Name: Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprenda a técnica de agroinfiltração para expressão transiente de proteínas recombinantes em plantas de tabaco. Este método escalável utiliza Agrobacterium tumefaciens para produção farmacêutica de alta eficiência.

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Agradecemos R. Sun e outros estudantes do laboratório de Chen por sua contribuição para usina de geração de material. Agradecemos também a Dr. D. Green por seu apoio de pesquisa de graduação na Faculdade de Tecnologia e Inovação (CTI). Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo NIH concede U01 AI075549 e 1R21AI101329 para Q. Chen, e uma bolsa de SSE de CTI do Arizona State University para Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, e J. Stahnke são estudantes de graduação apoiados pela concessão SSE.

1. O crescimento das plantas <ol><li> Lugar de 60 de turfa pelotas em uma bandeja de propagação. Adicionar 4 L de água da torneira e deixar a turfa pelotas de absorver a água por 2 horas. </li><li> Adicionar 2 N. benthamiana sementes em cada pastilha de turfa utilizando um semeador, cobrir a bandeja com uma cúpula de plástico transparente, e permitir que elas germinam num ° C, 84% de humidade ambiente de 25 com um ciclo de dia / noite de 16/8 horas (Figura 1A). </li><li> Remover a cúpula de duas semanas após a sementeira, drenar a água da bandeja, e adicionar 2 L de fertilizante de Jack a uma concentração de 1,48 g / L (Figura 1B). Continuar a crescer as plantas numa ° C, 50% de humidade ambiente de 25 horas com um ciclo de dia / noite de 16/8. Fornecimento 2 L de fertilizante de Jack a cada 2 dias por bandeja. </li><li> Na semana 4, transferir as plantas com turfa peletes para uma nova bandeja que hospeda seis plantas para proporcionar um espaço adequado para o crescimento (Figura 1C) até que eles estão prontos para ser infiltrado com 6 semanas de idade (Figura1D). </li></ol> 2. A. tumefaciens Cultura Preparação 2.1 Preparação para a infiltração Seringa <ol><li> Streak A. tumefaciens GV3101 estirpes contendo os vectores geminiviral p19, pREP110, pBYGFP pBYDsRed, e em placas de agar LB contendo canamicina (100 ng / ml). Causadas por uma estirpe de placa e crescer a 30 ° C durante 48 horas. </li><li> Da mesma forma, causadas e crescer estirpes GV3101 albergando os vectores MagnICON do 5 &#39;do módulo (pICH15879), a 3&#39; do módulo que contém o gene alvo de DsRed ou GFP (Pich-GFP ou Pich-DsRed) e da integrase (pCH14011) em LB agar placas contendo carbenicilina (100 ug / ml). </li><li> A partir de uma única colónia na placa de agar LB, inocular estirpes GV3101 abrigando vectores geminiviral em 3 ml de meio YENB (0,75% de extracto de levedura Bacto, 0,8% Nutrient Broth, ajustar o pH para 7,5 com NaOH) + canamicina (100 ng / ml) em um tubo ml de cultura de fundo redondo de 15, cultivar a cultura líquida, a 30 ° C emnum agitador durante a noite com uma taxa de rotação de 300 rpm. </li><li> Da mesma forma, e inocular crescer estirpes GV3101 abrigando vectores MagnICON em meios YENB + carbenicilina (100 ug / ml) num agitador durante a noite a 30 ° C. </li><li> OD valores medir e registrar 600 para cada cultura líquido com um espectrofotômetro e utilizar a fórmula abaixo para calcular o volume necessário (V sub) para ser repicadas para uma nova cultura com uma OD de partida 600 de 0.025 em 10 ml de mídia YENB com os antibióticos apropriados . Sub V (mL) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 </li><li> Transferência V sub (ml) da cultura durante a noite a (10 - sub V) ml de meio YENB com os antibióticos apropriados para cada estirpe. Crescer a nova cultura durante a noite a 30 ° C num agitador com uma velocidade de rotação de 250 rpm, até o valor de DO 600 está na gama de 1,7-2,0. </li><li> Meça e registre OD 600 valores para cada cultura líquido e usar a fórmula abaixo para calcular o volume necessário (V inf) para ser diluído em 50 ml de tampão de infiltração para se obter um OD final de 600 de 0,12 para cada estirpe. Inf V (mL) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Transferência V inf (ml) de cada cultura para um tubo de microcentrífuga e girar as células por centrifugação a 12.000 xg durante 2 minutos, em seguida, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de tampão de infiltração (MES 10 mM, pH 5,5; MgSO 10 mM 4) em vortex brevemente. </li><li> Misturar as células ressuspensas de pBYGFP pREP110 + + p19, rodar para baixo as células a 12.000 xg durante 2 minutos, e ressuspender em total de 50 ml de tampão de infiltração. Esta combinação de Agrobacterium é geminiviral para expressão da GFP. </li><li> Do mesmo modo, misturar as seguintes combinações de células de Agrobacterium, girar e ressuspender-los em 50 ml de tampão de infiltração. Eles incluem: (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 para a expressão geminiviral de DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 geminiviral por co-expressão da GFP e DsRed, (3) pREp110 + p19 como controlo negativo de expressão geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 MagnICON para a expressão de GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 pCH14011 para a expressão MagnICON de DsRed, e (6) pICH15879 + pCH14011 como controle negativo para a expressão