Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes
23 de julho de 2013
Plantas oferecer um novo sistema para a produção de proteínas farmacêuticas, em escala comercial, que é mais escalável e de custo eficaz e segura que paradigmas expressão corrente. Neste estudo, apresentamos uma abordagem simples e conveniente, mas escalável para introduzir genes alvo contendo Agrobacterium Em plantas para a expressão transiente da proteína.
Este sistema experimental usa a infiltração agrícola para fornecer efetivamente construções gênicas às folhas para a produção de altos níveis de proteína recombinante. Primeiro, cultive as plantas de hamana em um ambiente controlado por seis semanas, três dias antes da infiltração. Preparar as culturas de agrobactérias que contêm o gene alvo a expressar nas plantas no dia da infiltração.
Introduza as culturas de agrobactérias no tecido vegetal por seringa ou infiltração a vácuo. Resultados como a intensidade da fluorescência verde de GFP em folhas de tabaco sob luz ultravioleta demonstram uma expressão robusta de proteínas recombinantes em plantas que rivaliza com a dos atuais sistemas de expressão baseados em bactérias e insetos de mamíferos. A infiltração agrícola é uma maneira eficaz de introduzir genes trans nas células vegetais, o que leva a um alto nível de expressão de proteínas recombinantes.
Pode ser usado para uma ampla gama de espécies de plantas. Mais importante ainda, pode ser ampliado para a produção comercial de proteínas farmacêuticas. Portanto, esse método pode fornecer informações sobre a cinética e a expressão da GFP e pode ser aplicado a outras proteínas, como vacinas de subunidades, anticorpos monoclonais recombinantes e pode ser usado em tratamentos para câncer e doenças infecciosas.
Um experimento bem-sucedido requer condições ideais tanto para a cultura de bactérias quanto para o material das plantas. Esse processo de infiltração é mais fácil de replicar após a demonstração visual. Comece colocando até 60 pellets de turfa em uma bandeja de propagação.
Adicione quatro litros de água da torneira e deixe os pellets de ervilha absorverem a água por duas horas. Agora, adicione duas sementes de hamana em cada pellet de turfa e cubra a bandeja com uma cúpula de plástico transparente para germinação. Coloque as sementes em um ambiente de 25 graus Celsius, 84% de umidade.
Duas semanas após a semeadura, remova a cúpula e transfira as plantas para uma nova bandeja. Em seguida, adicione dois litros de 1,48 gramas por litro. Fertilizante de Jack Continue a cultivar as plantas em um 25 graus Celsius.
ambiente 50%humidity cada dois dias. Forneça dois litros de fertilizante jack's por bandeja. Na quarta semana, transfira as plantas com pellets de turfa para uma nova bandeja que hospede seis plantas para um crescimento posterior até as seis semanas de idade.
Escolha plantas de quatro, seis semanas e hamama com cinco a seis folhas cada três folhas para infiltração completa com as cepas agrobacterianas que abrigam os genes de interesse. Uma folha para o controle negativo e uma folha para infiltração de manchas. Crie um pequeno corte com uma agulha na epiderme na parte de trás da folha, certificando-se de não perfurar a folha em ambos os lados.
Segure firmemente a parte da frente da primeira folha enquanto aplica uma leve contrapressão no pescoço. Com o polegar de uma mão. Injete as misturas de agrobactérias em tampão de infiltração no pescoço com uma seringa, uma agulha.
Continue a injetar as misturas de agrobactérias no nick até que o círculo verde mais escuro pare de se expandir. Em seguida, crie outro corte e repita as injeções até que toda a folha seja infiltrada e toda a folha fique verde mais escura. Infiltrações completas das três primeiras folhas e da última folha para a quarta folha de cada infiltrado de planta com combinações vetoriais de todos os quatro vetores virais de Gêmeos ou três vetores magcon.
Além disso, faça um corte para cada combinação de cepas de agrobacterium e infiltre cada corte com uma combinação. Após a infiltração, mova as plantas de volta para a sala de crescimento e monitore a expressão da proteína entre dois e 15 dias. Após a infiltração, coloque uma banheira em um dessecador a vácuo e transfira três litros de tampão de infiltração contendo as cepas de agrobactérias.
