Name: Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprenda a visualizar em tempo real a transmigração de neutrófilos através de junções endoteliais sob fluxo fisiológico usando microscopia confocal. Este método permite estudar as rotas paracelular e transcelular de migração leucocitária.

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Os autores agradecem ao Dr. P.L. Hordijk pela leitura crítica do manuscrito. O AED é apoiado por uma bolsa da Fundação Landsteiner para Pesquisa de Transfusão de Sangue (LSBR) (concessão # 1028). JK é apoiado pela Fundação Holandesa do Coração (2005T3901). JDvB é um NHS Dekker fellow (bolsa #2005T039).

Os neutrófilos foram isolados de voluntários saudáveis ​​que tenham assinado o termo de consentimento. A pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais e nacionais para o bem-estar humano. 1. chapeamento e Manutenção de veia umbilical humana células endoteliais <ol><li> Células Cultura Cordão Veia endoteliais (HUVEC) de acordo com as instruções do fabricante. As HUVECs crescem em fibronectina (FN) -Revestido pratos (10 ug / ml, dissolvidos em água desmineralizada) utilizando meios (Meio Basal Endotelial (EBM-2) meio suplementado com Meio de Crescimento Endotelial (EGM-2) singlequots). Use cultura celular entre 4-8 passagens para os experimentos. </li><li> Dia 1: O revestimento de fluxo de câmaras com 100 mL de fibronectina (10 ug / ml em PBS), durante pelo menos 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Dia 2: Quando as células atingem 80-90% de confluência, as células trypsinize após lavagem cuidadosa com solução salina tamponada com fosfato temperatura ambiente (PBS) pH 7,4, centrifugar a 800 xg e ressuspender em 800 mil células / ml, utilizando meios de comunicação. Placa de 80.000 células em cada canal do fluxo de câmaras FN-revestidos e Pipeta suavemente a suspensão de células para cima e para baixo. Cultura O / N em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Dia 3: Atualizar a mídia no slide fluxo câmara inclinando ligeiramente as lâminas em um ângulo de 45 °. (Ver Figura 1A). NOTA: Recomenda-se apenas remova a mídia nos reservatórios e não no próprio canal. Remoção dos meios de comunicação nos canais pode resultar em perda de células endoteliais e morte devido à força arrastando da média causada por pipetagem. </li><li> Verificar por microscopia de contraste de fase, se as células endoteliais formam uma monocamada (isto é, 100% confluente). Se as células não são 100% confluentes, alterar a mídia duas vezes por dia até atingirem 100% de confluência. </li><li> Uma vez que as células atingiram a confluência, estimular as células com meios de comunicação (ver passo1,1) contendo mediador inflamatório (TNF-α (10 ng / ml)). Estimular HUVECs S / N (isto é, 12 horas) com os resultados de TNF-α num fenótipo inflamatória do endotélio, por exemplo., A sobre-regulação de moléculas de adesão celular, tais como ICAM-1 e VCAM-1 13. </li></ol> 2 de leucócitos polimorfonucleares isolamento utilizando gradientes de Percoll <ol><li> Preparar N-2-hidroxietilpiperazina-N&#39;-2-etanossulfónico (HEPES) -buffer (daqui em diante chamado de: fluxo de tampão), antes do isolamento de leucócitos polimorfonucleares (PMN). Flow-tampão é usado para lavar os PMNs isolados e como tampão no ensaio de fluxo. Para preparar o fluxo de tampão: diluir 7,72 g de NaCl (132 mM), 4,76 g de HEPES (20 mM), 0,45 g de KCl (6 mM), 0,25 g de MgSO 4 7H 2 O • (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) em 1 L de água desmineralizada e ajusta-se até pH 7,4 (esta unidade pode ser mantida a 4 ° C, durante várias semanas). </li><li> Adicionar 100 ul fresco 1 M CaCl2 &amp; #160, (1 mM), 2,5 ml de albumina humana a partir de uma concentração de 200 g / l de estoque (0,5% v / v) e 0,1 g de glicose a 100 ml (0,1% w / v) de tampão de fluxo. Em seguida, filtra-se o tampão de fluxo utilizando um filtro de 0,45 um. NOTA: Este buffer fluxo precisa ser preparada para cada experimento. </li><li> Antes do isolamento do PMN, preparar uma solução a 10% de citrato trissódico (TNC) em PBS, pH 7,4. </li><li> Recolher 20 ml de sangue total em vacuettes heparina sódica de um voluntário saudável. Dilui-se o sangue total de 1: 1 com 10% de PBS / TNC em tubos de 50 ml e 20 ml de sangue diluído de pipeta cuidadosamente em 12,5 ml de Percoll (a 23% (w / w) de solução coloidal em água com uma densidade de 1,130 g / ml) em um novo tubo de 50 ml. Cuidadosamente coloque os tubos em centrífuga e girar durante 20 minutos a 800 xg, com aceleração e baixa sem pausa ajustado à temperatura ambiente. NOTA: Ao adicionar o sangue diluído ao Percoll, incline o tubo Percoll contendo em um ângulo de 45 ° e pipeta suavemente o sangue diluído na sagacidade tuboh a configuração mais lenta pipeta menino. </li><li> Remover todo o líquido e subsequentemente encher o tubo com a lise de eritrócitos-tampão gelado (4,15 g NH 4 Cl [0,155 M], 0,5 g de KHCO3 [0,01 M] e 18,5 mg de EDTA (triplex III) [0,1 mM] a 500 ml de gelado de H 2 O) para lisar os eritrócitos. Deixar o tubo em gelo, ocasionalmente, invertendo o tubo, até a suspensão torna-se vermelho escuro, seguido por centrifugação a 500 xg durante 5 min a 4 ° C com intervalos activado. NOTA: A fracção de sedimento contem os PMNs (neutrófilos, eosinófilos, basófilos) em conjunto com os eritrócitos. </li><li> Remover o sobrenadante e lave o peletizado duas vezes em lise-tampão gelado a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento com tampão de fluxo à TA e determinar a concentração de PMN utilizando um hemocitómetro ou contador de células automatizado. Suspender as PMNs em fluxo tampão a 1 x 10 6 células / ml e manter à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Rotulagem de junção endotelialai VE-caderina e PECAM-1 <ol><li> Adicionar o PECAM Alexa Fluor 647 anticorpo (clone WM59) a uma diluição 1: 100 e o anticorpo de VE-caderina-FITC independente de cálcio (clone 55-7H1) a uma diluição de 1:50 para meio de cultura de HUVEC (ver passo 1.1), e incubar durante 30 min antes de se iniciar a experiência de fluxo de visualizar dinâmica de junção de células endoteliais durante a transmigração de neutrófilos sob condições de fluxo fisiológico. NOTA: Antes de adicionar os anticorpos diretamente rotulados ao fluxo câmaras, que o volume de cada canal não exceda 100 l. Isto ajuda a manter as despesas de anticorpo tão baixo quanto possível. </li></ol> 