MagnICON. </li></ol> 2.2 Preparação para a infiltração a vácuo <ol><li> Após a inoculação, a cultura de cada estirpe GV3101 contendo vectores ou vectores geminiviral MagnICON em 15 ml de meio YENB com antibióticos apropriados em um frasco de 50 ml e autoclavado a crescer durante a noite como descrito acima para a seringa de infiltração. </li><li> OD valores medir e registrar 600 para cada cultura líquido com um espectrofotômetro e utilizar a fórmula abaixo para calcular o volume necessário (V sub) para ser repicadas para uma nova cultura com uma OD de partida 600 de 0.025 em 250 ml de mídia YENB com os antibióticos apropriados . V sub </sub&gt; (Ml) = (250 ml) x (0,025) / OD 600 </li><li> Transferência V sub (ml) da cultura durante a noite a (250 - V sub) mL de meio YENB num balão de 1 L autoclavado com os antibióticos apropriados para cada estirpe e crescer uma nova cultura durante a noite como descrito acima, para a infiltração de seringa. </li><li> Medir e registar valores de OD 600 de cada líquido de cultura e utilizar a seguinte fórmula para calcular o volume necessário (V inf) para ser diluído em 3 L de tampão de infiltração para se obter um OD final de 600 de 0,12 para cada estirpe. Inf V (mL) = (3000 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Ressuspender o sedimento e V inf (ml) de cada cultura em tampão de infiltração, tal como descrito para a infiltração de seringa e misturar as culturas ressuspensas de acordo com as combinações descritas para a infiltração de uma seringa. Repellet Agrobacteria as células mistas e ressuspender-los em 3 L de tampão de infiltração. </li></ol> 3.1 Seringa Infiltração <ol><li> Escolha quatro de 6 semanas de idade N. benthamiana plantas com folhas de 5 cada. As três primeiras folhas de contagem a partir do topo de cada planta vai ser infiltrada inteiramente com uma das combinações de A. tumefaciens estirpes em tampão de infiltração. A quarta folha será spot-infiltrada com todas as quatro combinações de tensão para a expressão geminiviral ou três combinações de expressão MagnICON. A última folha de cada planta será infiltrada com combinações de controles negativos. </li><li> Criar uma pequena incisão com uma agulha na epiderme, no lado de trás da folha (Figura 2A). Atenção: certifique-se de modo a não arranhar duro como para perfurar a folha através de ambos os lados, tal como as células de Agrobacterium na mistura infiltração irá passar através do furo para o outro lado da folha. </li><li> Tome um firme do lado da frente da folha e ao aplicar suavecontrapressão para o entalhe com o polegar de uma mão, injecta-se as misturas de Agrobacterium, em tampão de infiltração no entalhe com uma seringa sem agulha (Figura 2B). Nota: A mistura de Agrobacterium entra no espaço intercelular da folha, a área infiltrada ficará visivelmente mais escura verde (Figura 2C). </li><li> Continuar a injectar as misturas Agrobacterium no nick até que o círculo verde mais escuro pára de se expandir. Criar outro nick e repita os passos 3.1.2-3.1.4 até que toda a folha é infiltrada e toda a folha fica verde mais escuro para as três primeiras folhas ea última folha. </li><li> Para a quarta folha de cada planta, todas as combinações de quatro geminiviral (vector) ou três (MagnICON vector) serão infiltrados nela. Faça um nick para cada combinação de cepas de Agrobacterium, e se infiltrar cada nick com uma combinação. </li><li> Após a infiltração, mova plantas de volta para a sala de crescimento e moniexpressão da proteína tor entre 2-15 dias após a infiltração (dpi). </li></ol> 3.2 Vacuum Infiltração <ol><li> Depositar uma banheira num exsicador de vácuo e de transferência 3 tampão de infiltração L contendo as estirpes de Agrobacterium para a banheira. Ligue o exsicador de vácuo a uma bomba de diafragma Vacuubrand (Figura 3A). </li><li> Coloque uma planta de cabeça para baixo sobre a placa exsicador (Figura 3B) e baixar a placa com a planta, até que todo o sistema de folha e caule é submerso no tampão de infiltração com a placa que descansam sobre a cuba. Coloque o secador O anel ao longo da borda e coloque a tampa do secador na câmara (Figura 3C). </li><li> Ligar a bomba de vácuo e iniciar a contagem, quando o vácuo atinge 100 mbar. Lentamente abrir a válvula de libertação no exsicador após 1 min a 100 mbar para permitir a entrada de Agrobacterium para dentro dos espaços intersticiais do tecido da planta submersa. Repita este passo um additional tempo para garantir uma boa infiltração. </li><li> Após infiltração, levar a planta para fora do secador e colocá-lo de volta à sua posição vertical. Mover as plantas de volta para a sala de crescimento e expressão da proteína do monitor entre 2-15 dpi. </li></ol> 4. Proteína fluorescente de detecção e Fotografia <ol><li> A partir de 2 dpi, as plantas se movem em quarto escuro e brilhar a luz UV na parte de trás das folhas infiltradas com uma lâmpada UV de mão. </li><li> Observar a fluorescência verde de GFP ou a fluorescência vermelha de DsRed. GFP emite um sinal mais forte com o tempo de luz UV de ondas, enquanto DsRed é mais forte sob luz ultravioleta de onda curta. </li><li> Tire fotos de folhas fluorescentes com uma câmera digital comum, sem flash. </li><li> Mover as plantas de volta para a sala de crescimento após a observação ou fotografia. </li></ol>

