Name: Método para obtenção de células do cancro do ovário primárias de amostras sólidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprenda a isolar e caracterizar células primárias de câncer de ovário a partir de amostras clínicas sólidas. Este método permite cultivar células epiteliais livres de fibroblastos por semanas, facilitando aplicações downstream em oncologia e medicina personalizada.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer ao pessoal da Facilidade de recolha de tecidos, da Universidade de Minnesota para obter ajuda com a coleta de amostras de tecido do paciente. Este trabalho foi apoiado pelo Programa do Departamento de Defesa do ovário Cancer Research (OCRP) OC093424 a MB, pelo Randy Shaver Cancer Research Fund e da Comunidade para MB, pelo Minnesota cancro do ovário Aliança para MB e pelo fundo de Oncologia Ginecológica Departamental de MB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Declaração de Ética Amostras sólidas de câncer de ovário foram obtidos a partir da Facilidade Universidade de Minnesota colheita de tecidos (TPF) após o Comitê de Revisão Institucional Board: Conselho Assunto Humano (IRB) de aprovação. 1. Setup Reagente <ol><li> Prepare meio DMEM completo, completando DMEM com FBS a 10%, e 100 unidades de penicilina-estreptomicina. Armazenar o meio a 4 ° C e aquecer a 37 ° C antes de usar. </li><li> Alíquota dispase II em volumes separados de 5-10 ml para evitar congelamento múltipla descongela e armazenar a -20 ° C em um freezer sem nonfrost. </li></ol> 2. Recolha de Tecidos <ol><li> Recolher amostras sólidas de cancro do ovário (~ 5 g de tamanho), no momento da cirurgia a partir de zonas macroscopicamente identificados como cancro por um patologista. Espécimes clínicos são de-identificados e registados de acordo com protocolos institucionais. </li><li> Coloque as amostras em um estéril, sctampa rew, polipropileno espécimes recipiente cheio com 30 ml de PBS gelado. Transportar as amostras de laboratório de patologia cirúrgica para o laboratório de pesquisa para o processamento no gelo, e dentro de 30 minutos a partir de coleta de amostras (Figura 1). </li></ol> 3. Processamento de Tecidos <ol><li> Trabalhando sob condições estéreis, a transferência das amostras para uma placa de Petri (60 mm x 60 mm) contendo 10 ml de fresco, PBS gelado e utilizando uma lâmina de barbear esterilizada, ainda cortado em peças mais pequenas possíveis (2 mm ou menos) ( As figuras 2A e 2 B). </li><li> Transferir os tecidos picados num tubo cónico de 15 ml contendo 10 ml de pré-aquecido (37 ° C durante 30 min), dispase II (2,4 U / ml) em DMEM e incubar em 5% de CO 2 e 37 ° C durante 30 min. Para assegurar uma digestão óptima dos espécimes, agitar manualmente a suspensão celular a cada 5 min. </li><li> Após 30 min de incubação, a transferência (usando10 ml de uma pipeta serológica) a suspensão de células em um filtro celular (malha de 70 um) colocados na parte superior de um tubo de 50 ml e aplica uma pressão suave contra a malha utilizando um êmbolo de seringa. Descartar qualquer tecido não dissociado (restante no topo da malha) e recolher a suspensão celular obtida no tubo de 50 ml estéril. Centrifugar a 320 xg durante 7 minutos a 4 ° C (Figura 3). </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de DMEM contendo 10% de FBS. </li><li> Incubar a suspensão de células em placas de Petri de 5% de CO 2 e 37 ° C (Figura 4). </li><li> Mude o meio após 24 horas do início do cultivo. Isto permite a remoção de detritos celulares e a maioria dos eritrócitos presentes na cultura. </li><li> Troca da mídia a cada três dias para as duas semanas seguintes, após o que as culturas de EOC primário estão prontos para aplicações a jusante. </li></ol>