4. PMN TEM Ensaio Sob Fluxo <ol><li> Coloque as PMNs em banho-maria durante 15 min a 37 ° C antes de injectar-los para o sistema de fluxo. </li><li> Conecte o tubo de um fluxo-câmara vazia e encha com água morna (por exemplo, 37 ° C) Fluxo-buffer (veja o passo 4.3) para evitar a formação de bolhas de ar quando a criação de thsistema de e fluxo. </li><li> Conectar um lado de uma câmara vazia de fluxo para o sistema de fluxo da bomba de seringa, o uso de tubos de silicone contendo uma seringa de 20 ml, e colocar a câmara de fluxo para a fase de microscópio. </li><li> Ligue o outro lado de um fluxo-câmara vazia para o frasco reservatório enchido com 37 ° C, o fluxo de tampão (Figura 1B) e ligar a bomba de seringa, de modo a encher todo o tubo de escoamento tampão. A bomba vai puxar o fluxo tampão do reservatório, através da câmara de fluxo para dentro da seringa. NOTA: Este tubo também contém uma porta de injecção na linha de Luer, o que permite que os PMN a ser injectada com uma agulha na experiência de marcha, sem interromper o fluxo e criando as bolhas de ar. </li><li> Substituir o fluxo da câmara de vazio com a câmara de fluxo contendo tratados com TNF-α HUVECs, ligar o tubo de fluxo contendo tampão e colocá-lo na fase de microscópio (Figura 1C). Beliscar fora dos tubos antes de desligar e voltar a ligar om para as câmaras que contêm a HUVEC, como não beliscar fora pode resultar na formação de bolhas de ar no interior do tubo e / ou de fluxo de câmaras. </li><li> Ajustar a velocidade do fluxo de 1 dyn / cm 2, de acordo com a velocidade de fluxo fisiológico em vénulas pós-capilares (1-5 dyn / cm 2). </li><li> Grave contraste de interferência diferencial (DIC), FITC (488 nm) e Alexa Fluor 647 (647 nm) simultaneamente, utilizando um microscópio de varredura a laser confocal. </li><li> Injectar as PMNs (passo 4.1) lentamente no sistema de fluxo, através do em-linha Luer porta de injecção (Figura 1D) utilizando seringas de 1 ml. </li><li> Depois de alguns minutos, os leucócitos aparecem, aderir, e transmigrate. Parar a experiência em qualquer momento desejado, desligando o tubo a partir da câmara de escoamento e a pipetagem fixador (formaldeído a 3,7% em PBS), na câmara de fluxo. Permitir fixação durante 10 minutos, seguido de lavagem com PBS. Os dados são analisados ​​por meio de software de imagem (ver materiais e equipamentos de mesa). NOTA: Execute o que experimento utilizando um microscópio de varredura a laser confocal equipado com uma câmara climática com temperatura constante a 37 ° C, 5% de CO2, e um óleo de 63X-objetivo. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Por este protocolo, é crítica para impedir a formação de bolhas de ar nas câmaras de fluxo, uma vez que isto irá resultar na apoptose de células e uma monocamada interrompido. Para evitar isso, queremos salientar que pagar particular interesse para os passos 4.2 e 4.5, onde os tubos estão ligados à câmara de fluxo. Um outro passo crucial no protocolo é a iniciação das PMNs que são mantidos à temperatura ambiente através da sua incubação durante 15-30 minutos a 37 ° C antes de injectar-los para a câmara de fluxo (passo 4.1). Isto resulta na iniciação das integrinas de leucócitos, permitindo-lhes aderir às moléculas de adesão tais como ICAM-1 ou VCAM-1 no endotélio. Este protocolo não está restrito para estudar a transmigração de neutrófilos. Também podem ser utilizados outros tipos de leucócitos tais como monócitos ou linfócitos. Note-se que o passo 4.1, isto é, os leucócitos priming pode ser diferente entre os tipos de leucócitos. Além disso, outros tipos de células endoteliais pode ser utilizado. Por isso, continua a ser críticopara estimular as células endoteliais a estímulos inflamatórios adequados, tais como TNF-α ou IL-1β. Se os neutrófilos não respondem em transmigração, pode-se pensar em tratar o brevemente neutrófilos (5 min) com N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina (fMLP), péptido 16. Isso vai estimular os neutrófilos, em particular as suas integrinas, ainda mais, tornando-os mais propensos a aderir ao endotélio. Normalmente 1 dyn / cm 2 velocidade de fluxo é utilizado. Esta velocidade de fluxo é medido em vênulas pós-capilares, locais onde a maior migração de leucócitos transendotelial ocorre 17. Usando as câmaras de fluxo descritas, é possível aumentar a velocidade de fluxo de até 10 dines / cm 2. No entanto, não é recomendado para aumentar o cisalhamento adicional. Isso pode provocar uma fuga indesejada do tubo e descolamento das células a partir da câmara de fluxo. Os resultados descritos na Figura 3 indicam que estesOs anticorpos podem ser utilizados para visualizar e estudar a dinâmica das junções endoteliais célula-célula durante a diapedese de leucócitos. Em particular, para além dos ensaios de transmigração existentes este protocolo permite discriminar paracelular de migração transcelular em condições de fluxo fisiológicas em tempo real. Uma vez que os anticorpos manchar as junções célula-célula, pode-se marcar o número de leucócitos que atravessar VE-caderina / entroncamentos PECAM-1 positivos contra não positivo VE-caderina / PECAM-1 locais. Desta forma, a migração intracelular pode ser discriminada da migração paracellular. É importante salientar que estes anticorpos não interferem com a função das proteínas que se ligam ao anticorpo a: PECAM-1 utilizados neste estudo é dirigido contra o segundo domínio extracelular. As células endoteliais foram plaqueadas na presença de anticorpo não apresentaram quaisquer defeitos de propagação ou formação de uma monocamada, sugerindo que o anticorpo, pelo menos não o fezinterfere com as interacções homotípicas entre as células endoteliais. para além disso, ambos os anticorpos não prejudica a capacidade dos neutrófilos para migrar através da monocamada endotelial. Além disso, o número de neutrófilos que transmigrar através da monocamada endotelial na ausência ou na presença de anticorpos não é alterada (dados não apresentados). É importante salientar, a microscopia confocal a laser nos dá a possibilidade de gravar diversos canais fluorescentes e DIC simultaneamente. Assim, este ensaio permite estudar a dinâmica da VE-caderina e PECAM-1, ao mesmo tempo, quando um dos neutrófilos atravessa a junção célula-célula endotelial e irá ajudar a entender por leucócitos escolher um percurso sobre o outro, isto é, contra paracelular transcelular.