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</ol>

Os autores não competindo interesses financeiros.

A crescente demanda por produtos farmacêuticos à base de proteínas em todo o mundo exigem novas plataformas de produção que são robustas, escaláveis ​​e de baixo custo e segura. As plantas têm demonstrado ser um dos sistemas de produção alternativos mais promissores para a produção de proteínas farmacêuticas. Em anos recentes, o desenvolvimento de vectores baseados em Desconstruído vírus permitiu a expressão transitória de proteínas em plantas, o que aumenta grandemente a velocidade e o rendimento dos sistemas de expres...

Desde os anos 1970, as plantas foram explorados como alternativas a culturas de células de mamíferos, insectos, bactérias e para a produção comercial de proteínas recombinantes e uma proteína terapêutica. Sistemas à base de plantas para a expressão de biofármacos têm se mostrado promissor nos últimos anos, vários novos tratamentos para doenças, como a doença de Gaucher 2 e 3 da gripe aviária H5N1, têm demonstrado sucesso em ensaios clínicos. O desenvolvimento de mecanismos competentes para a expressão de proteínas recombinantes em plantas nas décadas desde os primeiros experimentos criou o potencial para sistemas à base de plantas para alterar o paradigma atual de produção de proteína por três razões principais. Em primeiro lugar, há uma diminuição notável do custo como bioreactores de mamíferos, insectos, bactérias e exigem custos consideráveis ​​de arranque, meios de cultura caros e processos complicados para a purificação a jusante 4. A criação de planta transgênica estávellinhas também lhes permite superar a escalabilidade de outros sistemas de expressão como plantas que expressam proteínas poderiam ser cultivadas e colhidas em escala agrícola 5. Em segundo lugar, os sistemas de expressão à base de plantas reduzem significativamente o risco de transmissão de um agente patogénico humano ou animal, a partir do hospedeiro que expressa a proteína para os seres humanos, demonstrando a superioridade em segurança pública 6. Por fim, as plantas utilizam um sistema endomembranar eucariota que é semelhante à de células de mamífero, permitindo a correcta modificação pós-tradução, incluindo a glicosilação de proteínas e o conjunto de proteínas de várias subunidades 7. Esta capacidade coloca sistemas baseados em plantas antes de aqueles baseados em sistemas procariotas, tais como bactérias, uma vez que um número maior de proteínas recombinantes farmacêuticos, incluindo os anticorpos monoclonais (mAbs), tem uma estrutura complicada e requer extensas modificações pós-tradução ou de montagem 8. Existem dois grandes adedores de expressar proteínas recombinantes em plantas. O primeiro é o desenvolvimento de uma linha transgénica de forma estável, onde o ADN que codifica para a proteína alvo é clonado em uma cassete de expressão e introduzido tanto o genoma nuclear ou do cloroplasto. Ao fazer isso, o DNA estranho se torna hereditário através de gerações sucessivas e permite tremendamente melhorado escalabilidade, além de outros sistemas de expressão 1. A introdução de ADN exógeno no genoma nuclear é geralmente conseguido por infecção por Agrobacterium tumefaciens de tecido de planta ou, menos frequentemente, por bombardeamento de microprojécteis de tecido 9. Hormonas de plantas são depois utilizados para induzir a diferenciação e o crescimento de tecido de planta transgénica como raízes e folhas. A transformação do genoma do cloroplasto não pode ser conseguido com A. tumefaciens, mas depende inteiramente de partículas de ouro ou tungstênio revestidas com DNA demitido balisticamente em células vegetais. O segundo método de expressar recombinaçãont proteína em plantas é através da expressão transitória 10. Neste cenário, os vetores de vírus derivados abrigando o gene de interesse são entregues via A. tumefaciens