência amarelada. A infiltração a vácuo também foi examinada para desenvolver um método de agroinfiltração escalável que pode ser usado para produção em larga escala de proteínas recombinantes por sistemas de expressões transitórias de plantas.

Como esperado, a fluorescência GFP foi observada para todas as folhas da planta infiltrada em comparação com a infiltração da seringa. É mais robusto e pode alcançar a infiltração de cada planta com um prazo muito mais curto. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 48 horas.

Na maioria das vezes, é para cultura agrobacteriana, pois o tempo real de infiltração é de apenas alguns minutos para eficiência ideal de infiltração agrícola e expressão de proteína direcionada. Siga o protocolo. Lembre-se de controlar os parâmetros críticos, incluindo condições de crescimento das plantas, concentração de agrobactérias, pressão de vácuo e duração no campo da biotecnologia vegetal.

Esta abordagem experimental pode ser usada para explorar o desenvolvimento e a bioprodução de novas proteínas farmacêuticas em uma ampla gama de espécies de plantas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como usar a infiltração agrícola para fornecer construções de genes-alvo na planta e permitir que os sistemas de expressão transitória da planta produzam proteína recombinante, rivalizando com a das culturas de células bacterianas e de insetos de mamíferos.