Eficiente e rigidamente controlado migração de leucócitos transendotelial (TEM) é de importância fundamental em processos fisiológicos como a vigilância imunológica e inflamação aguda. No entanto, sob certas condições fisiopatológicas, TEM descontrolada e excessiva resultante é observado em doenças inflamatórias crónicas (por exemplo, artrite reumatóide, aterosclerose, asma). Também durante a metástase de células tumorais, o processo de migração transendotelial é instrumental para células tumorais para deixar a circulação de metástase 1-3. A fim de interferir especificamente com leucócitos excessiva ou MET de células de tumor, é necessário um conhecimento detalhado da regulação deste processo. Acredita-se que o processo ocorre através de MET diferentes etapas. Estudos seminais, avaliação, há duas décadas por Butcher e Springer, levou ao modelo de várias etapas que descreve o processo de TEM 4,5. Este modelo ainda é válido, embora alguns anúncioetapas nal foram incluídas 6. Alon et ai. Descrito a necessidade da presença de quimiocinas imobilizadas na superfície do endotélio 7. Recentemente, eles mostraram que o próprio endotélio gera quimiocinas que são apresentados na superfície apical endotelial 8. Além disso, o mesmo grupo apresentou a importância das condições de fluxo durante TEM 7. Recentemente, várias publicações voltadas para as duas rotas diferentes leucócitos pode tomar na fase final da diapedese TEM. Eles podem ir através da junção célula-célula, isto é, o percurso de migração paracelular, ou atravessam o corpo da célula endotelial, conhecido como o percurso de migração transcelular 9. Carman e seus colegas estudaram estes percursos em detalhe e concluiu que os leucócitos, preferencialmente, escolher a rota de migração paracellular (90%) ao longo da via transcelular (10%) ao atravessar uma monocamada endotelial da veia umbilical 10.No entanto, quando foram utilizadas células endoteliais de outras origens, por exemplo, cérebro ou microvasculatura, mais leucócitos utilizada a via transcelular (30%) 11. O grupo Vestweber mostraram recentemente que quando as junções célula-célula foram incapazes de se dissociam umas das outras por meio de um bate-em modelo animal, a substituição endógena VE-caderina para uma VE-caderina-alfa-catenina quimera, leucócitos MET foi totalmente bloqueada 12 . Surpreendentemente, os autores verificaram que TEM foi bloqueado em vários, mas não todos, os tecidos. Em geral, estas experiências indicaram que os leucócitos elegantes preferidas via paracelular através da via transcelular, embora os sinais reguladores que desencadeiam esta decisão ainda são desconhecidos. Embora a maioria dos leucócitos preferência o percurso de migração paracelular, ainda é difícil discriminar entre as duas vias. Além de que, apesar de vários estudos focalizando o papel do Junct célula-célula endotelialíons, a dinâmica desses cruzamentos, em especial, as proteínas juncionais VE-caderina e PECAM-1, durante a travessia de leucócitos ainda está em debate. Foi desenvolvido um ensaio relativamente simples, no qual estas moléculas de junção pode ser monitorado em tempo real durante a diapedese de leucócitos em condições de fluxo fisiológicas, utilizando anticorpos marcados fluorescentemente. Estes anticorpos não interferir ou bloquear integridade juncional ou mobilidade das proteínas-alvo. Este ensaio nos permite acompanhar a dinâmica das proteínas juncionais durante o processo de paracellular TEM. Além disso, este ensaio também permite discriminar entre os parágrafos e transcelulares rotas de migração.

