Name: Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Aprenda a visualizar interações plaqueta-neutrófilo em tempo real sobre o endotélio ativado durante inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos usando microscopia intravital.

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Este trabalho foi financiado em parte por concessões do National Institutes of Health (P30 HL101302 e RO1 HL109439 a JC) e da American Heart Association (SDG 5.270.005 de JC). A. Barazia foi apoiado por uma NIH T32HL007829 treinamento subvenção.

1. Preparação de microscópio intravital (Figura 1A) <ol><li> Preparar tampão de superfusão (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM de MgCl2, e 17 mM de NaHCO3, pH 7,4). </li><li> Transformar-se num banho de água para manter a temperatura circulatório de tampão e um cobertor de termo-regulado a 37 ° C. Arejar tampão com gás de azoto (5% de CO 2 equilibrada com azoto). </li><li> Ligue o sistema de microscópio (Sutter Lambda DG-4 de alta velocidade de onda changer, trabalho com computador, microscópio Olympus BX61W, MPC-200 de multi-manipulador, o ROE-200 controlador de fase, câmera de alta velocidade, e intensificador). </li><li> Para o modelo de inflamação vascular, usar um espelho dicróico de 100%. Para induzir a formação de trombos por uma lesão laser, substituir um espelho 100% com um espelho de 50/50% e ligar um sistema de ablação por laser Micropoint. </li></ol> 2. Preparação do músculo cremaster para microscopia intravital (Figura 1B) <ol><li> Anestesiar umrato macho (6-8 semanas de idade, ratinhos C57BL / 6) por injecção ip de cetamina (125 mg de peso corporal / kg (PC)) e xilazina (12,5 mg / kg de peso corporal). A Universidade de Illinois Animal Care Institucional e Comitê de Uso aprovado todo o cuidado animal e procedimentos experimentais. Para um modelo de inflamação vascular, injectar murina TNF-α (0,5 ug em 250 uL de solução salina) intrascrotally num rato hr 3 antes de imagiologia (2-2,5 horas antes da cirurgia). </li><li> Colocar o rato sobre um cobertor de termo-regulado a 37 ° C num tabuleiro de microscópio intravital. </li><li> Puxar para cima da pele sobre a superfície do gargalo e com a pinça incisão horizontal da linha média da pele do pescoço até 1 cm com uma tesoura. </li><li> Abra cuidadosamente a musculatura cervical com uma tesoura sem corte e retire o músculo ao redor da traquéia. </li><li> Canular um tubo PE90 na traqueia para eliminar a dificuldade de respiração. </li><li> Remover suavemente o lado esquerdo do músculo do colo do útero e isolar a veia jugular dos tecidos vizinhos. </li><li> C annuum tubo PE10 tarde na veia jugular esquerda para infusão de anestésicos e de anticorpos adicionais. </li><li> Retire cuidadosamente e incisão na pele do escroto horizontalmente. Para manter a integridade do tecido ao longo do experimento, tampão pré-aquecido foi superfundidos sobre o campo cirúrgico. </li><li> Pressione na parte inferior do abdômen com uma pinça e retire cuidadosamente um testículo com a pinça outro. </li><li> Remover os tecidos conjuntivos circundantes em torno dos testículos. </li><li> Faça uma incisão no músculo cremaster verticalmente e achatar o músculo mais de uma lamela de vidro em uma bandeja de microscópio intravital fixando a periferia. </li><li> 10-20 min para permitir que o músculo se estabilizar antes da recolha de dados. Arteríolas do músculo cremaster (para a formação de trombo) e vénulas (por inflamação vascular), com um diâmetro de 30-45 mM foram escolhidos para o nosso estudo. </li><li> Para manter as condições de anestesia, infundir 30-50 ml do mesmo anestésico min aproximadamente a cada 30 através do cannulus jugular. