Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar a interação típica entre plaquetas e neutrófilos no endotélio ativado durante a doença vascular. Isso é obtido por microscopia intravital de fluorescência em tempo real em camundongos vivos para visualizar a microvasculatura dentro do músculo cremaster. Como segunda etapa, anticorpos marcados com fluorescência são infundidos e inflamação ou lesão ular é iniciada para facilitar a visualização direta das interações típicas de neutrófilos plaquetários resultantes.

Em seguida, os dados salvos são analisados para quantificar o número de células e sua dinâmica. Em última análise, as interações típicas diretas entre plaquetas e neutrófilos no endotélio ativado podem ser avaliadas com base no sinal fluorescente dos anticorpos infundidos em microscopia intravital em tempo real. Nossa técnica microscópica intravital pode fornecer informações sobre as interações em tempo real entre plaquetas e neutrófilos no endotélio ativado durante a inflamação vascular e a formação de trombos.

Essa tecnologia também pode ser aplicada a outros sistemas, como avaliar as interações de células cancerígenas e células sanguíneas. Antes de iniciar o experimento, ligue o sistema de microscópio para o modelo de inflamação vascular. Injeção intra growly espelhando TNF alfa três horas antes da injeção IP de anestésicos.

Uma vez que a sedação tenha sido confirmada por pinça do dedo do pé, canule um tubo PE 90 na traqueia do camundongo para eliminar quaisquer dificuldades respiratórias. Em seguida, canule um tubo PE 10 na veia jugular esquerda para a infusão de anticorpos marcados com fluorescência e anestésicos adicionais. Em seguida, puxe suavemente e inci horizontalmente a pele escrotal e use tampão pré-aquecido sobre o campo cirúrgico.

Agora, pressionando a parte inferior do abdômen com uma pinça, puxe cuidadosamente um testículo com a outra pinça de tamanho, o músculo mestre do carro verticalmente e alise o músculo sobre uma lamínula de vidro em uma bandeja de microscópio intra-frasco, prendendo o tecido periférico à bandeja. Comece esta etapa infundindo primeiro os anticorpos anti camundongo GR um conjugados DITE 4 88 rat, anti mouse CD 42 C e Alexa floor 6 47 conjugado anti mouse GR one através da cânula jugular previamente definida. Em seguida, no conjunto de filtros do microscópio, marque a caixa de seleção dos canais que serão expostos e defina o tempo de exposição para cada captura de lapso de tempo selecionada.

Para definir o número de pontos de tempo como 1000 a 1500 com um intervalo de 200 milissegundos para um tempo total decorrido de cinco minutos. Depois que todos os parâmetros tiverem sido definidos na captura de imagem, selecione iniciar para iniciar a captura com uma ampliação de 60 x com uma janela de 157 micrômetros por 118 micrômetros. Monitore as plaquetas dominantes e aderentes em neutrófilos por cinco minutos na metade superior de um local de cremaster inflamado.

Para analisar a formação de trombos plaquetários, vá para mascarar e selecione criar. Em seguida, na ferramenta letreiro na visualização principal, clique no ícone de lápis grande. Use o lápis para colorir uma região fora do recipiente na vista principal.

Para definir uma máscara de fundo, vá para máscara, clique em copiar este plano, clique em copiar máscara. No ponto de tempo atual, selecione todos os pontos de tempo e clique em OK. Para calcular o sinal de fundo, vá para estatísticas e clique em mascarar estatísticas.

Em seguida, no escopo da imagem, clique em lapso de tempo 2D atual ou em quatro imagens D no escopo da máscara, selecione a máscara inteira nos recursos. Em data de captura, selecione o tempo decorrido. Em geometria de transformação, selecione a área em pixels e, em intensidade, selecione a intensidade máxima.

Agora clique em exportar. Abra o arquivo de texto em um programa de planilha e calcule o valor médio do sinal de fundo durante todo o período de gravação. Para determinar a intensidade da fluorescência de fundo.

Depois de calcular a intensidade da fluorescência de fundo durante o trombo plaquetário, conforme demonstrado no modelo de inflamação ular, vá para mascarar, clique no segmento, selecione ajustar e canal e insira o valor médio do sinal de fundo no clique baixo aplicar e ok. Em seguida, vá para estatísticas e clique em mascarar estatísticas. Agora, no escopo da imagem, clique em lapso de tempo 2D atual ou quatro imagens D no escopo da máscara, selecione a máscara inteira em recursos em data de captura, selecione o tempo decorrido em geometria de transformação, selecione a área em pixels e em intensidade, selecione alguma intensidade.

