Desenvolvimento e Reprodução do Camundongo de Laboratório

Development and Reproduction of the Laboratory Mouse

JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Development and Reproduction of the Laboratory Mouse

4.4: Basic Mouse Care and Maintenance

4.15: Zebrafish Microinjection Techniques

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09:04 min

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April 30, 2023

Overview

A reprodução bem sucedida do camundongo de laboratório (Mus musculus) é fundamental para o estabelecimento e manutenção de uma colônia animal produtiva. Além disso, os embriões de camundongos são frequentemente estudados para responder perguntas sobre processos de desenvolvimento. Uma grande variedade de ferramentas genéticas agora existem para regular a expressão genética durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal do rato, o que pode ajudar os cientistas a entender mais sobre doenças hereditárias que afetam o desenvolvimento humano.

Este vídeo fornece uma introdução à reprodução e desenvolvimento de ratos. Além de esclarecer a terminologia utilizada para descrever a progressão do desenvolvimento, a apresentação revisa as etapas-chave do ciclo de vida do mouse. Em primeiro lugar, são descritos grandes eventos de desenvolvimento que ocorrem no útero, com especial atenção dada ao layout único dos embriões de roedores primitivos. Em seguida, protocolos de criação são fornecidos para ratos pós-natais, ou filhotes, incluindo o processo de desmasmaamento, ou remoção de filhotes da gaiola de sua mãe. Como machos e fêmeas devem ser separados nesta fase para evitar o acasalamento não programado, a demonstração também revela como determinar o sexo com o rato. Posteriormente, são dadas instruções para a realização de reprodução controlada de camundongos, incluindo a triagem para o plugue copulatório, que é útil para o desenvolvimento embrionário precisamente cronometrado. Finalmente, o vídeo destaca estratégias utilizadas para investigar os processos complexos que regem o desenvolvimento de camundongos, incluindo a geração de camundongos “nocaute” geneticamente alterados.

Procedure

Camundongos são organismos modelos extremamente valiosos que continuam a melhorar nossa compreensão do desenvolvimento humano e da doença. Entre os mamíferos, os camundongos têm uma alta fecundidade e rápido desenvolvimento, o que significa que as colônias podem ser rapidamente expandidas.

Uma vez que o desenvolvimento dentro do útero requer algumas estruturas embrionárias especializadas, o estudo da embriogênese em um modelo mamífero também é mais relevante para os seres humanos. Neste vídeo, discutiremos as etapas de reprodução e desenvolvimento de camundongos, como criar camundongos e formas de aplicar o conhecimento reprodutivo e de desenvolvimento do camundongo em laboratório.

Primeiro vamos falar um pouco sobre reprodução do rato. Como os humanos, o desenvolvimento precoce de camundongos é interno, com a gestação ocorrendo dentro dos chifres uterinos da mãe, que é chamada de “represa”. No entanto, ao contrário da maioria de nós, os camundongos carregam muitos fetos ao mesmo tempo, produzindo um tamanho médio de ninhada de 10 a 12 filhotes em um período de gestação.

Antes de discutir o desenvolvimento desses filhotes com mais detalhes, vamos rever os termos utilizados para identificar os estágios de desenvolvimento. O sistema de encenação mais comum começa no dia zero embrionário, ou E0, no dia da cópula bem sucedida. Depois disso, cada etapa é definida pelo número de dias desde a fertilização até o dia do nascimento, quando a numeração recomeça no pós-natal do dia zero, ou P0.

Uma vez que o tempo de desenvolvimento pode variar ligeiramente mesmo entre embriões do mesmo lixo, abordagens alternativas baseadas na morfologia em vez de tempo pós-fertilização, como o estadiamento de Theiler, também podem ser usadas.

Em seguida, vamos dar uma olhada mais de perto nas mudanças morfológicas que ocorrem durante essas primeiras semanas de desenvolvimento do rato.

Após a fertilização do oócito, o embrião começa sua vida lentamente, completando apenas 4 rodadas de divisão celular em seus primeiros 3 dias. No entanto, pelo E4, essas células se multiplicaram e se reorganizaram para formar uma bola compactada e oca de células conhecidas como “blastocisto”. Nesta fase, as células que eventualmente darão origem ao embrião em si são todas encontradas dentro de um aglomerado de células-tronco conhecidas como massa celular interna, ou ICM. As outras células, conhecidas como células trophoblastos, se tornarão parte da placenta que fornece oxigênio e nutrição ao embrião.

Depois deste ponto, o desenvolvimento de roedores fica um pouco torcido. Na maioria dos mamíferos, as células que dão origem ao embrião formam uma estrutura semelhante a um disco. Em contraste, o embrião do mouse tem uma configuração em forma de xícara. As células do lado de fora deste copo formam uma camada celular conhecida como endoderme, que eventualmente dá origem a tecidos profundos, como o revestimento do trato digestivo. Confusamente, as células na superfície interna do copo representam o ectoderme, que forma tecidos mais superficiais, como cabelo e pele.