para plantas totalmente desenvolvidas através de um processo chamado agroinfiltration. Em vez de integração no genoma da planta, a construção de gene entregue começará então a dirigir a produção transiente da proteína desejada, que pode ser colhida e isolado após um curto período de incubação. A expressão do gene transitório oferece a vantagem de uma maior acumulação de proteína total, bem como um tempo melhorado de produção de proteínas, como as plantas estarão prontas para a colheita, aproximadamente 1-2 semanas após agroinfiltration 11. Isto é significativamente mais rápido do que os processos de produção, selecção e confirmação de linhas de plantas transgénicas estáveis, o que pode levar vários meses a um ano. Isto, no entanto, é também a limitação do sistema de expressão transitória, uma vez que não irá produzir geneticamente estável planta line que podem ser usados ​​para gerar um banco de sementes para a produção comercial em grande escala. Apesar disso, as abordagens têm sido desenvolvidos para melhorar a expressão transiente em larga escala. Aqui demonstramos um método de geração de proteínas expressam plantas de Nicotiana benthamiana transitórios utilizam vetores virais desconstruídas entregues pela A. tumefaciens. Existem dois métodos principais estão a ser desenvolvidos para a entrega de A. tumefaciens em tecido vegetal: banco de infiltração escala via seringa e infiltração em larga escala via câmara de vácuo. Ambos os protocolos são descritos aqui, usando N. benthamiana, que está intimamente relacionada com a planta do tabaco comum, como a planta hospedeira para expressão transitória de duas proteínas fluorescentes: a proteína verde fluorescente (GFP) de água-viva Aequorea victoria ea proteína fluorescente vermelha de Discosoma coral (DsRed) 12,13. N. benthamiana é a planta hospedeira mais comum paraproteína recombinante porque é susceptível à transformação genética, podem produzir quantidades elevadas de biomassa rapidamente, e é um produtor de sementes para a produção prolífica aumento de escala 14. Outra vantagem do uso de N. benthamiana como hospedeiros para a expressão da proteína é a disponibilidade de uma variedade de vectores de expressão de 2,5. Neste estudo, dois vetores virais desconstruídas, uma baseada em um vírus do mosaico do tabaco (TMV) RNA sistema replicon (vetores MagnICON) eo outro derivado do vírus anã amarela feijão (BeYDV) sistema replicon DNA (vetores geminiviral) 4,11, 15-18, são usados ​​para transportar o gene GFP e DsRed e entregá-los em N. células benthamiana via A. tumefaciens. três construções de DNA serão utilizados para GFP ou com vectores de expressão DsRed MagnICON. Eles incluem &quot;módulo (pICH15879) contendo o promotor e outros elementos genéticos para a condução da expressão do gene alvo, a 3 &#39;do módulo 5 que contém o gene de interesse (Pich-GFP ou Pich-DsRed), e o módulo de integrase (pICH14011) que codifica para uma enzima que integra a 5 &#39;e 3&#39; módulos juntos após expressão 8,15. Três construções de DNA também são necessários para a expressão com vetores geminiviral. Em adição a vectores que contêm o replicão do gene-alvo (ou pBYGFP pBYDsRed), um vector que codifica para a proteína de replicação (pREP110) é necessária para a amplificação do alvo replicão 11,14,16. Além disso, a inclusão de um vector que codifica para o silenciamento p19 supressor de tomate espesso vírus duplos é desejado para a expressão do gene alvo de elevado nível de 11,16. Em geral, há três passos principais para a introdução de genes de proteínas recombinantes em células de plantas por agroinfiltration incluindo o crescimento das plantas, A. tumefaciens cultura de preparação, e a infiltração. Como cada passo é crítico para o sucesso final deste procedimento, por conseguinte, uma descrição detalhada de cada uma é fornecidatanto para a infiltração seringa e infiltração por vácuo abaixo.