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Microscopia intravital para TNF-α induzida por inflamação vascular <ol><li> Após a colocação do mouse sobre o microscópio intravital, aberto SlideBook software 5.0 e clique em &quot;Janela de foco&quot; na barra de menu para definir a ótica adequadas e objetivas (60X). </li><li> Infundir Dylight 488-conjugado de rato anti-ratinho CD42c (0,1 ug / g BW em 100 ul de solução salina) e Alexa Fluor 647-conjugados de rato anti-ratinho Gr-1 anticorpos (0,05 ug / g BW em 100 ul de solução salina) através de uma veia jugular cannulus . </li><li> Vá para a barra de menu, e clique em &quot;Captura de Imagem&quot; na barra de ferramentas. </li><li> Um novo menu irá aparecer, em &quot;Imagem&quot;, selecione &quot;Fator de Bin&quot;, como 1x1 e selecione &quot;640&quot; na largura e &quot;460&quot; na altura. </li><li> Em &quot;Set Filter&quot;, marque a caixa de seleção para os canais que você gostaria de expor e definir o tempo de exposição para cada um. Por exemplo, o canal aberto: 10 ms, FITC canal: 50 ms, e Cy5 canal: 50 ms. </li><li> Selecione &quot;Capture Time-Lapse&quot; para ajustar o número de pontos de tempo e intervalo. For o modelo de inflamação, o número de pontos de tempo é definido como 1000-1500 com um intervalo de 200 msec (tempo decorrido Total: 5 min). </li><li> Clique em &quot;Test&quot; para ver uma imagem única avião no tempo de exposição especificado para aquele canal. Ajustar o tempo de exposição e / ou da luz do microscópio até que o histograma mostra uma distribuição de intensidade adequada (para multi-canal de captura, repetir esse processo para cada canal). </li><li> Depois de todos os parâmetros são definidos (canais, tempos de exposição, e assim por diante) no &quot;Captura de Imagem&quot;, selecione &quot;Iniciar&quot; para começar a captura. </li><li> Monitorar plaquetas rolantes e aderente e neutrófilos durante 5 min na metade superior de uma vénula cremaster inflamada no modelo de inflamação vascular. Oito a dez diferentes vénulas são gravados em um rato. </li><li> As imagens foram tiradas com uma ampliação total de 60X (1,0 NA objetivo imersão em água), dando um tamanho de janela de 157 x 118 mM mM. </li><li> Após a conclusão da experiência, os ratos foram sacrificados via cervical dislocation. </li></ol> 4. Análise de Dados para o Modelo de Inflamação venular <ol><li> Abra SlideBook software 5.0 e clique em &quot;Pasta&quot; na barra de menu para abrir um arquivo. </li><li> Clique no menu drop-down canal e selecione &quot;Abrir, FITC, Cy5, etc&quot; </li><li> Clique em &quot;renormalizar (barras vermelhas e verdes)&quot; e selecionar o canal. Arrastar as barras vermelhas e verdes para a esquerda ou para a direita a aproximadamente optimizar o sinal de fluorescência. </li><li> Clique em &quot;Aplicar&quot; e &quot;OK&quot; para atualizar a imagem. </li><li> Clique em &quot;Botão Miniatura&quot; para selecionar a exibição atual como padrão. </li><li> Jogar imagem timelapse capturado, e contar neutrófilos rolamento e aderentes durante o período de 5 min. </li><li> Para analisar a formação de trombos de plaquetas, vá para &quot;Máscara&quot; e selecione &quot;Criar&quot;. </li><li> Nome de uma máscara e marca &quot;Na imagem atual&quot;. </li><li> Clique em &quot;ícone do lápis Grande&quot; em &quot;Marquee Tool&quot; na tela principal. </li><li> Colorir uma região fora da embarcação na vista principal para definir uma máscara de fundo. </li><li> Ir to &quot;Máscara&quot;, clique em &quot;Copiar este plano&quot;, clique em &quot;Copiar máscara no ponto de tempo atual&quot; e selecione &quot;Todos os instantes&quot;, e clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Para calcular sinal de fundo, vá em &quot;Estatísticas&quot; e clique em &quot;Estatísticas máscara&quot;. </li><li> Clique em &quot;Current Time Lapse 2D ou 4D Imagem (s)&quot; no Âmbito da imagem, e selecione &quot;máscara inteira&quot; no escopo de máscara. Em Recursos, selecione &quot;O tempo decorrido (hh: mm: ms)&quot; em data de captura, selecione &quot;Área (pixels)&quot; em Morfometria, selecione &quot;intensidade máxima&quot; em intensidade, e clique em &quot;Export&quot; (Este método estatístico que nos permite calcular automaticamente a intensidade de fluorescência (sinal de fundo)). </li><li> Abra o ficheiro de texto em MS Office Excel e calcular o valor médio do sinal de fundo durante todo o período de gravação. Esta é a intensidade de fluorescência de fundo. </li><li> Para determinar a intensidade do trombo, clique em &quot;ícone do lápis grande&quot; novamente no &quot;Marquee Tool&quot; na tela principal. </li><li> Cor