Este layout invertido persiste até cerca do dia 8 embrionário, quando o embrião literalmente se vira. A essa altura, algumas outras estruturas reconhecíveis se desenvolveram, incluindo os somites, que dão origem a tecidos como o músculo esquelético; e os botões dos membros, que formarão os membros da primeira e traseira.

As coisas se movem muito rapidamente daqui, com o desenvolvimento de grandes sistemas de órgãos, como os pulmões e o trato digestivo, bem em andamento até o dia 12. Notavelmente, os embriões estão prontos para sobreviver fora da mãe após apenas 19-21 dias de gestação.

Agora que você tem uma sensação de como o desenvolvimento prossegue no útero, vamos falar sobre o que acontece depois que os ratos dão à luz. Os camundongos recém-nascidos, ou filhotes, são minúsculos, sem pelos e cegos.

Durante as primeiras semanas de vida, os filhotes podem receber nutrição de qualquer fêmea lactante disponível. Então, cerca de três semanas após o nascimento, eles estão prontos para desmamar, o que significa que é hora de sair da casa da mamãe para uma gaiola própria!

Para controlar a criação futura, você precisará separar os machos e fêmeas neste momento. Para identificar os sexos, examine a distância entre o ânus e a genitália externa. No feminino, essa distância será menor do que no masculino.

Para preparar a nova casa dos filhotes, forrar uma gaiola com uma camada de roupa de cama. Uma vez que eles ainda estão se acostumando com as novas escavações, adicione algumas pelotas de comida amolecidas com água ou um prato de comida molhada no fundo da gaiola, além de fornecer água.

Os camundongos se tornam sexualmente maduros dentro de algumas semanas de desmame, com seu pico de reprodução geralmente caindo entre 2 e 9 meses de idade.

Então, como usamos essas informações para iniciar uma colônia de reprodução? Primeiro, é importante lembrar que o comportamento de um rato é significativamente impactado pelo seu ritmo circadiano; já que são noturnos, seus ratos procriarão à noite.

Feromônios também desempenham um grande papel no comportamento do rato, por isso é útil “introduzir” potenciais companheiros para que eles se conheçam melhor. Para maximizar o número de filhotes nascidos durante um ciclo de reprodução, combine um rato macho com até 4 fêmeas.

Para o desenvolvimento do embrião, retorne pela manhã para verificar cada camundongo fêmea em busca de um plugue de muco vaginal, que é depositado pelo macho durante a copulação. Ratos ovulam a cada 4- 5 dias; então, se você não ver um plugue imediatamente, mantenha os ratos juntos para outra chance no final dessa semana. Uma vez que você determinou que algumas das fêmeas estão grávidas, remova o rato macho da gaiola, pois eles podem ser uma ameaça para os filhotes recém-nascidos.

Para estudar os processos complexos que controlam o desenvolvimento de embriões de mamíferos, os cientistas desenvolveram algumas técnicas muito legais. Vamos dar uma olhada em alguns exemplos.

Para começar, o mapeamento do destino é uma abordagem em que as células são marcadas e rastreadas in vivo para determinar como elas contribuem para estruturas específicas no desenvolvimento e tecido adulto.

Aqui, a expressão de uma proteína fluorescente é ligada em uma pequena população de células para rastrear a contribuição das células que expressam a proteína para o tecido cerebral fetal e adulto.

A fim de testar o papel de um gene específico no desenvolvimento, é útil examinar o resultado de sua superexpressão. Em uma técnica chamada eletroporação utera, o DNA é entregue ao embrião por microinjeção e, em seguida, conduzido para as células, aplicando corrente elétrica através do tecido. O resultado é a indução da expressão genética em células específicas, como demonstrado pela expressão de proteína fluorescente vermelha no sistema nervoso central deste embrião.

Mudanças mais permanentes na expressão genética vêm na forma de camundongos eliminatórios, em que uma porção de um gene é removida. Para gerar esses camundongos, as células-tronco são isoladas dos embriões primitivos e submetidas à modificação do genoma. As células modificadas são transplantadas em um blastocisto, que é então implantado em uma fêmea para a gestação. O filhote resultante será uma “quimera” composta de células normais e knockdown, e pode ser criado para gerar ratos homozigos nocaute.

Você acabou de assistir a visão geral da JoVE sobre reprodução e desenvolvimento de ratos. Neste vídeo, cobrimos a reprodução do camundongo, o desenvolvimento pré-natal e pós-natal, e como criar camundongos. Também discutimos algumas aplicações interessantes para estudar o desenvolvimento de ratos no laboratório. Obrigado por assistir!

Transcript

Mice are extremely valuable model organisms that continue to improve our understanding of human development and disease. Among mammals, mice have a high fecundity and rapid development, meaning that colonies can be quickly expanded.

Since development within the womb requires some specialized embryonic structures, the study of embryogenesis in a mammalian model is also more relevant to humans. In this video, we will discuss the stages of mouse reproduction and development, how to breed mice, and ways to apply mouse reproductive and developmental knowledge in the lab.

