Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Este sistema experimental utiliza agroinfiltração para entregar efetivamente construtos gênicos às folhas, visando a produção de altos níveis de proteína recombinante. Primeiro, cultive plantas de end hamana em um ambiente controlado por seis semanas, três dias antes da infiltração. Prepare as culturas de agrobactérias que contêm o gene alvo a ser expresso nas plantas no dia da infiltração.

Introduza as culturas de agrobactérias no tecido vegetal por meio de infiltração com seringa ou por vácuo. Resultados como a intensidade da fluorescência verde da GFP em folhas de tabaco sob luz ultravioleta demonstram uma expressão robusta de proteínas recombinantes em plantas, comparável à dos atuais sistemas de expressão baseados em mamíferos, bactérias e insetos. A infiltração com *Agrobacterium* é uma forma eficaz de introduzir genes transgênicos nas células vegetais, o que leva à expressão de alto nível de proteínas recombinantes.

Pode ser utilizado para uma ampla gama de espécies vegetais. Mais importante ainda, pode ser ampliado para a produção comercial de proteínas farmacêuticas. Assim, este método pode fornecer informações sobre a cinética e expressão de GFP e pode ser aplicado a outras proteínas, como vacinas de subunidades, anticorpos monoclonais recombinantes, e pode ser usado em tratamentos para câncer e doenças infecciosas.

Um experimento bem-sucedido exige condições ideais tanto para o cultivo bacteriano quanto para o material vegetal. Esse processo de infiltração é mais fácil de replicar após uma demonstração visual. Comece colocando até 60 pellets de turfa em uma bandeja de propagação.

Adicione quatro litros de água da torneira e deixe as pastilhas de ervilha absorverem a água por duas horas. Agora, adicione duas sementes hamana em cada pastilha de turfa e cubra a bandeja com uma cúpula plástica transparente para a germinação. Coloque as sementes em um ambiente com temperatura de 25 graus Celsius e umidade de 84%.

Duas semanas após a semeadura, remova a cúpula e transfira as plantas para uma nova bandeja. Em seguida, adicione dois litros de fertilizante Jack's a 1,48 gramas por litro. Continue a cultivar as plantas a 25 graus Celsius.

ambiente com 50% de umidade a cada dois dias. Forneça dois litros de fertilizante Jack's por bandeja. Na quarta semana, transfira as plantas com pellets de turfa para uma nova bandeja que acomoda seis plantas para crescimento adicional até a idade de seis semanas.

Escolha quatro plantas Hamama com seis semanas de idade e cinco a seis folhas cada, sendo três folhas para infiltração completa com as cepas bacterianas agro que carregam os genes de interesse, uma folha para o controle negativo e uma folha para infiltração por pontos. Faça um pequeno corte com uma agulha na epiderme do lado posterior da folha, tomando cuidado para não perfurar a folha por ambos os lados.

Segure firmemente o lado frontal da primeira folha enquanto aplica uma pressão contrária suave ao pescoço. Com o polegar de uma das mãos, injete as misturas de agrobactérias no tampão de infiltração no pescoço com uma seringa e uma agulha.

Continue injetando as misturas de agrobactérias no corte até que o círculo verde-escuro pare de se expandir. Em seguida, crie outro corte e repita as injeções até que toda a folha seja infiltrada e toda a sua extensão fique com coloração verde-escura. Realize a infiltração completa das três primeiras folhas e da última folha, que corresponde à quarta folha de cada planta, utilizando combinações de vetores, seja os quatro vetores virais Gemini ou três vetores magcon.

Além disso, faça uma incisão para cada combinação de cepas de agrobactérias e infiltre cada incisão com uma combinação. Após a infiltração, retorne as plantas à câmara de crescimento e monitore a expressão proteica entre dois e 15 dias. Após a infiltração, coloque um recipiente em um dessecador a vácuo e transfira três litros de tampão de infiltração contendo as cepas de agrobactérias.

Em seguida, conecte o dessecador a uma bomba de vácuo de diafragma. Agora, posicione uma planta de cabeça para baixo sobre a placa do dessecador e abaixe a placa com a planta até que todo o sistema de folhas e caules esteja submerso no tampão de infiltração, com a placa apoiada sobre o recipiente. Em seguida, posicione a junta de vedação do dessecador ao longo da borda.

Após colocar a tampa do dessecador na câmara, ligue a bomba de vácuo e comece a cronometrar quando o vácuo atingir 100 milibares. Após desligar a bomba de vácuo, abra lentamente a válvula de liberação no dessecador após um minuto em 100 milibares para permitir a entrada de bactérias agro nos espaços intersticiais do tecido vegetal submerso. Repita esta infiltração.

Passos para garantir uma boa infiltração. Em seguida, remova a planta do dessecador e coloque-a novamente na posição ereta. Retorne as plantas à câmara de crescimento e monitore a expressão proteica entre dois e 15 dias após a infiltração.

Para demonstrar a eficácia da infiltração por seringa de *Agrobacterium* em tecido vegetal, testamos a expressão de duas proteínas fluorescentes, GFP e DsRed, por meio de dois vetores virais vegetais desconstruídos diferentes: Gemini viral e magcon para fim. Folhas de Hamana que foram completamente infiltradas com *Agrobacterium* contendo vetores virais Gemini exibiram expressão de GFP em toda a área foliar sob luz UV, começando já em 2 DPI, atingindo a acumulação máxima em 4 DPI.

Em contraste, folhas infiltradas com o vetor magcon contendo combinações de agrobactérias mostraram fluorescência GFP apenas após cinco DPI e atingiram sua acumulação máxima aos sete DPI. Nenhuma fluorescência verde foi observada em folhas infiltradas com misturas de agrobactérias de controle negativo EP um 10 mais P 19, indicando que a fluorescência era específica para o gene GFP e não resultava de fluorescência de fundo das folhas. Na sua acumulação máxima, a fluorescência do vetor magcon expressando GFP é mais intensa do que a do vetor viral Gemini.

Nenhuma necrose acentuada foi observada em folhas infiltradas com construtos GFP quando ambas as proteínas fluorescentes foram expressas na mesma folha por meio de vetores virais Gemini com infiltração por pontos usando seringa; elas foram detectadas com a cor fluorescente esperada no local onde foram infiltradas. Curiosamente, a co-infiltração de GFP e DS RED resultou em fluorescência amarelada. A infiltração a vácuo também foi avaliada com o objetivo de desenvolver um método escalonável de agroinfiltração que possa ser utilizado para a produção em larga escala de proteínas recombinantes por meio de sistemas de expressão transitória em plantas.

Como esperado, a fluorescência de GFP foi observada em todas as folhas da planta infiltrada em comparação com a infiltração por seringa. O método é mais robusto e pode alcançar a infiltração de cada planta em um período muito mais curto. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 48 horas.

Na maioria das vezes, é para cultura com bactérias agrobacterianas, já que o tempo real de infiltração dura apenas alguns minutos. Para obter eficiência ideal na infiltração agrobacteriana e expressão proteica direcionada, siga o protocolo. Lembre-se de controlar os parâmetros críticos, incluindo condições de crescimento das plantas, concentração de bactérias agrobacterianas, pressão de vácuo e duração. No campo da biotecnologia vegetal.

Essa abordagem experimental pode ser usada para explorar o desenvolvimento e a bioprodução de proteínas farmacêuticas inovadoras em uma ampla gama de espécies vegetais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar a infiltração com Agrobacterium para entregar construtos gênicos-alvo nas plantas e permitir que sistemas de expressão transitória vegetais produzam proteínas recombinantes, competindo com culturas de células bacterianas, de insetos e de mamíferos.