Em seguida, conecte o dessecador a uma bomba de vácuo de diafragma da marca de vácuo. Agora coloque uma planta de cabeça para baixo na placa dessecadora e abaixe a placa com a planta até que todo o sistema de folhas e caules esteja submerso no tampão de infiltração com a placa apoiada no topo da banheira. Em seguida, posicione o anel de vedação desidratado ao longo do aro.
Depois de colocar a tampa desidratada na câmara, ligue a bomba de vácuo e comece a cronometrar quando o vácuo atingir 100 milibar. Depois de desligar a bomba de vácuo, abra lentamente a válvula de liberação no dessecador após um minuto a 100 milibar para permitir a entrada de agrobactérias nos espaços intersticiais do tecido vegetal submerso. Repita essa infiltração.
Passos para garantir uma boa infiltração. Em seguida, remova a planta do desidratado e coloque-a de volta na posição vertical. Mova as plantas de volta para a sala de crescimento e monitore a expressão da proteína entre dois e 15 dias após a infiltração.
Para demonstrar a eficácia da seringa, infiltração de agrobacterium no tecido vegetal, testamos a expressão de duas proteínas fluorescentes, GFP e Ds red por dois vetores virais vegetais desconstruídos diferentes, Gemini, viral e magcon para final. Folhas de Hamana que foram totalmente infiltradas com agrobactérias contendo vetores virais de Gêmeos. A expressão de GFP foi observada em toda a área foliar sob luz UV, começando a partir de 2D PI e atingindo o pico de acúmulo em quatro DPI.
Em contraste, as folhas infiltradas com combinações de agrobactérias contendo vetor magcon apresentaram fluorescência de GFP somente após cinco DPI e atingiram seu acúmulo máximo em sete DPI. Nenhuma fluorescência verde foi observada nas folhas infiltradas com misturas de agrobactérias de controle negativo de EP one 10 mais P 19, indicando que a fluorescência era específica do gene GFP e não era o resultado da fluorescência de fundo das folhas. Em seu pico de acumulação, a fluorescência do vetor magcon expressa para GFP é mais intensa do que a do vetor viral Gemini.
Nenhuma necrose importante foi observada nas folhas infiltradas com construções GFP quando ambas as proteínas fluorescentes foram expressas na mesma folha por meio de vetores virais Gemini com infiltração de manchas de seringa, elas foram detectadas com sua cor fluorescente esperada no local onde foram infiltradas. Curiosamente, a co-infiltração de GFP e DS RED resultou em fluorescência amarelada. A infiltração a vácuo também foi examinada para desenvolver um método de agroinfiltração escalável que pode ser usado para produção em larga escala de proteínas recombinantes por sistemas de expressões transitórias de plantas.
Como esperado, a fluorescência GFP foi observada para todas as folhas da planta infiltrada em comparação com a infiltração da seringa. É mais robusto e pode alcançar a infiltração de cada planta com um prazo muito mais curto. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 48 horas.
Na maioria das vezes, é para cultura agrobacteriana, pois o tempo real de infiltração é de apenas alguns minutos para eficiência ideal de infiltração agrícola e expressão de proteína direcionada. Siga o protocolo. Lembre-se de controlar os parâmetros críticos, incluindo condições de crescimento das plantas, concentração de agrobactérias, pressão de vácuo e duração no campo da biotecnologia vegetal.
Esta abordagem experimental pode ser usada para explorar o desenvolvimento e a bioprodução de novas proteínas farmacêuticas em uma ampla gama de espécies de plantas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como usar a infiltração agrícola para fornecer construções de genes-alvo na planta e permitir que os sistemas de expressão transitória da planta produzam proteína recombinante, rivalizando com a das culturas de células bacterianas e de insetos de mamíferos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método escalável para produzir proteínas farmacêuticas em plantas usando Agrobacterium tumefaciens. A abordagem aproveita a infiltração agro para entregar construtos gênicos nos tecidos vegetais, permitindo altos níveis de expressão de proteínas recombinantes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biotecnologia vegetal
- Sistemas de expressão de proteínas
- Produção farmacêutica
Fundamentos
- Os sistemas atuais de expressão de proteínas têm limitações em escalabilidade e custo.