Em seguida, clique em exportar. Abra o arquivo de texto no programa de planilha e calcule a intensidade de fluorescência do trombo plaquetário. Para analisar a trombose arteriolar, comece infundindo anticorpos anti-camundongo conjugado DITE 4 88 CD 42 C ANDOR 6 47 anti-camundongo conjugado GR one, conforme demonstrado.

Depois de clicar em iniciar para iniciar o processo de captura de imagem, clique duas vezes em um ponto de dois a três micrômetros internamente da parede do vaso para disparar o laser. A lesão das células endoteliais arteriolares causa uma mudança de forma visual que deve ser aparente na imagem de campo claro seguida de acúmulo de plaquetas. Cinco minutos após a lesão do laser, pause e cancele a captura.

Em seguida, inicie uma captura com 2.400 pontos de tempo com um intervalo de 500 milissegundos para registrar as plaquetas aderentes e os neutrófilos rolantes e aderentes por 20 minutos. Depois de calcular a intensidade da fluorescência de fundo durante o trombo plaquetário de maneira semelhante ao modelo de inflamação ular, vá para mascarar, clique no segmento, selecione fite e canal e insira o valor médio do sinal de fundo no clique baixo aplicar e ok. Agora, no escopo da imagem, clique em lapso de tempo 2D atual ou imagens 40 D no escopo da máscara, selecione a máscara inteira em recursos em data de captura, selecione o tempo decorrido em Morpho, selecione a área em pixels e em intensidade, selecione alguma intensidade.

Em seguida, clique em exportar. Abra o arquivo de texto no programa de planilha e calcule a intensidade de fluorescência do trombo plaquetário. Para quantificar os neutrófilos rolantes e aderentes, reproduza o lapso de tempo e conte o número de células que rolam visivelmente.

O trombo plaquetário ao longo de 20 minutos é definido como uma diminuição na velocidade dos neutrófilos enquanto interage com o trombo plaquetário por pelo menos dois segundos. Os neutrófilos aderentes são definidos como quaisquer neutrófilos que permanecem ligados ao trombo plaquetário por pelo menos dois minutos. Aqui, imagens representativas do aparecimento de sinais fluorescentes associados a neutrófilos em vermelho e plaquetas em verde.

Durante a inflamação ular é mostrada, a seta mostra a direção do fluxo sanguíneo no vaso. O número de neutrófilos rolantes e aderentes nas células endoteliais inflamadas foi determinado em 0,25 células por minuto e 18,5 células por cinco minutos, respectivamente. Os dados são representativos da média mais ou menos o erro padrão da média de 30 Es diferentes em quatro camundongos do tipo selvagem.

Aqui, o sinal fluorescente integrado mediano das plaquetas é plotado em função do tempo. Verificou-se que a maioria das plaquetas em vermelho adere aos neutrófilos aderentes e rastejantes em verde, e não à parede do vaso inflamado. Agora passando para as interações plaquetárias de neutrófilos após lesão arteriolar induzida por laser.

Essas imagens ilustram um único neutrófilo em vermelho e indicado com a seta amarela rolando sobre o trombo plaquetário em verde com um segundo neutrófilo em vermelho e indicado pela seta branca rolando rapidamente sobre as células endoteliais arteriolares, ambos em um intervalo de captura de cinco segundos aqui, um único neutrófilo novamente em vermelho é mostrado rolando e aderindo a um trombo plaquetário em verde durante um intervalo de 15 segundos. A ponta da seta identifica os neutrófilos rolantes e aderentes e a seta cinza grossa indica a direção do fluxo sanguíneo. Aqui, o sinal fluorescente integrado mediano das plaquetas é plotado em função do tempo.

O número de neutrófilos rolantes e aderentes foi determinado em 21,5 e 1,6 células em 20 minutos, respectivamente. O rolamento rápido inicial dos neutrófilos ocorreu nas células endoteliais. Uma vez que os neutrófilos entraram em contato com o trombo plaquetário, a velocidade de rolamento dos neutrófilos no trombo plaquetário foi alterada com um alcance de 8,2 micrômetros por segundo e é mediada pela interação da pectina e psgl L um.

Os dados são representativos da média mais ou menos, o erro padrão da média de 14 trombos diferentes em sete camundongos selvagens cinco minutos após a lesão por laser. O tamanho do trombo plaquetário permanece relativamente constante durante a imagem, e os neutrófilos rolam e aderem ao trombo. O sinal fluorescente das plaquetas circulantes é insignificante.

Em comparação com o do trombo plaquetário, Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar o sistema de microscópio intravital com camundongos vivos, permitindo visualizar em tempo real as interações heterotípicas entre plaquetas e neutrófilos no endotélio ativado dentro da microvasculatura.