<table><tbody><tr><td>&mu;-Slide VI</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td>Câmara de fluxo</td></tr><tr><td>0,45 &mu; Filtro M&nbsp;</td><td>Seringa Whatman/GE Lifesciences</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>1 ml&nbsp;</td><td>Seringa BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>20 ml&nbsp;</td><td>Agulha BD Discardit II</td><td>366296</td><td></td></tr><tr><td>21 G&nbsp;</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>Albumina&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>15522644</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amônio (NH4Cl)</td><td>Cloreto</td><td>de cálcio Merck 1009245000</td><td></td></tr><tr><td>(CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Fatores de Crescimento</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 + CC-4176</td><td>media</td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Tubos Merck</td><td>1370041000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp;</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-2MG</td><td></td></tr><tr><td>FN Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Porta de injeção Luer em linha&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4&bull; 7H2O)</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1-ALEXA-647&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561654</td><td>clone WM59</td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>Tampão com Fosfato Salino</td><td>Fresenius Kabi&nbsp; Nederland</td><td>M090001/01NL</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de potássio (KHCO3)</td><td>Merck</td><td>1048540500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico trihidratado (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Tygon 3350 tubing</td><td>VWR</td><td>Tubulação 228-4331</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>567441</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa&nbsp;</td>Número do modelo <td>do Harvard Apparatus</td><td>55-5920</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha; &nbsp;</td><td>Fator de necrose tumoral</td> <td>Peprotech</td><td>300-01A</td></tr><tr><td>Citrato trissódico&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.06447.5000</td><td>TNC</td></tr><tr><td>Vacuettes</td><td>Greiner, Alemanha</td><td>980044</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin-FITC&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>560411</td><td>clone 55-7H1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software 2008</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Alemanha</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante neutrophil transmigração sob fisiológica fluxo