dentro do vaso na vista principal para definir o sinal de plaquetas. </li><li> Vá em &quot;Máscara&quot;, clique em &quot;Copiar este plano&quot;, clique em &quot;Copiar máscara no ponto de tempo atual&quot;, selecione &quot;Todos os instantes&quot;, e clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Vá em &quot;Estatísticas&quot; e clique em &quot;Estatísticas máscara&quot;. </li><li> Clique em &quot;Current Time Lapse 2D ou 4D Imagem (s)&quot; no Âmbito da imagem, e selecione &quot;máscara inteira&quot; no escopo de máscara. Em Recursos, selecione &quot;O tempo decorrido (hh: mm: ms)&quot; em data de captura, selecione &quot;Área (pixels)&quot; em Morfometria, selecione &quot;Intensidade Soma&quot; em intensidade, e clique em &quot;Export&quot; (Este método estatístico nos permitem o cálculo da intensidade de fluorescência no interior do vaso). </li><li> Abra o arquivo de texto no MS Office Excel. Sinal de fluorescência das plaquetas é calculado subtraindo-se o valor médio da área de fundo x intensidade (pixel) a partir da intensidade da soma do interior do vaso. Esta é a intensidade de fluorescência do trombo plaquetário. </li><li> Repetir este em 30 vénulas diferentes em 3-5 ratos diferentes. Em seguida, calcular o valor médio da intensidade de fluorescência das plaquetas. </li><li> Paraanalisar o rolamento dos neutrófilos e adesão, o influxo de rolamento dos neutrófilos foi determinada ao longo de 5 min em cada vénula e apresentados como o número de células por minuto. O número de neutrófilos aderentes que foram fixas durante&gt; 30 segundos e, lentamente, rastreado (&lt;10 fim ao longo de 30 s), mas não rolar, foram contados e apresentados como o número de células por 5 min. </li></ol> 5. Microscopia intravital para laser induzida trombose arteriolar 5-1 Calibração do laser de ablação <ol><li> Coloque uma corrediça espelhada em platina do microscópio, aplicar uma pequena gota de água destilada para a parte superior da lâmina, e ajuste da intensidade e da focagem utilizando a ocular. </li><li> Abrir &quot;janela de foco&quot; e selecione a opção &quot;FRAP&quot; guia na SlideBook software 5.0. </li><li> Definir a potência do laser em 40-50, e definir os dois &quot;repetições duplo clique&quot; e &quot;tamanho duplo clique&quot; para 8. Marque sobre o &quot;Guia&quot; caixa para abrir um conjunto de mira. </li><li> Selecione a opção &quot;Arrow&quot; ícone na barra de tarefas on parte superior da tela. </li><li> Sob o &quot;FRAP Alinhamento&quot;, clique em &quot;Fogo seguinte&quot;. Uma pequena mancha deve aparecer perto do canto inferior esquerdo do monitor. Uma vez que o local aparece, dê um duplo clique no centro dela. Uma vez clicado, outro ponto deve aparecer acima e à direita do primeiro ponto; clique duas vezes sobre ele. Repita este procedimento para os 16 pontos (o local 16 ª aparecerá no canto inferior direito). Clique em &quot;Salvar&quot; quando terminar de atualizar os parâmetros de calibração. </li><li> Para testar a precisão da calibragem, clique sobre o &quot;Centro&quot; local-um pequeno botão deve aparecer no centro da tela. Se não, repita a calibração até que a precisão desejada seja atingida. </li></ol> 5-2 laser induzida por formação de trombo arteriolar <ol><li> Colocar um rato anestesiado (ver o procedimento de 2-2 a 2-12) na platina do microscópio. </li><li> Sob a &quot;captura&quot; janela, selecione um protocolo ou criar um novo. As configurações são as seguintes: CY5 (70 exposição ms), Open (10 msec exposição) e FITC (50 exposição msec). Imagem é capturada mais de 20 min (aproximadamente 2.400 pontos de tempo com um intervalo de tempo de 500 ms). </li><li> Infundir Dylight 488-anti-rato conjugado e CD42c Alexa Fluor 647-conjugados anti-ratinho Gr-1 anticorpos, tal como descrito acima. </li><li> Otimizar os parâmetros de microscópio incluindo intensidade de fluorescência e imagem de campo claro como descrito em 3-3 para 3-7. </li><li> Clique no botão &quot;Teste&quot; para garantir a intensidade de campo claro adequada ou sinal de anticorpos, colocação arteríola e foco. </li><li> Clique em &quot;Iniciar&quot; para iniciar o processo de captura de