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>Reagents</td></tr><tr><td>GFP </td><td>Invitrogen</td><td>V353-20</td><td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> Consulte a referência: Lico e Chen, et al 2008</td></tr><tr><td>DsRed</td><td>Clontech</td><td>632152</td><td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> Ver referência: Baird e Zacharias, et al 2000</td></tr><tr><td>MagnICON Vector</td><td>Icon Genetics</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> Ver referência: giritch e Marillonnet, et al 2006</td></tr><tr><td>Geminiviral</td><td>Vector Author' s Lab</td><td>n/a</td><td>Ver referência: Chen e He, et al 2011</td></tr><tr><td>N. benthamiana</td><td>Autor' s Lab</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens cepa gv3101</td><td>Autor' s Lab</td><td>n/a</td><td>Ver referência: Lai e Chen 2012</td></tr><tr><td>LB Agar Carbenicillin-100, placas</td><td>Sigma</td><td>L0418</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>LB Agar Kanamycin-50, placas</td><td>Sigma</td><td>L0543</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio hidrato de hepa</td><td>Sigma</td><td>M2773-500 g</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Bacto-Triptona</td><td>Fisher</td><td>73049-73-7</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Extrato de levedura Bacto Becton</td><td>, Dickinson CO.</td><td>REF 212750</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>Difco Caldo de Nutrientes</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 234000</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>MES hidrato Buffer</td><td>Sigma</td><td>M8250-1kg</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>Sigma</td><td>C1613-1ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"> www.sigmaaldrich.com< / a ></td></tr> <tr><td>canamicina</td><td>Sigma</td><td>70560-51-9</td> <td><a href = "http://www.sigmaaldrich.com/" target = "_blank ">www.sigmaaldrich.com< / a></td></tr> <tr><td>hidróxido de sódio</td><td>Sigma</td><td>221465</td> <td>< a href = "http://www.sigmaaldrich.com/" target = "_blank ">www.sigmaaldrich.com< / a></td></tr> <tr><td>Jack ' s Fertilizante</td><td>Hummert International</td><td>Jul-25</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Vacuubrand MD4 Bomba de Vácuo</td><td>Fisher</td><td>13-878-113</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Vacuum Air Válvula Reguladora</td><td>Fisher</td><td>NC9386590</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Dessecador 12 1/8" com anel O</td><td>Fisher</td><td>08-594-15C</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>3 L Banheira</td><td>Rubber-Maid</td><td>n/a</td><td>Rubbermaid Servn' Saver Bowl, 10-cup vai funcionar</td></tr><tr><td>prato/prateleira 230ML</td><td>Fisher</td><td>NC9489269</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Peat Pellet</td><td>Hummert International</td><td>14-2370-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>Bandeja de Propagação Dome</td><td>hydrofarm</td><td>132052</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Propagaiton Tray</td><td>hydrofarm</td><td>138758</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Virbo Semeadora Manual</td><td>Gro-Mor INC</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank" >www.gro-morent.com</a></td></tr><tr><td>Flora Cart 4 prateleiras</td><td>Hummert International</td><td>65-6924-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>15 ml Tubos de Cultura de Fundo Redondo</td><td>Sigma</td><td>CLS430172-500EA</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Cuvetes</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9950</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga</td><td>EUA Científico</td><td>1415-2500</td><td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0602EDU</td><<td>a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Incubadora/Agitador</td><td>Eppendorf</td><td>Excella E25</td><td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank"> www.eppendorf.com</a></td></tr>Luz <tr><td>Ultravioleta Modelo#: UVGL-25</td><td>UVP</td><td>95-0021-12</td><td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td></tr></tbody></table>

agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Cultura de células de mamífero é a plataforma principal para a produção comercial de vacinas humanas e proteínas terapêuticas. No entanto, ele não pode atender à crescente demanda mundial por produtos farmacêuticos, devido à sua escalabilidade limitada e de alto custo. As plantas têm demonstrado ser uma das plataformas de produção farmacêuticos alternativos mais promissores que são robustas, adaptar, de baixo custo e segura. O recente desenvolvimento de vectores baseados em vírus, permitiu a expressão transiente rápida e de alto nível de proteínas recombinantes em plantas. Para optimizar ainda mais a utilidade do sistema de expressão transitória, que demonstram uma metodologia simples, eficiente e de adaptar a introdução do gene alvo contendo de Agrobacterium para o tecido vegetal neste estudo. Os nossos resultados indicam que tanto a seringa agroinfiltration com vácuo e métodos têm como resultado a introdução eficiente de Agrobacterium em folhas e robusta de produção de duas proteínas fluorescentes; GFP e DsRed. Além disso,que demonstram as vantagens únicas oferecidas pelos dois métodos. Infiltração seringa é simples e não precisa de equipamentos caros. Ele também permite a flexibilidade, quer se infiltrar toda a licença com um gene alvo, ou a introdução de genes de múltiplos alvos em uma folha. Assim, ele pode ser usado para a expressão à escala laboratorial de proteínas recombinantes, bem como para a comparação de diferentes proteínas ou vectores para a cinética de produção ou expressão. A simplicidade de infiltração seringa também sugere a sua utilidade no ensino médio e educação superior para o tema da biotecnologia. Em contraste, a infiltração por vácuo é mais robusto e pode ser dimensionada e para produção comercial de proteínas farmacêuticas. Também apresenta a vantagem de ser capaz de agroinfiltrate espécies de plantas que não são passíveis de seringa infiltração tais como a alface e Arabidopsis. Em geral, a combinação de uma seringa e agroinfiltration vácuo fornece investigadores e formadores de uma simples, eficiente e robustametodologia para a expressão da proteína transiente. Vai facilitar muito o desenvolvimento de proteínas farmacêuticas e promover a educação científica.