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Durante a inflamação, leucócitos deixam a circulação e atravessar o endotélio para combater patógenos invasores nos tecidos subjacentes. Este processo é conhecido como a migração de leucócitos transendotelial. Duas vias de leucócitos para atravessar a monocamada endotelial foram descritos: a via paracelular, ou seja, através da junção célula-célula e da via intracelular, isto é, através do corpo da célula endotelial. No entanto, tem sido tecnicamente difícil discriminar entre o pará- e via transcelular. Foi desenvolvido um ensaio in vitro simples para estudar a distribuição dos endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de neutrófilos sob condições de fluxo fisiológico. Antes da perfusão de neutrófilos, células endoteliais foram tratados brevemente com anticorpos marcados com fluorescência contra VE-caderina e PECAM-1. Estes anticorpos não interferem com a função de ambas proteínas, tal como foi determinado pela célula-substra eléctricoste de detecção da impedância e FRAP medições. Utilizando este ensaio, foi possível seguir a distribuição da endógena VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial sob condições de fluxo e discriminar entre os parágrafos e migração transcelular rotas dos leucócitos através do endotélio.

Primeiro, testamos se os anticorpos não interferiu com a função de barreira do endotélio. Medimos a resistência de monocamadas endoteliais usando célula-substrato impedância detecção elétrica (ECIS). Para mais detalhes, ver Van Buul et al. 13 Nenhuma mudança na resistência foi observada quando o anticorpo anti-VE-caderina fluorescentemente marcada foi adicionada às células (Figura 2A). Um anticorpo anti-VE-caderina, que é bem conhecida para bloquear a VE-caderina função reduzida a resistência dramaticamente (Figura 2A). Além disso, os anticorpos utilizados para imagiologia de não alterar a dinâmica de VE-caderina, como foi avaliado através da medição de fluorescência a recuperação após foto-branqueamento (FRAP) de VE-caderina-GFP (Figura 2B). Após 1-2 minutos, os neutrófilos aderida à monocamada endotelial activado como poderia ser visualizado no canal de DIC (Figura 3A). Depois de rastejar para 5-30 sec, a grande maioria dos neutrófilos transmigrou através da monocamada endotelial através da junção célula-célula que foram marcadas com os anticorpos dirigidos contra PECAM-1 e VE-caderina. Durante o processo de diapedese, a distribuição da VE-caderina e PECAM-1 foi seguida em tempo real (Figura 3B). Nos locais de neutrófilos diapedese, VE-caderina foi interrompida localmente e PECAM-1 mostrou uma estrutura mais em forma de anel. Depois de se completar a diapedese, as junções estreitas e VE-caderina e PECAM-1 claramente realocados nos locais de diapedese (Figura 3C). Note-se que as partes do anticorpo anti-PECAM-1 foram detectados na superfície de neutrófilos quando os neutrófilos atingiram o lado baso-lateral do endotélio. No entanto, isso não impediu que os neutrófilos de atravessar o endotélio. As dinâmicas observadas de VE-caderina em tempo real durante a migração de neutrófilos transendotelial estavam de acordo com o trabalho de Shaw e colegas quemostrou, através de microscopia confocal e VE-caderina-GFP-transfectadas células endoteliais, que VE-caderina-GFP difundida lateralmente quando leucócitos cruzou as junções célula-célula endotelial 14. Trabalhar também por Su e colaboradores ressaltaram as nossas observações de PECAM-1. Eles mostraram que, ao lado de lateral do VE-caderina difusão sobre passagem de leucócitos, PECAM-1 foi redistribuído localmente em um anel em torno dos neutrófilos transmigrando 15. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400"> Figura 1 Na câmara de fluxo in vitro. (A) A seta indica o reservatório a partir do qual o meio necessita de ser actualizada. (B) tubo de silicone que liga a câmara de fluxo com o in-line porta de injeção Luer usado para injetar PMNs sem desconectar o tubo (seta). (C) Connexão de um fluxo-câmara vazia para o frasco reservatório enchido com 37 ° C, o fluxo de tampão (ponta de seta). (D) de ligação da câmara de fluxo com as HUVEC tratadas com TNF-α para o tubo de fluxo contendo tampão e colocada na platina do microscópio (ponta de seta). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500"> Figura 2 VE-caderina anticorpos não interferem na dinâmica ou função juncional. (A) monocamada de células endoteliais impedância é medida usando ECIS. Eixo Y expressa impedância em Ohms e o eixo x representa o tempo em horas. VE-caderina de murganho, clone 55-7H1, marcado com ALEXA647 (linha azul) ou IgG de controlo isotipo-ALEXA647 (linha vermelha) não alteram impedância monocamada de células endoteliais, enquanto que a VE-caderina de bloqueio CL75 anticorpo (linha preta) fez reduzir a impedância . (B <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500"> Figura 3. VE-caderina e PECAM-1 de distribuição durante TEM neutrófilos em tempo real. (A) Neutrófilos (marcada com linha branca) aderindo sobre o endotélio e atravessando a junção célula-célula, sem afectar a distribuição de VE-caderina e PECAM -1. (B) de Neutrófilos de atravessar a monocamada endotelial através da junção célula-célula. Uma dispersão de locais de VE-caderina e PECAM-1 podem ser observadas quando um neutrófilo sobressai através da junção célula-célula. A linha branca ilustra a presença de neutrófilos ainda na parte superior do endotélio. Linha amarela mostra tha membrana de neutrófilost já está debaixo de endotélio. (C) de neutrófilos foi totalmente cruzou a monocamada endotelial. VE-caderina e PECAM-1 são realocados em locais de diapedese. Linha amarela ilustra fronteiras do neutrófilo transmigrou. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

