Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

O objetivo geral deste procedimento é acompanhar a distribuição da juncional endógena, terina e pcam durante a migração transendotelial de leucócitos em condições fisiológicas de fluxo. Isso é feito isolando primeiro os leucócitos polimorfonucleares ou PMNs do sangue total de voluntários saudáveis usando um gradiente proco. O segundo passo é adicionar anticorpos marcados com fluorescência a uma monocamada de células endoteliais da veia umbilical humana estimulada por TNF alfa cultivada em lâminas de fluxo 30 minutos antes de iniciar o experimento de fluxo.

Isso permitirá a visualização da dinâmica juncional das células endoteliais durante a transmigração de neutrófilos sob condições fisiológicas de fluxo. Em seguida, a lâmina de fluxo contendo as células endoteliais da veia umbilical humana estimuladas com TNF alfa marcadas com fluorescência é conectada ao sistema de fluxo e colocada no estágio do microscópio. A bomba puxará o buffer de fluxo do reservatório através da câmara de fluxo para a seringa.

A etapa final é injetar os PMNs lentamente no sistema de fluxo através da porta de injeção. Em última análise, os PMNs são visualizados usando um microscópio confocal de varredura a laser. Após alguns minutos, os leucócitos aparecem, aderem e transmigram.

O experimento pode ser interrompido a qualquer momento desejado. A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos existentes, como ensaios de transmigração estática, é que com esta técnica você pode estudar a adesão e a transmigração na vida real sob condições fisiológicas de fluxo. Isso nos ajudará a entender por que os leucócitos escolhem uma raiz em detrimento da outra, então PGA versus migração transcelular.

Fazemos isso visualizando as junções celulares com anticorpos marcados com fluorescência. As células endoteliais da veia umbilical humana ou HU X para este experimento são cultivadas de acordo com as instruções do fabricante em placas revestidas com fibronectina usando meio suplementado com crescimento endotelial. Média. A cultura de células é usada entre quatro a oito passagens quando as células atingem 80 a 90% Confluência lave-as cuidadosamente com PBS em temperatura ambiente em pH 7,4 e, em seguida, a tripsina é as células após a tripsina e centrifugação.

Suspendemos a 800.000 células por mililitro usando meios. O experimento usa câmaras de fluxo que foram revestidas com fibronectina na placa do dia anterior. 80.000 células em cada canal das câmaras de fluxo codificadas pela fibronectina e pipetam suavemente a suspensão celular para cima e para baixo durante a noite em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no dia seguinte.

Atualize a mídia na corrediça da câmara de fluxo inclinando suavemente a corrediça em um ângulo de 45 graus. Recomenda-se remover apenas o meio nos reservatórios e não no próprio canal. A remoção do meio nos canais pode resultar em perda de células endoteliais e morte devido à força de arrasto do meio causada pela pipetagem.

Verifique por microscopia de contraste de fase se as células endoteliais formaram uma monocamada. Se as células não estiverem 100% cofluentes, troque o meio duas vezes ao dia até atingir 100% de confluência. Uma vez que as células tenham atingido 100% de fluência, estimule as células com meios contendo o mediador inflamatório.

O TNF alfa estimulando uix durante a noite com TNF alfa resulta em um fenótipo inflamatório do endotélio IE regulação positiva de moléculas de adesão celular, como ICAM one e VA M1. Antes de isolar leucócitos polimorfonucleares ou PMNs. Preparar um tampão de fluxo para lavar PMNs isolados e para uso no ensaio de fluxo para 100 mililitros de uma solução-mãe previamente preparada. A 100 microlitros de cloreto de cálcio molar fresco, 2,5 mililitros de albumina humana de uma concentração de estoque de 200 gramas por litro e 0,1 gramas de glicose.

Filtre o buffer de fluxo usando um filtro de 0,45 mícron. Uma solução de citrato trissódico a 10% ou TNC em PBS a pH 7,4 também é preparada antes do isolamento de PMNs. Os PMNs serão isolados de 20 mililitros de sangue total coletados em uma heparina sódica de um voluntário saudável.

Primeiro dilua o sangue total um a um com 10% de PBST NNC em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, use um pipeta boy na configuração mais lenta para pipetar cuidadosamente 20 mililitros de sangue diluído cuidadosamente em 12,5 mililitros de solução coloidal per co em água com densidade de 1,130 gramas por mililitro em um novo tubo de 50 mililitros. O tubo contendo por colo deve ser inclinado em um ângulo de 45 graus durante a adição do sangue.

Colocar cuidadosamente os tubos na centrífuga e centrifugar à temperatura ambiente durante 20 minutos a 800 Gs com baixa aceleração e com os travões desligados quando a centrifugação estiver completa. Remova todo o líquido e encha cada tubo com tampão de lise de eritrócitos gelado para lixar os eritrócitos. Deixe os tubos no gelo, invertendo-os ocasionalmente até que a suspensão fique vermelha escura centrífuga a 500 GS por cinco minutos a quatro graus Celsius com os freios ativados.