imagem. </li><li> Antes de disparar o laser de ablação, certifique-se de que o ícone ponteiro do mouse foi selecionado e que a parede do reservatório está em foco claro. </li><li> Para disparar o laser, clique duas vezes em um ponto 2-3 mM internamente a partir da parede do vaso. Lesão das células endoteliais arteriolares provoca uma alteração de forma visual, que deve ser aparente na imagem de campo claro, seguindo-se a acumulação de plaquetas. Monitor de tromboformação, durante 5 min após a lesão laser. </li><li> Cinco minutos após a lesão de laser (do tamanho do trombo agora deve ser estável) pausar e cancelar a captura. Subsequentemente, iniciar uma captura com 2400 pontos de tempo com um intervalo de 500 msec para gravar plaquetas aderentes e neutrófilos rolantes / aderente durante 20 min. Três a cinco arteríolas são gravados em um rato. </li><li> Após a conclusão da experiência, os ratos foram sacrificados através de deslocação cervical. </li></ol> 6. Análise de Dados para o Modelo de Trombose arteriolar <ol><li> Vá passos 4,1 por 4,5. </li><li> Para obter a intensidade de fluorescência de fundo durante a formação de trombos de plaquetas, passar por cima de passos 4,7 por 4,14. </li><li> Vá em &quot;Máscara&quot;, clique em &quot;Segmento&quot;, selecione FITC no canal, e inserir o valor médio do sinal de fundo em baixa. Clique em &quot;Aplicar&quot; e &quot;OK&quot;. </li><li> Para a análise da intensidade de fluorescência de trombos plaquetários (Dylight 488-conjugado anticorpo anti-CD42c), </strong&gt; passar por cima de passos 4,18 por 4,19. Para o cálculo do sinal de anticorpo, &quot;Intensity Sum&quot; é subtraído do sinal de fundo (&quot;Intensidade máxima&quot; x &quot;da área (pixels)&quot;). Esta é a intensidade de fluorescência do trombo plaquetário. </li><li> Para quantificar os neutrófilos rolantes e aderente, desempenham o lapso de tempo e contar o número de células que visivelmente rolam ao longo dos trombos de plaquetas durante 20 min. Rolamento é definido como uma diminuição na velocidade dos neutrófilos ao interagir com o trombo de plaquetas durante pelo menos 2 segundos. Neutrófilos aderentes são definidos como quaisquer neutrófilos que permanecem ligados às trombo plaquetário durante pelo menos 2 min. O número de neutrófilos rolantes e aderente foi apresentada como o número de células por 20 min. Velocidade de rolamento foi calculado usando um sistema de rastreamento de partículas. </li></ol>

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<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+isomerase+capture+during+thrombus+formation+in+vivo+depends+on+the+presence+of+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins.</a> Blood. 120, 647-655 (2012).</li>
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<li>Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+imaging+of+platelets%2C+tissue+factor+and+fibrin+during+arterial+thrombus+formation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse.</a> Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).</li>
<li>Barthel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+1%2C3+fucosyltransferases+are+master+regulators+of+prostate+cancer+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).</li>
<li>Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule%3A+more+than+a+carcinoma+marker+and+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule.</a> The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li>
<li>Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+multiple+functions+of+Gr-1%28%2B%29+cell+subpopulations+during+microbial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection.</a> Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram que não há interesse competindo financeira.

Aqui nós descrevemos um protocolo detalhado em tempo real a microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e trombose. Anteriormente, semelhantes de fluorescência abordagens microscópicas foram relatados para estudar o mecanismo molecular da formação de trombos e de inflamação vascular. 8,12 Uma vez que a interacção célula-célula heterotípica pode ser importante para a vaso-oclusão no local da lesão...