- As plantas fornecem uma alternativa segura para a produção de proteínas farmacêuticas.
- Agrobacterium tumefaciens é uma ferramenta bem estabelecida para a transferência de genes em plantas.
- Sistemas de expressão transitória podem produzir altos níveis de proteínas rapidamente.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método simples e escalável para a expressão de proteínas em plantas.
- Demonstrar a eficácia da infiltração agro para entregar construtos gênicos.
- Comparar a expressão baseada em plantas com sistemas tradicionais.
Métodos Utilizados
- Técnica de infiltração agro para entrega gênica.
- Uso de plantas end hamana cultivadas em ambiente controlado.
- Preparação de culturas de Agrobacterium contendo genes alvo.
- Avaliação da expressão de proteínas por meio de imagem de fluorescência.
Principais Resultados
- Altos níveis de proteína recombinante foram expressos com sucesso nos tecidos vegetais.
- A imagem de fluorescência mostrou expressão robusta de GFP em folhas de tabaco.
- O método demonstrou vantagens sobre sistemas mamíferos e bacterianos.
- A infiltração agro provou ser um método eficaz de introdução gênica.
Conclusões
- O estudo confirma a viabilidade de usar plantas para a produção de proteínas em larga escala.
- A infiltração agro é uma técnica promissora para expressão gênica transitória.
- Esta abordagem pode aumentar a eficiência da produção de proteínas farmacêuticas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Plant-based transient expression systems address scalability and cost limitations of mammalian cell culture for recombinant protein production. Agroinfiltration enables rapid, high-level expression of therapeutic proteins such as subunit vaccines and monoclonal antibodies. This approach supports early-stage target validation and lead identification by providing a scalable, low-cost platform for protein expression and functional screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of therapeutic targets through high-level recombinant protein expression in planta.
- Operational Value: Provides a rapid, scalable system for protein production to support hypothesis testing and pathway analysis.
- Predictive Value: Facilitates comparative assessment of protein variants, vectors, or expression kinetics for lead selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts (e.g., GFP, DsRed) for assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Supports multi-target screening on single leaves via syringe infiltration for vector or construct comparison.
- Scalability: Vacuum infiltration enables scale-up for larger leaf areas and species not amenable to syringe methods.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Produces recombinant proteins in disease-relevant plant systems for preclinical evaluation.
- Mechanistic De-risking: Allows co-expression of multiple proteins (e.g., GFP and DsRed) to study interactions or fusion constructs.
- Continuity: Bridges discovery to preclinical work by providing scalable protein supply for functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
The agroinfiltration method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical protein supply, enabling rapid iteration and comparative analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via transient expression of gene constructs to assess protein function and localization.
- Screening: Enables reproducible, quantitative protein production for screening campaigns using fluorescence-based readouts.
- Analytics: Fluorescence intensity measurements under UV light provide quantitative data for comparing expression levels across conditions.
- Translational Research: Generates sufficient protein yields for downstream preclinical testing in vaccine or therapeutic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for protein expression across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-level transient expression reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Syringe infiltration offers simplicity and flexibility; vacuum infiltration enables robustness and scalability.
- Strategic Value: Low-cost, scalable production supports better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on protein yield, expression kinetics, and functional output.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant growth, Agrobacterium handling, and infiltration techniques.
- Needs controlled growth environments, infiltration buffers, and vacuum or syringe equipment.
- Standardization across teams requires consistent plant age, bacterial concentration, and infiltration parameters.
- Adaptation across species (e.g., tobacco, lettuce, Arabidopsis) may require optimization of vacuum pressure and incubation time.
- Practical limitations include species-specific infiltration efficiency and the need for fluorescence detection equipment.