O objetivo geral deste procedimento é acompanhar a distribuição da juncional endógena, terina e pcam durante a migração transendotelial de leucócitos em condições fisiológicas de fluxo. Isso é feito isolando primeiro os leucócitos polimorfonucleares ou PMNs do sangue total de voluntários saudáveis usando um gradiente proco. O segundo passo é adicionar anticorpos marcados com fluorescência a uma monocamada de células endoteliais da veia umbilical humana estimulada por TNF alfa cultivada em lâminas de fluxo 30 minutos antes de iniciar o experimento de fluxo.Isso permitirá a visualização da dinâmica juncional das células endoteliais durante a transmigração de neutrófilos sob condições fisiológicas de fluxo. Em seguida, a lâmina de fluxo contendo as células endoteliais da veia umbilical humana estimuladas com TNF alfa marcadas com fluorescência é conectada ao sistema de fluxo e colocada no estágio do microscópio. A bomba puxará o buffer de fluxo do reservatório através da câmara de fluxo para a seringa.A etapa final é injetar os PMNs lentamente no sistema de fluxo através da porta de injeção. Em última análise, os PMNs são visualizados usando um microscópio confocal de varredura a laser. Após alguns minutos, os leucócitos aparecem, aderem e transmigram.O experimento pode ser interrompido a qualquer momento desejado. A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos existentes, como ensaios de transmigração estática, é que com esta técnica você pode estudar a adesão e a transmigração na vida real sob condições fisiológicas de fluxo. Isso nos ajudará a entender por que os leucócitos escolhem uma raiz em detrimento da outra, então PGA versus migração transcelular.Fazemos isso visualizando as junções celulares com anticorpos marcados com fluorescência. As células endoteliais da veia umbilical humana ou HU X para este experimento são cultivadas de acordo com as instruções do fabricante em placas revestidas com fibronectina usando meio suplementado com crescimento endotelial. Média. A cultura de células é usada entre quatro a oito passagens quando as células atingem 80 a 90% Confluência lave-as cuidadosamente com PBS em temperatura ambiente em pH 7,4 e, em seguida, a tripsina é as células após a tripsina e centrifugação.Suspendemos a 800.000 células por mililitro usando meios. O experimento usa câmaras de fluxo que foram revestidas com fibronectina na placa do dia anterior. 80.000 células em cada canal das câmaras de fluxo codificadas pela fibronectina e pipetam suavemente a suspensão celular para cima e para baixo durante a noite em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no dia seguinte.Atualize a mídia na corrediça da câmara de fluxo inclinando suavemente a corrediça em um ângulo de 45 graus. Recomenda-se remover apenas o meio nos reservatórios e não no próprio canal. A remoção do meio nos canais pode resultar em perda de células endoteliais e morte devido à força de arrasto do meio causada pela pipetagem.Verifique por microscopia de contraste de fase se as células endoteliais formaram uma monocamada. Se as células não estiverem 100% cofluentes, troque o meio duas vezes ao dia até atingir 100% de confluência. Uma vez que as células tenham atingido 100% de fluência, estimule as células com meios contendo o mediador inflamatório.O TNF alfa estimulando uix durante a noite com TNF alfa resulta em um fenótipo inflamatório do endotélio IE regulação positiva de moléculas de adesão celular, como ICAM one e VA M1. Antes de isolar leucócitos polimorfonucleares ou PMNs. Preparar um tampão de fluxo para lavar PMNs isolados e para uso no ensaio de fluxo para 100 mililitros de uma solução-mãe previamente preparada. A 100 microlitros de cloreto de cálcio molar fresco, 2,5 mililitros de albumina humana de uma concentração de estoque de 200 gramas por litro e 0,1 gramas de glicose.Filtre o buffer de fluxo usando um filtro de 0,45 mícron. Uma solução de citrato trissódico a 10% ou TNC em PBS a pH 7,4 também é preparada antes do isolamento de PMNs. Os PMNs serão isolados de 20 mililitros de sangue total coletados em uma heparina sódica de um voluntário saudável.Primeiro dilua o sangue total um a um com 10% de PBST NNC em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, use um pipeta boy na configuração mais lenta para pipetar cuidadosamente 20 mililitros de sangue diluído cuidadosamente em 12,5 mililitros de solução coloidal per co em água com densidade de 1,130 gramas por mililitro em um novo tubo de 50 mililitros. O tubo contendo por colo deve ser inclinado em um ângulo de 45 graus durante a adição do sangue.Colocar cuidadosamente os tubos na centrífuga e centrifugar à temperatura ambiente durante 20 minutos a 800 Gs com baixa aceleração e com os travões desligados quando a centrifugação estiver completa. Remova todo o líquido e encha cada tubo com tampão de lise de eritrócitos gelado para lixar os eritrócitos. Deixe os tubos no gelo, invertendo-os ocasionalmente até que a suspensão fique vermelha escura centrífuga a 500 GS por cinco minutos a quatro graus Celsius com os freios ativados.A fração de pellets resultante contém os PMNs