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>0,9% NaCl solução salina</td><td>Hospira</td><td>0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Hospira</td><td>0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Lloyd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intramedic Tubing (PE 90)</td> <td>BD Diagnostics</td><td>427421</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic Tubing (PE 10)</td> <td>BD Diagnostics</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Murine TNF-&alpha;</td><td>R& D Systems</td><td>410-MT</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488 anticorpo anti-camundongo CD42b marcado com rato </td><td>Emfret Analytics</td><td>X488</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-camundongo conjugado Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>NESLAB EX banho-maria/circulador</td><td>Microscópio Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX61W</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH4-100 Controlador de</td> estágio Power <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPC-200 multi-manipulador</td> Controlador de palco <td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R&#8211;-200</td><td>Câmera</td> de alta velocidade Sutter <td></td><td></td></tr><tr><td>C9300</td> Intensificador de Vídeo <td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scope International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ablation Laser</td><td>Instrumentos Fotônicos, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 5.0</td><td>Inovações</td><td></td><td></td> em imagens inteligentes</tr></tbody></table>

imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interacção de plaquetas e leucócitos activados (sobretudo neutrófilos) no endotélio activado trombose e medeia a inflamação vascular. 1,2 Durante a formação do trombo no sítio da lesão arteriolar, plaquetas aderentes ao endotélio activado e proteínas da matriz subendotelial suporte de rolamento dos neutrófilos e adesão 3. Por outro lado, sob condições inflamatórias venulares, os neutrófilos aderentes ao endotélio activado pode suportar a adesão e acumulação de plaquetas circulantes. Agregação de plaquetas de neutrófilos heterotípica requer processos sequenciais pelas interacções específicas do receptor de contra-receptor entre as células. 4 Sabe-se que células endoteliais activadas libertar as moléculas de adesão, tais como o factor de von Willebrand, iniciando assim a adesão de plaquetas e acumulação sob condições de alto cisalhamento. 5 Além disso, células endoteliais ativadas apoiar rolamento e adesão de neutrófilos por selectinas expressando umad molécula-1 de adesão intercelular (ICAM-1), respectivamente, sob condições de baixo cisalhamento. Platelet 4 P-selectina interage com os neutrófilos a P-selectina glicoproteína ligando-1 (PSGL-1), induzindo deste modo a activação de neutrófilos β2 integrinas e firmes a adesão entre dois tipos de células. Apesar dos avanços nas experiências in vitro em que heterotípicas plaquetas de neutrófilos interacções são determinados em sangue completo ou células isoladas, 6,7 desses estudos não é possível manipular as condições de stress oxidante durante a doença vascular. Neste relatório, utilizando fluorescentemente marcados, os anticorpos específicos contra um rato de plaquetas e neutrófilos marcador, nós descrevemos um protocolo detalhado microscópica intravital para monitorar interacções heterotípicas de plaquetas e neutrófilos no endotélio activado durante TNF-α induzida por inflamação ou seguindo induzida por laser lesão no músculo cremaster microvasos de camundongos vivos.

Usando a análise de microscopia intravital detalhada, heterotípicas plaquetas de neutrófilos interações no endotélio activado foram visualizadas por infusão de anticorpos marcados com fluorescência contra uma plaqueta (CD42c) ou marcador de neutrófilos (Gr-1) em murganhos vivos. Em um modelo de TNF-α induzida por inflamação venular, neutrófilos rolantes foram estavelmente mais aderido ao endotélio, presumivelmente através da interacção de β2 integrinas activadas com ICAM-1 durante o período ...