A fração de pellets resultante contém os PMNs Juntamente com os eritrócitos, remova o sobrenadante e lave o pellet duas vezes em gelo. Tampão de lise fria a 500 Gs por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a remoção do sobrenadante da segunda lavagem, suspender novamente o pellet com tampão de fluxo à temperatura ambiente e determinar a concentração de PMNs usando um contador de células automatizado.

Por fim, suspenda os PMNs no tampão de fluxo de uma vez 10 a seis células por mililitro e mantenha-os em temperatura ambiente para marcar a caderina VA juncional endotelial e o pcam um. Adicionar o anticorpo pcam LOR 6 47 a uma diluição de um a 100 e o anticorpo FE caderina ZI independente de cálcio a uma diluição de um a 50 à cultura de VE, meio na câmara de fluxo e incubar a 37 graus Celsius durante 30 minutos. Para preparar os PMNs para o ensaio, coloque-os em banho-maria por 15 minutos a 37 graus Celsius antes de injetá-los no sistema de fluxo.

Conecte a tubulação a uma câmara de fluxo vazia e encha com buffer de fluxo quente para evitar a formação de bolhas de ar. Ao configurar o sistema de fluxo. Usando um tubo de silicone, conecte um lado da câmara de fluxo vazia ao sistema de fluxo da bomba de seringa contendo uma seringa de 20 mililitros.

Coloque a câmara de fluxo no microscópio stage. O ensaio será realizado usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com a objetiva de óleo 63 x e uma câmara climática ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Conecte o outro lado da câmara de fluxo vazia ao frasco do reservatório cheio com tampão de fluxo de 37 graus Celsius e inicie a bomba da seringa para encher toda a tubulação com tampão de fluxo, a bomba puxará o tampão de fluxo do reservatório através da câmara de fluxo para a seringa.

Esta tubulação também contém uma porta de injeção de isca em linha, que permite que os PMNs sejam injetados com uma agulha em um experimento em execução sem interromper o fluxo e criar bolhas de ar. Em seguida, substitua a câmara de fluxo vazia pela câmara de fluxo contendo VE tratado com TNF alfa aperte os tubos antes de desconectá-los e reconectá-los à câmara contendo o VE.To evitar bolhas de ar no sistema, é fundamental beliscar e prender os tubos. Ao conectar o slide que contém as células.

Coloque a câmara de fluxo no microscópio stage, ajuste a velocidade do fluxo para um centímetro quadrado de dez centavos de acordo com a velocidade do fluxo fisiológico no pós-capilar, que é de um a cinco dines por centímetro quadrado de contraste de interferência diferencial de registro ou DIC fite LOR 6 47. Simultaneamente, usando uma seringa de um mililitro, injete o PMN lentamente no sistema de fluxo através da porta de injeção de isca em linha. Após alguns minutos, os leucócitos aparecem, aderem e transmigram, interrompem o experimento em qualquer momento desejado.

Ao desconectar a tubulação da câmara de fluxo e pipetar o fixador na câmara de fluxo, a resistência das monocamadas endoteliais foi medida para testar se os anticorpos interferiam na função de barreira do endotélio. Nenhuma mudança na resistência foi observada quando o VE pôde ouvir um clone de anticorpo 55 7 H ou o controle de isotipo foi adicionado às células. Em contraste, o anticorpo bloqueador de audição VE cod CL 75 reduziu drasticamente a resistência.

A análise de RAP não revelou alteração na recuperação de fluorescência na presença ou ausência do anticorpo VE CADERINA 55 7 H one, indicando que o anticorpo não alterou a dinâmica da distribuição de VE caderina, VE caderina e pcam um durante a migração transendotelial de neutrófilos ou MET em tempo real. O painel superior mostra um neutrófilo delineado em branco aderindo ao endotélio e cruzando a junção célula a célula sem prejudicar a distribuição do VE coerente e do PCAM. Durante a diapedese, uma dispersão local de VE coerente e P chem um pode ser observada quando um neutrófilo se projeta através da célula para junções celulares delineadas em branco é um neutrófilo no topo do endotélio.

O contorno amarelo mostra a membrana de neutrófilos que já está abaixo do endotélio. Após a conclusão da diapedese, as junções se fecham e são realocadas nos locais da diapedese. As bordas do neutrófilo transmigrado são contornadas em amarelo.

Após este procedimento, a migração transendotelial de leucócitos pode ser realizada para responder a perguntas adicionais, como se os leucócitos atravessam o endotélio usando o bagga ou a raiz transcelular.