<ol><li>Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+and+treatment+of+ovarian+cancer%3A+shifting+from+early+stage+to+minimal+volume+of+disease+based+on+a+new+model+of+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).</li>
<li>Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+Cancer+Is+an+Imported+Disease%3A+Fact+or+Fiction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Obstet.+Gynecol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction.</a> Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Sarojini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+biomarkers+for+ovarian%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Early detection biomarkers for ovarian.</a> J. Oncol. , (2012).</li>
<li>Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nachtigal+M.W.+Primary+culture+of+ovarian+surface+epithelial+cells+and+ascites-derived+ovarian+cancer+cells+from+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).</li>
<li>Tsao, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells+immortalized+by+human+papilloma+viral+oncogenes+%28HPV-E6E7+ORFs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs).</a> Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).</li>
<li>Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cultured+human+ovarian+surface+epithelial+cells%3A+phenotypic+plasticity+and+premalignant+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes.</a> Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).</li>
<li>Brewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+normal%2C+immortalized+ovarian+surface+epithelial+and+ovarian+cancer+cells+for+chemoprevention+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).</li>
<li>Sueblinvong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization+and+downstream+application+of+primary+ovarian+cancer+cells+derived+from+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>Rockwell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-in+vitro+tumour+cell+lines%3A+characteristics+and+limitations+as+models+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer+Suppl%22%5BJournal%5D)">In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer.</a> Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).</li>
<li>Wong, C., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development%2C+application+and+limitations+of+breast+cancer+cell+lines+to+study+tamoxifen+and+aromatase+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid.+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance.</a> J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Uma melhor compreensão da etiologia do câncer de ovário e de desenvolvimento é crucial para melhorar o resultado de mulheres afetadas por esta doença devastadora. Neste contexto, a utilização de estabelecida e &quot;comercialmente disponível&quot; linha de células de cancro do ovário, sem dúvida, tem sido extremamente útil. No entanto, hoje sabemos que linhas celulares de cancro não são representativos do tumor humano que originou, em muitos aspectos, incluindo a falta de heterogeneidade 9,10. <p class="j...

Apesar da sua relativa baixa incidência, o câncer de ovário é o mais mortal das doenças ginecológicas ea quinta causa de morte por câncer entre as mulheres 1,2. Isto é principalmente devido à falta de ferramentas confiáveis ​​e modelos que recapitulam fielmente a iniciação ea progressão da doença 3. A maioria do nosso conhecimento hoje sobre o câncer de ovário foi possível através do uso de células imortalizadas ovarianos epiteliais da superfície (IOSEs), linhas de células de câncer de ovário e células de câncer de ovário primários recuperados de líquido ascítico 4-7. Infelizmente, a sua utilização tem várias limitações, incluindo uma série de mudanças genéticas e fenotípicas associadas com o processo de imortalização ou em passagens in vitro e a heterogeneidade da população resultante da preparação de fluido ascítico. Portanto, as células de câncer de ovário primários derivados de amostras sólidas identificáveis ​​e específicos do câncer de ovário representam uma unique ferramenta para estudar a progressão do câncer de ovário. As principais dificuldades na obtenção dessas células malignas são devido a um crescimento excessivo de células do estroma ou fibroblastos, juntamente com perda de viabilidade e prematuro falta de capacidade proliferativa na cultura destas células EOC. Vários métodos para criar suspensões de célula única de tumores sólidos existem actualmente, através de meios mecânicos ou de dissociação enzimática, contudo certas técnicas de produzir uma quantidade maior do resultado preferido 8. Aqui, vamos mostrar que a digestão enzimática com dispase II resulta em uma recuperação eficaz de células EOC sem fibroblastos viáveis. As culturas EOC assim obtidos são altamente susceptíveis a manipulação genética e são também úteis em ensaios de rastreio de drogas, o que indica que estas culturas EOC são adequadas para muitas aplicações a jusante.