First let’s talk a little bit about mouse reproduction. Like humans, early mouse development is internal, with gestation occurring within the uterine horns of the mother, who’s called a “dam.” However, unlike most of us, mice carry many fetuses at once, producing an average litter size of 10 – 12 pups in one gestation period.

Before discussing the development of these pups in more detail, let’s review the terms used to identify the developmental stages. The most common staging system begins at embryonic day zero, or E0, on the day of successful copulation. After that, each stage is defined by the number of days since fertilization right up through the day of birth when the numbering restarts at postnatal day zero, or P0.

Since developmental timing can vary slightly even between embryos of the same litter, alternative approaches based on morphology rather than time post fertilization, like Theiler staging, can also be used.

Next, let’s take a closer look at the morphological changes that occur during those first few weeks of mouse development.

After fertilization of the oocyte, the embryo starts its life slowly, completing only 4 rounds of cell division in its first 3 days. However, by E4 these cells have multiplied and reorganized to form a compacted, hollow ball of cells known as the “blastocyst.” At this stage, the cells that will eventually give rise to the embryo itself are all found within a cluster of stem cells known as the inner cell mass, or ICM. The remaining cells, known as the trophoblast cells, will become part of the placenta that provides oxygen and nutrition to the embryo.

After this point, rodent development gets a little twisted. In most mammals, the cells that give rise to the embryo form a disc-like structure. In contrast, the mouse embryo has a cup-shaped configuration. Cells on the outside of this cup form a cell layer known as the endoderm, which eventually gives rise to deep tissues such as the lining of the digestive tract. Confusingly, the cells on the internal surface of the cup represent the ectoderm, which forms more superficial tissues, like hair and skin.

This inverted layout persists until about embryonic day 8, when the embryo quite literally turns itself around. By this point, a few other recognizable structures have developed, including the somites, which give rise to tissues like the skeletal muscle; and the limb buds, which will form the fore and hind limbs.

Things move pretty quickly from here, with the development of major organ systems, such as the lungs and digestive tract, well under way by embryonic day 12. Remarkably, the embryos are ready to survive outside the mother after only 19 -21 days of gestation.

Now that you have a feel for how development proceeds in utero, let’s talk about what happens after mice give birth. The newborn mice, or pups, are tiny, hairless, and blind.

For the first few weeks of life, the pups can receive nourishment from any available lactating female. Then, about three weeks after birth, they are ready for weaning, meaning it’s time to move out of Mom’s place into a cage of their own!

In order to control future breeding, you’ll need to separate the males and females at this point. To identify the sexes, examine the distance between the anus and external genitalia. In females, this distance will be shorter than in males.

To prepare the pups’ new home, line a cage with a layer of bedding. Since they’re still getting used to the new digs, add some food pellets softened with water or a dish of wet food to the bottom of the cage in addition to providing water.

Mice become sexually mature within a few weeks of weaning, with their peak breeding usually falling between 2 and 9 months of age.

So how do we use this information to start a breeding colony? First, it’s important to remember that a mouse’s behavior is significantly impacted by its circadian rhythm; since they’re nocturnal, your mice will breed at night.

Pheromones also play a big part in mouse behavior, so it’s helpful to “introduce” potential mates to let them get to know each other. To maximize the number of pups born during a breeding cycle, combine one male mouse with up to 4 females.

To precisely time embryo development, return in the morning to check each female mouse for a vaginal mucus plug, which is deposited by the male during copulation. Mice ovulate every 4 – 5 days; so if you don’t see a plug right away, keep the mice together for another chance later that week. Once you’ve determined that some of the females are pregnant, remove the male mouse from the cage, as they can be a threat to the newborn pups.

In order to study the complex processes controlling the development of mammalian embryos, scientists have developed some very cool techniques. Let’s take a look at some examples.

To start, fate mapping is an approach in which cells are marked and tracked in vivo to determine how they contribute to specific structures in developing and adult tissue.

Here, the expression of a fluorescent protein is turned on in a small population of cells to track the contribution of cells expressing the protein to fetal and adult brain tissue.

In order to test the role of a specific gene in development, it is helpful to examine the outcome of its overexpression. In a technique called in utero electroporation, DNA is delivered to the embryo by microinjection and then driven into cells by applying electric current across the tissue. The result is the induction of gene expression in specific cells, as demonstrated by the red fluorescent protein expression in the central nervous system of this embryo.

More permanent changes to gene expression come in the form of knockout mice, in which a portion of a gene is removed. To generate these mice, stem cells are isolated from early embryos and subjected to genome modification. The modified cells are transplanted into a blastocyst, which is then implanted into a female for gestation. The resulting pup will be a “chimera” composed of both normal and knockdown cells, and can be bred to generate homozygous knockout mice.

You’ve just watched JoVE’s overview of mouse reproduction and development. In this video we covered mouse reproduction, prenatal and postnatal development, and how to breed mice. We also discussed some exciting applications for studying mouse development in the lab. Thanks for watching!

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