1. Expressão de proteínas fluorescentes por infiltração Seringa Para demonstrar a eficácia da seringa infiltração de Agrobacterium para o tecido vegetal, testou-se a expressão das duas proteínas fluorescentes - GFP e DsRed - por dois vectores virais diferentes de plantas Desconstruído - geminiviral e MagnICON - em N. benthamiana. Para N. benthamiana folhas que foram completamente infiltrados com Agrobacteria geminiviral vectores contendo, a expressão da GFP f...

Plantas oferecer um novo sistema para a produção de proteínas farmacêuticas, em escala comercial, que é mais escalável e de custo eficaz e segura que paradigmas expressão corrente. Neste estudo, apresentamos uma abordagem simples e conveniente, mas escalável para introduzir genes alvo contendo<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Em plantas para a expressão transiente da proteína.

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Este sistema experimental utiliza agroinfiltração para entregar efetivamente construtos gênicos às folhas, visando a produção de altos níveis de proteína recombinante. Primeiro, cultive plantas de end hamana em um ambiente controlado por seis semanas, três dias antes da infiltração. Prepare as culturas de agrobactérias que contêm o gene alvo a ser expresso nas plantas no dia da infiltração.Introduza as culturas de agrobactérias no tecido vegetal por meio de infiltração com seringa ou por vácuo. Resultados como a intensidade da fluorescência verde da GFP em folhas de tabaco sob luz ultravioleta demonstram uma expressão robusta de proteínas recombinantes em plantas, comparável à dos atuais sistemas de expressão baseados em mamíferos, bactérias e insetos. A infiltração com *Agrobacterium* é uma forma eficaz de introduzir genes transgênicos nas células vegetais, o que leva à expressão de alto nível de proteínas recombinantes.Pode ser utilizado para uma ampla gama de espécies vegetais. Mais importante ainda, pode ser ampliado para a produção comercial de proteínas farmacêuticas. Assim, este método pode fornecer informações sobre a cinética e expressão de GFP e pode ser aplicado a outras proteínas, como vacinas de subunidades, anticorpos monoclonais recombinantes, e pode ser usado em tratamentos para câncer e doenças infecciosas.Um experimento bem-sucedido exige condições ideais tanto para o cultivo bacteriano quanto para o material vegetal. Esse processo de infiltração é mais fácil de replicar após uma demonstração visual. Comece colocando até 60 pellets de turfa em uma bandeja de propagação.Adicione quatro litros de água da torneira e deixe as pastilhas de ervilha absorverem a água por duas horas. Agora, adicione duas sementes hamana em cada pastilha de turfa e cubra a bandeja com uma cúpula plástica transparente para a germinação. Coloque as sementes em um ambiente com temperatura de 25 graus Celsius e umidade de 84%.Duas semanas após a semeadura, remova a cúpula e transfira as plantas para uma nova bandeja. Em seguida, adicione dois litros de fertilizante Jack's a 1,48 gramas por litro. Continue a cultivar as plantas a 25 graus Celsius.ambiente com 50% de umidade a cada dois dias. Forneça dois litros de fertilizante Jack's por bandeja. Na quarta semana, transfira as plantas com pellets de turfa para uma nova bandeja que acomoda seis plantas para crescimento adicional até a idade de seis semanas.Escolha quatro plantas Hamama com seis semanas de idade e cinco a seis folhas cada, sendo três folhas para infiltração completa com as cepas bacterianas agro que carregam os genes de interesse, uma folha para o controle negativo e uma folha para infiltração por pontos. Faça um pequeno corte com uma agulha na epiderme do lado posterior da folha, tomando cuidado para não perfurar a folha por ambos os lados.Segure firmemente o lado frontal da primeira folha enquanto aplica uma pressão contrária suave ao pescoço. Com o polegar de uma das mãos, injete as misturas de agrobactérias no tampão de infiltração no pescoço com uma seringa e uma agulha.Continue injetando as misturas de agrobactérias no corte até que o círculo verde-escuro pare de se expandir. Em seguida, crie outro corte e repita as injeções até que toda a folha seja infiltrada e toda a sua extensão fique com coloração verde-escura. Realize a infiltração completa das três primeiras folhas e da última folha, que corresponde à quarta folha de cada planta, utilizando combinações de vetores, seja os quatro vetores virais Gemini ou três vetores magcon.Além disso, faça uma incisão para cada combinação de cepas de agrobactérias e infiltre cada incisão com uma combinação. Após a