<table><tbody><tr><td>1x PBS, estéril&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de rosca, recipiente de amostra de polipropileno, estéril</td><td>Thermo Scientific</td><td>02 1090</td><td></td></tr><tr><td>DMEM médio, estéril&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, estéril</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicilina-estreptomicina, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, estéril</td><td>Roche</td><td>04942 078 001</td><td></td></tr><tr><td>Pinça pequena de ponta fina e lâmina de bisturi, estéril</td><td>Pinça Fisher Scientific</td><td>: 08-953E, lâminas: 08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação pequena, estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-945</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos com tampa cônica de 15 ml,</td> BD <td>Falcon</td><td>estéril 352097 Tubos</td><td></td></tr><tr><td>cônicos com tampa de 50 ml, estéril</td><td>BD Falcon</td><td>352027</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta sorológica, estéril&nbsp;</td><td>Corning</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Êmbolo de seringa, estéril&nbsp;</td>Filtro <td>de nylon 8881516911</td><td></td>da <td>Tyco Healthcare</td></tr><tr><td>(70 &mu; m ) filtro de células, estéril</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 5 cm, estéril&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 10 cm, estéril&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr></tbody></table>

método para obtenção de células do cancro do ovário primárias de amostras sólidas

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Ferramentas confiáveis ​​para investigar a iniciação do câncer de ovário e progressão são urgentemente necessários. Embora a utilização de linhas celulares de cancro do ovário permanece uma ferramenta valiosa para a compreensão do cancro do ovário, o seu uso tem muitas limitações. Estas incluem a falta de heterogeneidade e a pletora de alterações genéticas associadas com passagens em extensas in vitro. Aqui nós descrevemos um método que permite a criação rápida de células de câncer de ovário primários formar espécimes clínicos sólidos coletados no momento da cirurgia. O método consiste em submeter as amostras clínicas para a digestão enzimática durante 30 minutos. A suspensão de células isoladas é deixada crescer e podem ser usadas para aplicação a jusante, incluindo o rastreio de drogas. A vantagem de linhas celulares de cancro do ovário primários mais linhas de células de câncer de ovário estabelecidos é que eles são representativos dos espécimes clínicos específicos originais são derivadas e podem ser derivadas a partir de diferentes locais quer primacâncer de ovário ry ou metastático.

Espécimes clínicos frescas de cancro do ovário são recolhidas após a cirurgia (Figura 1) e cortado em pequenos pedaços (Figuras 2A e 2B), que constituem a suspensão de células. Isto permite uma exposição óptima dos espécimes para o tratamento enzimático. Suspensão de células é exposto a digestão enzimática e foram incubadas a 37 ° C durante 30 min. Durante o tempo de incubação da suspensão torna-se cada vez mais turva (especialmente depois de cada agitação) e este é um ...

Este estudo descreve um método detalhado para o isolamento e caracterização de células de cancro do ovário a partir de espécimes clínicos primários sólidos. Espécimes clínicos de câncer de ovário são submetidos a digestão enzimática para obter, câncer viável sem fibroblastos epitelial de ovário células (EdC) altamente adequados para aplicações a jusante.

Método para obtenção de células do cancro do ovário primárias de amostras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e caracterizar células primárias de câncer de ovário a partir de espécimes clínicos sólidos. Isso é realizado primeiramente coletando o espécime do tumor ovariano e colocando-o em uma placa de Petri. O segundo passo é cortar a amostra em pedaços e transferir os fragmentos para um tubo cônico com reagentes de digestão para incubação.Em seguida, a suspensão celular é passada por um filtro no qual apenas as células são coletadas. Para a centrifugação, o passo final consiste em descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura para incubação durante a noite. Em última análise, as células de câncer epitelial de ovário crescerão em cultura por semanas, o que permite aplicações posteriores. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do câncer de ovário, como qual é a melhor opção de tratamento para cada paciente individualmente.As implicações dessa técnica estendem-se ao tratamento do câncer de ovário, pois permitem o uso de culturas celulares mais realistas, que são altamente suscetíveis à manipulação genética e mais úteis para testes de triagem de fármacos. Para começar, complemente 500 mililitros d

method-for-obtaining-primary-ovarian-cancer-cells-from-solid-specimens

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Heterotípica tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelagem de Estroma-epitelial de ovário Interações durante o início e progressão do câncer

Este protocolo descreve uma técnica para preparação de amostras por co-cultura de explantes ovarianos com células cancerígenas da trompa de Falópio. Essas amostras são visualizadas usando espectroscopia de massa de imagem, ou IMS, para detectar a troca de pequenas moléculas entre as células e os tecidos, levando ao desenvolvimento do tumor.