Juntamente com os eritrócitos, remova o sobrenadante e lave o pellet duas vezes em gelo. Tampão de lise fria a 500 Gs por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a remoção do sobrenadante da segunda lavagem, suspender novamente o pellet com tampão de fluxo à temperatura ambiente e determinar a concentração de PMNs usando um contador de células automatizado.Por fim, suspenda os PMNs no tampão de fluxo de uma vez 10 a seis células por mililitro e mantenha-os em temperatura ambiente para marcar a caderina VA juncional endotelial e o pcam um. Adicionar o anticorpo pcam LOR 6 47 a uma diluição de um a 100 e o anticorpo FE caderina ZI independente de cálcio a uma diluição de um a 50 à cultura de VE, meio na câmara de fluxo e incubar a 37 graus Celsius durante 30 minutos. Para preparar os PMNs para o ensaio, coloque-os em banho-maria por 15 minutos a 37 graus Celsius antes de injetá-los no sistema de fluxo.Conecte a tubulação a uma câmara de fluxo vazia e encha com buffer de fluxo quente para evitar a formação de bolhas de ar. Ao configurar o sistema de fluxo. Usando um tubo de silicone, conecte um lado da câmara de fluxo vazia ao sistema de fluxo da bomba de seringa contendo uma seringa de 20 mililitros.Coloque a câmara de fluxo no microscópio stage. O ensaio será realizado usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com a objetiva de óleo 63 x e uma câmara climática ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Conecte o outro lado da câmara de fluxo vazia ao frasco do reservatório cheio com tampão de fluxo de 37 graus Celsius e inicie a bomba da seringa para encher toda a tubulação com tampão de fluxo, a bomba puxará o tampão de fluxo do reservatório através da câmara de fluxo para a seringa.Esta tubulação também contém uma porta de injeção de isca em linha, que permite que os PMNs sejam injetados com uma agulha em um experimento em execução sem interromper o fluxo e criar bolhas de ar. Em seguida, substitua a câmara de fluxo vazia pela câmara de fluxo contendo VE tratado com TNF alfa aperte os tubos antes de desconectá-los e reconectá-los à câmara contendo o VE.To evitar bolhas de ar no sistema, é fundamental beliscar e prender os tubos. Ao conectar o slide que contém as células.Coloque a câmara de fluxo no microscópio stage, ajuste a velocidade do fluxo para um centímetro quadrado de dez centavos de acordo com a velocidade do fluxo fisiológico no pós-capilar, que é de um a cinco dines por centímetro quadrado de contraste de interferência diferencial de registro ou DIC fite LOR 6 47. Simultaneamente, usando uma seringa de um mililitro, injete o PMN lentamente no sistema de fluxo através da porta de injeção de isca em linha. Após alguns minutos, os leucócitos aparecem, aderem e transmigram, interrompem o experimento em qualquer momento desejado.Ao desconectar a tubulação da câmara de fluxo e pipetar o fixador na câmara de fluxo, a resistência das monocamadas endoteliais foi medida para testar se os anticorpos interferiam na função de barreira do endotélio. Nenhuma mudança na resistência foi observada quando o VE pôde ouvir um clone de anticorpo 55 7 H ou o controle de isotipo foi adicionado às células. Em contraste, o anticorpo bloqueador de audição VE cod CL 75 reduziu drasticamente a resistência.A análise de RAP não revelou alteração na recuperação de fluorescência na presença ou ausência do anticorpo VE CADERINA 55 7 H one, indicando que o anticorpo não alterou a dinâmica da distribuição de VE caderina, VE caderina e pcam um durante a migração transendotelial de neutrófilos ou MET em tempo real. O painel superior mostra um neutrófilo delineado em branco aderindo ao endotélio e cruzando a junção célula a célula sem prejudicar a distribuição do VE coerente e do PCAM. Durante a diapedese, uma dispersão local de VE coerente e P chem um pode ser observada quando um neutrófilo se projeta através da célula para junções celulares delineadas em branco é um neutrófilo no topo do endotélio.O contorno amarelo mostra a membrana de neutrófilos que já está abaixo do endotélio. Após a conclusão da diapedese, as junções se fecham e são realocadas nos locais da diapedese. As bordas do neutrófilo transmigrado são contornadas em amarelo.Após este procedimento, a migração transendotelial de leucócitos pode ser realizada para responder a perguntas adicionais, como se os leucócitos atravessam o endotélio usando o bagga ou a raiz transcelular.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, descrevemos um método não invasivo de dois fótons abordagem microscopia (2P) para estudo de leucócitos homing na pata do rato. Discutimos os aspectos técnicos de nossa preparação tissular e andar o leitor através de um experimento típico de configuração inicial para coleta de execução e de dados.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Este é um método para visualizar a adesão de leucócitos ao endotélio em vasos pressurizados colhidas. A técnica permite estudar de adesão vascular sob fluxo de cisalhamento com diferentes pressões intraluminal até 200 mmHg, assim, imitam-ing as condições fisiopatológicos da pressão arterial elevada.