infiltração, retorne as plantas à câmara de crescimento e monitore a expressão proteica entre dois e 15 dias. Após a infiltração, coloque um recipiente em um dessecador a vácuo e transfira três litros de tampão de infiltração contendo as cepas de agrobactérias.Em seguida, conecte o dessecador a uma bomba de vácuo de diafragma. Agora, posicione uma planta de cabeça para baixo sobre a placa do dessecador e abaixe a placa com a planta até que todo o sistema de folhas e caules esteja submerso no tampão de infiltração, com a placa apoiada sobre o recipiente. Em seguida, posicione a junta de vedação do dessecador ao longo da borda.Após colocar a tampa do dessecador na câmara, ligue a bomba de vácuo e comece a cronometrar quando o vácuo atingir 100 milibares. Após desligar a bomba de vácuo, abra lentamente a válvula de liberação no dessecador após um minuto em 100 milibares para permitir a entrada de bactérias agro nos espaços intersticiais do tecido vegetal submerso. Repita esta infiltração.Passos para garantir uma boa infiltração. Em seguida, remova a planta do dessecador e coloque-a novamente na posição ereta. Retorne as plantas à câmara de crescimento e monitore a expressão proteica entre dois e 15 dias após a infiltração.Para demonstrar a eficácia da infiltração por seringa de *Agrobacterium* em tecido vegetal, testamos a expressão de duas proteínas fluorescentes, GFP e DsRed, por meio de dois vetores virais vegetais desconstruídos diferentes: Gemini viral e magcon para fim. Folhas de Hamana que foram completamente infiltradas com *Agrobacterium* contendo vetores virais Gemini exibiram expressão de GFP em toda a área foliar sob luz UV, começando já em 2 DPI, atingindo a acumulação máxima em 4 DPI.Em contraste, folhas infiltradas com o vetor magcon contendo combinações de agrobactérias mostraram fluorescência GFP apenas após cinco DPI e atingiram sua acumulação máxima aos sete DPI. Nenhuma fluorescência verde foi observada em folhas infiltradas com misturas de agrobactérias de controle negativo EP um 10 mais P 19, indicando que a fluorescência era específica para o gene GFP e não resultava de fluorescência de fundo das folhas. Na sua acumulação máxima, a fluorescência do vetor magcon expressando GFP é mais intensa do que a do vetor viral Gemini.Nenhuma necrose acentuada foi observada em folhas infiltradas com construtos GFP quando ambas as proteínas fluorescentes foram expressas na mesma folha por meio de vetores virais Gemini com infiltração por pontos usando seringa; elas foram detectadas com a cor fluorescente esperada no local onde foram infiltradas. Curiosamente, a co-infiltração de GFP e DS RED resultou em fluorescência amarelada. A infiltração a vácuo também foi avaliada com o objetivo de desenvolver um método escalonável de agroinfiltração que possa ser utilizado para a produção em larga escala de proteínas recombinantes por meio de sistemas de expressão transitória em plantas.Como esperado, a fluorescência de GFP foi observada em todas as folhas da planta infiltrada em comparação com a infiltração por seringa. O método é mais robusto e pode alcançar a infiltração de cada planta em um período muito mais curto. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 48 horas.Na maioria das vezes, é para cultura com bactérias agrobacterianas, já que o tempo real de infiltração dura apenas alguns minutos. Para obter eficiência ideal na infiltração agrobacteriana e expressão proteica direcionada, siga o protocolo. Lembre-se de controlar os parâmetros críticos, incluindo condições de crescimento das plantas, concentração de bactérias agrobacterianas, pressão de vácuo e duração. No campo da biotecnologia vegetal.Essa abordagem experimental pode ser usada para explorar o desenvolvimento e a bioprodução de proteínas farmacêuticas inovadoras em uma ampla gama de espécies vegetais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar a infiltração com Agrobacterium para entregar construtos gênicos-alvo nas plantas e permitir que sistemas de expressão transitória vegetais produzam proteínas recombinantes, competindo com culturas de células bacterianas, de insetos e de mamíferos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Agroinfiltração e agroinfecção PVX são ensaios funcionais de rotina para expressão ectópica transitória de genes nas plantas. Esses métodos são ensaios eficientes em estratégias de efeitoomia (resistência rápida e descoberta genética de avirulência) e cruciais para pesquisas modernas em patologia molecular vegetal. Eles atendem à demanda por uma análise funcional robusta de alto rendimento nas plantas.