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

O objetivo geral do seguinte experimento é visualizar a interação típica entre plaquetas e neutrófilos sobre o endotélio ativado durante doenças vasculares. Isso é conseguido por meio de microscopia intravital de fluorescência em tempo real em camundongos vivos para visualizar a microvasculatura dentro do músculo cremaster. Como segundo passo, são infundidos anticorpos marcados com fluorescência e é induzida inflamação ou lesão local para facilitar a visualização direta das interações típicas entre plaquetas e neutrófilos resultantes.Em seguida, os dados salvos são analisados para quantificar o número de células e sua dinâmica. Em última instância, as interações típicas diretas entre plaquetas e neutrófilos no endotélio ativado podem ser avaliadas com base no sinal fluorescente dos anticorpos infundidos, por meio de microscopia intravital em tempo real. Nossa técnica de microscopia intravital pode fornecer informações sobre as interações em tempo real entre plaquetas e neutrófilos no endotélio ativado durante a inflamação vascular e a formação de trombos.Essa tecnologia também pode ser aplicada a outros sistemas, como a avaliação das interações entre células cancerígenas e células sanguíneas. Antes de iniciar o experimento, ligue o sistema de microscopia para o modelo de inflamação vascular. Realize a injeção intravital de TNF alfa três horas antes da injeção intraperitoneal de anestésicos.Uma vez que a sedação tenha sido confirmada pelo teste de preensão do dedo, canule um tubo PE 90 na traqueia do camundongo para eliminar quaisquer dificuldades respiratórias. Em seguida, canule um tubo PE 10 na veia jugular esquerda para infusão de anticorpos marcados com fluoróforo e anestésicos adicionais. Depois, retire suavemente e faça uma incisão horizontal na pele escrotal e irrigue com solução tampão pré-aquecida sobre o campo cirúrgico.Agora, pressionando o abdômen inferior com uma pinça, retire cuidadosamente um testículo com a outra pinça, posicione o músculo car master verticalmente e aplane o músculo sobre uma lamínula de vidro em uma bandeja de microscópio intra-vial, fixando o tecido periférico à bandeja. Inicie este passo infundindo primeiro DITE 4 88 conjugado com rato, anti-murino CD 42 C e Alexa Floor 6 47 conjugado com anti-murino GR um anticorpos através da cânula jugular previamente posicionada. Em seguida, no conjunto de filtros do microscópio, marque a caixa de seleção para os canais que serão expostos e defina o tempo de exposição para cada captura selecionada com intervalo de tempo.Defina o número de pontos de tempo entre 1000 e 1500, com um intervalo de 200 milissegundos, para um tempo total decorrido de cinco minutos. Após todos os parâmetros terem sido definidos na captura de imagem, selecione iniciar para começar a captura com uma ampliação de 60 x, utilizando uma janela de 157 micrômetros por 118 micrômetros. Monitore a adesão e o recrutamento de plaquetas aos neutrófilos durante cinco minutos na metade superior de um vaso cremaster inflamado.Para analisar a formação do trombo plaquetário, vá até máscara e selecione criar. Em seguida, no menu da ferramenta de seleção retangular na janela principal, clique no ícone do lápis grande. Use o lápis para colorir uma região fora do vaso na janela principal.Para definir uma máscara de fundo, vá até máscara, clique em copiar este plano, clique em copiar máscara. No ponto de tempo atual, selecione todos os pontos de tempo e clique em ok. Para calcular o sinal de fundo, vá até estatísticas e clique em estatísticas da máscara.Em seguida, no escopo da imagem, clique na sequência temporal 2D atual ou em imagens quatro D no escopo da máscara, selecione toda a máscara nas características. Em data de captura, selecione o tempo decorrido. Em geometria morfológica, selecione área em pixels e em intensidade selecione intensidade máxima.Agora clique em exportar. Abra o arquivo de texto em um programa de planilha eletrônica e calcule o valor médio do sinal de fundo ao longo do período de gravação. Para determinar a intensidade da fluorescência de fundo.Após calcular a intensidade da fluorescência de fundo durante o trombo plaquetário conforme demonstrado no modelo de inflamação ular, vá até máscara, clique em segmentar, selecione ajuste e, selecione o canal e insira o valor médio do sinal de fundo em baixo clique em aplicar e em ok. Em seguida, vá até estatísticas e clique em estatísticas da máscara. Agora, no escopo da imagem, clique na sequência temporal 2D atual ou em imagens 4D no escopo da máscara, selecione toda a máscara em recursos, em data de captura selecione tempo decorrido, em morfogeometria selecione área em pixels e em intensidade, selecione intensidade total.Em seguida, clique em exportar. Abra o arquivo de texto no programa de planilha e calcule a intensidade de fluorescência do trombo plaquetário. Para analisar a trombose arteriolar, comece infundindo os anticorpos anti-rato CD 42 conjugados com DITE 4 88 e anti-rato GR um conjugados com ANDOR 