Imagem adesão leucocitária ao endotélio vascular na pressão intraluminal de alta

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

Este artigo primeiro descreve um procedimento para isolar células endoteliais humanas a partir de veias umbilicais e, em seguida, mostra como usar estas células para examinar transmigração de neutrófilos em condições de escoamento. Ao utilizar uma câmara de fluxo de baixo volume feita a partir de um polímero com as características ópticas do vidro, ao vivo de células imagem fluorescente de populações de células raras é também possível.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

A imunidade adaptativa é controlada por 'sinapses imunológicas' dinâmicas formadas entre células T e células apresentadoras de antígenos. Este protocolo descreve métodos para investigar células endoteliais como APCs fisiológicas pouco estudadas e como um novo tipo de 'modelo de APC celular planar'.

Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Aqui, apresentamos um protocolo integrado que mede subpopulação de monócitos tráfico sob fluxo in vitro pelo uso de marcadores de superfície específicas e microscopia de fluorescência confocal. Este protocolo pode ser usado para explorar etapas sequenciais de recrutamento, bem como perfil de outros subtipos de leucócitos usando outros marcadores de superfície específicos.

Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

Neste protocolo, um ensaio biomimético de microfluido, que pode reproduzir um ambiente microvascular fisiologicamente relevante e reproduzir toda a cascata de adesão/migração leucócito, é empregado para estudar interações células leucócitos-endoteliais em doenças inflamatórias.

Um sistema microfisiológico para estudar a interação das células leucócitos-endoteliais durante a inflamação

Aprenda a visualizar em tempo real a transmigração de neutrófilos através de junções endoteliais sob fluxo fisiológico usando microscopia confocal. Este método permite estudar as rotas paracelular e transcelular de migração leucocitária.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

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