Modelagem da comunicação do câncer de ovário para análise de espectrometria de massa por imagem: um método para identificar comunicadores químicos de pequenas moléculas no desenvolvimento de tumores ovarianos metastáticos

Neste vídeo, descrevemos um método para isolar e caracterizar células primárias de câncer de ovário de amostras sólidas de tecido tumoral ovariano. As células epiteliais do câncer obtidas usando este protocolo são adequadas para entender os processos que podem levar à iniciação e desenvolvimento do câncer de ovário.

Obtenção de células primárias de câncer de ovário a partir de amostras sólidas: um método para cultivar células epiteliais de câncer de ovário a partir de amostras de tumor ovariano

Invasão de células do cancro do ovário no revestimento mesotelial do peritoneu é um processo dinâmico ao longo do tempo. Utilizando um analisador de tempo real, a capacidade invasiva das células de câncer de ovário em uma célula modelo de co-cultura esferóide-mesoteliais podem ser quantificados durante períodos de tempo prolongados, fornecendo insights sobre os fatores que regulam o processo metastático.

Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real

As células iniciadoras de tumor (TICs) podem representar um alvo terapêutico viável para o tratamento do câncer de ovário, uma doença altamente recorrente e fatal. Apresentamos um protocolo para condições de cultura que enriquecem para esta população de células altamente tumorigênicas.

Em Enriquecimento vitro de câncer de ovário de iniciação Células Tumorais

Aqui, apresentamos um protocolo para construir um modelo tridimensional in vitro do revestimento da cavidade peritoneal, composto por células mesoteliais humanas primárias e fibroblastos estratificados com matriz extracelular, como uma ferramenta para investigar a adesão, invasão e proliferação de células de câncer de ovário.

Modelando os passos iniciais do cancro do ovário Divulgação em uma cultura organotípicas do Peritoneal Cavity Humano

Para esclarecer o processo de várias etapas de difusão peritoneal de carcinoma dos ovários, o presente estudo apresenta um modelo experimental murino de desenvolvimento do tumor original e metástases através de inoculação peritoneal ortotópico com essas células tumorais.

Murino Experimental Modelo de desenvolvimento do tumor original e Peritoneal Metástase<em&gt; via</em&gt; Ortotópico injetar células do ovário Carcinoma

Os organoides derivados do paciente (DOP) são uma cultura tridimensional (3D) que pode imitar o ambiente tumoral in vitro. No câncer de ovário seroso de alto grau, as DOPs representam um modelo para estudar novos biomarcadores e terapias.

Geração e Cultivo de Organoides Derivados de Pacientes com Câncer de Ovário Seroso de Alto Grau

Apresentamos um protocolo que pode ser usado para realizar testes terapêuticos com organoides de câncer de ovário derivados de pacientes.

Modelos organoides derivados de pacientes com câncer de ovário para testes pré-clínicos de drogas

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo tridimensional (3D) ex vivo de interação célula-omento canceroso. O modelo fornece uma plataforma para elucidar mecanismos pró-tumorais dentro do nicho adiposo e para testar novas terapias.

Modelo Ex Vivo de Metástase Peritoneal de Câncer de Ovário Utilizando Omento Humano

Este protocolo oferece uma estrutura sistemática para o estabelecimento de organoides de câncer de ovário de diferentes estágios da doença e aborda os desafios da variabilidade específica da paciente para aumentar o rendimento e permitir uma expansão robusta a longo prazo para aplicações subsequentes. Inclui etapas detalhadas para processamento de tecidos, semeadura, ajuste dos requisitos de meios e coloração por imunofluorescência.

Estratégia para Biobanco de Organoides para Câncer de Ovário: Abordando a Heterogeneidade Interpaciente entre Subtipos Histológicos e Estágios da Doença

Aprenda a isolar e caracterizar células primárias de câncer de ovário a partir de amostras clínicas sólidas. Este método permite cultivar células epiteliais livres de fibroblastos por semanas, facilitando aplicações downstream em oncologia e medicina personalizada.

Método para obtenção de células do cancro do ovário primárias de amostras sólidas

Explorar mais vídeos