6 47, conforme acabou de ser demonstrado.Após clicar em iniciar para iniciar o processo de captura de imagem, clique duas vezes em um ponto a dois ou três micrômetros internamente da parede do vaso para disparar o laser. A lesão das células endoteliais arteriolares provoca uma alteração visual na forma, que deve ser aparente na imagem de campo claro, seguida pelo acúmulo de plaquetas. Cinco minutos após a lesão a laser, pause e cancele a captura.Posteriormente, inicie uma captura com 2.400 pontos de tempo com intervalo de 500 milissegundos para registrar as plaquetas aderidas e os neutrófilos rolantes e aderidos durante 20 minutos. Após calcular a intensidade de fluorescência de fundo durante o trombo plaquetário de maneira semelhante ao modelo de inflamação ular, vá até máscara, clique em segmentar, selecione fite e canal e insira o valor médio do sinal de fundo em baixo, clique em aplicar e em ok. Agora, no escopo da imagem, clique em sequência temporal 2D atual ou imagens 40D no escopo da máscara, selecione toda a máscara em recursos, em dados de captura selecione o tempo decorrido, em Morfo selecione área em pixels e em intensidade, selecione alguma intensidade.Em seguida, clique em exportar. Abra o arquivo de texto no programa de planilha e calcule a intensidade de fluorescência do trombo plaquetário. Para quantificar os neutrófilos em rolamento e aderidos, reproduza o lapso de tempo e conte o número de células que rolam visivelmente sobre a superfície.O trombo plaquetário durante 20 minutos de rolamento é definido como uma diminuição na velocidade dos neutrófilos enquanto interagem com o trombo plaquetário por pelo menos dois segundos. Neutrófilos aderidos são definidos como quaisquer neutrófilos que permaneçam ligados ao trombo plaquetário por pelo menos dois minutos. Aqui, imagens representativas da aparência dos sinais fluorescentes associados aos neutrófilos em vermelho e plaquetas em verde.É mostrada uma inflamação vascular, sendo a seta que indica a direção do fluxo sanguíneo no vaso. O número de neutrófilos rolantes e aderentes em células endoteliais inflamadas foi determinado como 0,25 células por minuto e 18,5 células a cada cinco minutos, respectivamente. Os dados são representativos da média mais ou menos o erro padrão da média de 30 Es diferentes em quatro camundongos selvagens.Aqui, o sinal fluorescente integrado mediano das plaquetas é representado graficamente em função do tempo. Verificou-se que a maioria das plaquetas em vermelho adere aos neutrófilos aderentes e rastejantes em verde, em vez de aderir à parede do vaso inflamado. Agora, avançando para as interações entre plaquetas e neutrófilos após lesão arteriolar induzida por laser.Essas imagens ilustram um único neutrófilo em vermelho, indicado pela seta amarela, rolamento sobre o trombo plaquetário em verde, com um segundo neutrófilo em vermelho, indicado pela seta branca, rolamento rapidamente sobre as células endoteliais arteriolares, ambos durante um intervalo de captura de cinco segundos; aqui, um único neutrófilo novamente em vermelho é mostrado rolamento sobre e aderindo a um trombo plaquetário em verde ao longo de um intervalo de 15 segundos. A ponta da seta identifica os neutrófilos em rolamento e aderidos, e a seta cinza grossa indica a direção do fluxo sanguíneo. Aqui, o sinal fluorescente integrado mediano das plaquetas é representado graficamente em função do tempo.O número de neutrófilos rolantes e aderentes foi determinado como 21,5 e 1,6 células ao longo de 20 minutos, respectivamente. O rolamento rápido inicial dos neutrófilos ocorreu sobre as células endoteliais. Assim que os neutrófilos entraram em contato com o trombo plaquetário, a velocidade de rolamento dos neutrófilos sobre o trombo plaquetário foi alterada, com uma faixa de 8,2 micrômetros por segundo, sendo mediada pela interação entre pectina e PSGL-1.Os dados são representativos da média mais ou menos o erro padrão da média de 14 trombos diferentes em sete camundongos selvagens cinco minutos após a lesão a laser. O tamanho do trombo plaquetário permanece relativamente constante durante a aquisição de imagens, e os neutrófilos rolam e aderem ao trombo. O sinal fluorescente proveniente das plaquetas circulantes é desprezível.Em comparação com o coágulo plaquetário, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como configurar o sistema de microscopia intravital com camundongos vivos, permitindo visualizar em tempo real as interações heterotípicas entre plaquetas e neutrófilos sobre o endotélio ativado dentro da microvasculatura.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Microfluídica na avaliação da função plaquetária

Aprenda a visualizar interações plaqueta-neutrófilo em tempo real sobre o endotélio ativado durante inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos usando microscopia intravital.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos (Vídeo) | JoVE Journal

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

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