Agroinfiltração e Agroinfecção PVX em Batata e Nicotiana benthamiana

Produção de proteína transiente em plantas de Nicotiana baseado na infiltração de vácuo com Agrobacterium levando vetores de lançamento (Tobacco mosaic vírus-base) é uma abordagem rápida e econômica para a produção de antígenos vacinais e proteínas terapêuticas. Nós simplificamos o processo e melhorado acumulação alvo, otimizando as condições de cultivo de bactérias, a seleção de espécies hospedeiras, e co-introdução de RNA silenciar supressores.

Otimização e Utilização de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada produção de proteína transiente em<em&gt; Nicotiana</em

As plantas de tabaco foram utilizadas para produzir uma celulase fúngica, TrCel5A, através de um sistema de expressão transiente. A expressão pode ser controlada por meio de uma proteína de fusão fluorescente, e a actividade da proteína foi caracterizada pós-expressão.

Expressão da proteína recombinante a partir da celulase Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Em Plantas de tabaco

Neste estudo, a expressão de uma proteína recombinante humana alvo em diferentes plataformas de produção foi comparada. Focamos em culturas tradicionais baseadas em fermentadores e em plantas, descrevendo a configuração de cada sistema e destacando, com base nos resultados relatados, os limites e vantagens inerentes a cada plataforma.

Uma análise comparativa de Expressão de proteínas recombinantes em Diferentes biofábricas: bactérias, células de insectos e Sistemas de Plantas

Planta de conexões intercelulares, os dictiossomos (Pd), desempenham um papel central na planta de interações planta-vírus e fisiologia. Crítica para o transporte de Pd está classificando os sinais que dirigem proteínas à polícia. No entanto, nosso conhecimento sobre estas sequências é ainda em sua infância. Nós descrevemos uma estratégia para identificar sinais de localização de Pd em proteínas Pd-alvo.

Identificação de sequências de localização Plasmodesmal em proteínas em Planta

sistemas de expressão em células de insecto Nonlytic são pouco utilizados para a produção, o tráfico celular / localização, e a análise funcional da proteína recombinante. Aqui, nós descrevemos métodos para gerar vectores de express e subsequente expressão da proteína transiente em linhas de células de lepidópteros disponíveis comercialmente. A co-localizao de aquaporinas de Bemisia tabaci com proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares também é apresentada.

Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Expressão heteróloga transitória de enzimas biossintéticas em folhas de Nicotiana benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno. Aqui é descrito um protocolo detalhado para produção em escala preparativa rápida (5 dias) de triterpenos e analogs utilizando esta poderosa plataforma baseada em vegetais.

Expressão transiente em Nicotiana Benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa

Descrito aqui é um método de rotulagem de proximidade para identificação de parceiros de interação do domínio TIR do receptor imunológico NLR no tecido da folha Nicotiana benthamiana. Também é fornecido um protocolo detalhado para a identificação de interações entre outras proteínas de interesse utilizando essa técnica em Nicotiana e outras espécies vegetais.

Rotulagem de proximidade baseada em turboid para identificação na planta de redes de interação proteína-proteína

Descrevemos aqui um método simples de expressão, extração e purificação de IgG humano recombinante fundido ao GFP em Nicotiana benthamiana. Este protocolo pode ser estendido à purificação e visualização de inúmeras proteínas que utilizam cromatografia de coluna. Além disso, o protocolo é adaptável ao laboratório de ensino presencial e virtual universitário, proporcionando exploração baseada em projetos.

Produção de Proteínas IgG Fusion Transitóriamente Expressa em Nicotiana benthamiana

Aqui, apresentamos um protocolo passo-a-passo para a realização do experimento de marcação por proximidade (PL) em pepino (Cucumis sativus L.) usando AT4G18020 (APRR2)-proteína AirID como modelo. O método descreve a construção de um vetor, a transformação de um construto através de agroinfiltração, infiltração de biotina, extração de proteínas e purificação de proteínas marcadas com biotina através da técnica de purificação por afinidade.

Marcação de proximidade baseada em AirID para interação proteína-proteína em plantas

Aqui, apresentamos o primeiro protocolo de infiltração localizada a vácuo para estudos in vivo da transformação genética de plantas de grande porte. Utilizando esta metodologia, obteve-se pela primeira vez a transformação transitória do cacau mediada por Agrobacterium em planta.

Agroinfiltração Forçada a Vácuo para Transformação In planta de Plantas Recalcitrantes: Cacau como Estudo de Caso

Aprenda a técnica de agroinfiltração para expressão transiente de proteínas recombinantes em plantas de tabaco. Este método escalável utiliza Agrobacterium tumefaciens para produção farmacêutica de alta eficiência.

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

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