Name: Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprenda a isolar mitocôndrias de biópsia percutânea de músculo esquelético para análise respirométrica. Este método requer apenas 20 mg de tecido, reduzindo variabilidade entre experimentos e sendo ideal para pesquisa clínica.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Marc Liesa, da Escola de Medicina da Universidade de Boston, discussões úteis; Sra. Karin Murphy, Sra. Heather Gregory e Sr. John Stone, todos da Wake Forest School of Medicine, pela assistência técnica útil no desenvolvimento deste protocolo.

NOTA: O protocolo descrito foi aprovado pelo Comitê de Wake Forest School of Medicine Institucional. Foi obtido consentimento informado por escrito. Todos os participantes eram idosos saudáveis ​​(65-79 anos) de ambos os sexos, com IMC variando 23-35. 1. Skeletal biópsia muscular <ol><li> Como descrito anteriormente, 9 executar todas as biópsias no início da manhã após um O / N rápido. Pergunte aos indivíduos que se abstenha de tomar aspirina, prescrição e over-the-counter medicamentos anti-inflamatórios não esteróides, ou outros compostos que podem afetar o sangramento, plaquetas, ou nódoas negras para a semana antes da biópsia. Peça aos participantes que também abster-se de qualquer atividade extenuante durante pelo menos 36 horas antes da biópsia. NOTA: O músculo é obtido a partir do músculo vasto lateral utilizando a técnica de biópsia percutânea agulha com uma agulha percutânea sob anestesia local com lidocaína a 1%. Não houve complicações médicas ou other relatados eventos adversos decorrentes do procedimento ocorreram em nossa unidade de pesquisa clínica. </li><li> NOTA: O procedimento de biópsia descrito é uma adaptação do que de Bergstrom 10. <ol><li> Resumidamente, localmente administrar lidocaína a 1% tomando cuidado para não se infiltrar no músculo. Siga este com um período de espera de 10 min para permitir entorpecente suficiente. </li><li> Tome as biópsias do ventre do músculo (a região média do músculo entre a inserção e origem) evitando áreas subfascial e myotendonous. <ol><li> Use agulha percutânea (a sucção assistida dispositivo reutilizável com um lado da janela e cilindro de corte interior de corte) e seguir uma fascial &quot;pop&quot; ou resistência da fáscia como um guia. </li><li> Estimar a profundidade com a agulha de anestesia, em seguida, novamente senti-lo com a lâmina de bisturi estreito e fazer uma incisão de 4-5 mm através da fáscia. Avançar a agulha através da incisão até que ele é inserido no músculo. </li><li> Coletarmúltiplas amostras com a janela virado em direcções diferentes. Aplicar sucção contínua, usando uma seringa de 60 cc, enquanto avança e retirando amostras do músculo para dentro da agulha percutânea duas a quatro vezes em diferentes direcções. Interrompa a sucção e remover a agulha. NOTA: Cada pass (inserção e remoção de agulha) deve levar menos de um minuto. </li><li> Peça a um assistente aplicar uma pressão firme para perfurar local por 5 min para estabelecer hemostasia. Desconecte agulha do tubo de sucção e remova cuidadosamente amostras de músculo da janela e barril. </li></ol></li><li> Adicione uma segunda passagem, se é necessário mais do músculo através da repetição do procedimento acima. </li><li> Remova todos os coágulos sanguíneos visíveis a partir da amostra de músculo usando uma pinça, pesar a amostra, e coloque imediatamente em um tubo contendo DPBS geladas. NOTA: O rendimento médio utilizando esta metodologia é de 150 ± 20 mg. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento mitocondrial &lt;ol&gt; <li> Recém preparar o Chappel-Perry (CP) e mitocondrial Solution Assay (MAS) buffers (Tabela 1) no dia do experimento, ou alíquota e armazená-los a -20 ° C. Preparar os compostos em dimetilsulfóxido a uma concentração de 2,5 mM e alíquotas e armazenar a -20 ° C. Use as alíquotas de tampão e compostos armazenados a -20 ° C dentro de 2 meses a partir da data de preparação. </li><li> Remover o tecido conjuntivo visível a partir da amostra, utilizando tesouras e pinças; se necessário o uso de um microscópio de dissecação para este passo. Lave cuidadosamente as amostras 3-4 vezes com tampão de DPBS gelada para remover o sangue. Mantenha as amostras em DPBS e processo geladas mais rapidamente possível, tomando cuidado para não exceder mais de 45 min a partir de biópsia. Tenha cuidado para remover cuidadosamente quaisquer tendões ou tecido adiposo a partir da amostra do músculo. </li><li> Imediatamente cortar o tecido muscular em pedaços finos, usando um par de tesouras estéril e suspender em 500 mL de 1 ml contendo CPI proteinase (Nagarse) a uma concentração de 0,2 mg / g de tecido. Siga este com a 5 min de incubação à temperatura ambiente e depois transferir para gelo. </li><li> Homogeneizar os tecidos picados tratados com Nagarse usando um homogeneizador automatizado. Manter a amostra em gelo durante todo este processo. Homogeneizar cada amostra de tecido quatro vezes, cada vez por um pulso de 2 segundos, usando o homogeneizador automatizado com uma definição de velocidade de 10.000 rpm. Lava-se a sonda com etanol a 70%, seguido por água destilada entre tecidos. </li><li> Lavar o tecido homogeneizado com um volume igual de CP I (500 ul a 1 ml) e volume de 2x CP II (1 ml para 2 ml), e recolher o conteúdo num tubo de centrífuga e centrifugar a 600 xg, a 4 ° C durante 10 min. Passar o sobrenadante através de um pano de queijo humedecido, recolher o filtrado e descartar o sedimento, removendo assim a maioria das fracções não mitocondriais. </li></ol> 3. Lavar o mitocôndrias <ol><li> Centrifugar o sobrenadante do passo anterior a 10,000 xg, a 4 ° C durante 10 min. Suspender o sedimento em 4 ml de tampão CP II e ainda de centrifugação a 10.000 xg, a 4 ° C durante 10 min. NOTA: Em raras ocasiões, um sedimento fino de sangue é formado abaixo do pellet mitocondrial. Nesse caso, retire o sedimento mitocondrial por aspiração suave com tampão CPII. Este passo pode ser evitado por lavagem para retirar completamente sangue no passo 2. </li><li> Suspender o pellet obtido em 2 ml de tampão CP eu. Nesta fase utilizar uma pequena alíquota de suspensão para esta estimativa proteína. Ressuspender o restante da amostra em tampão CP I e centrifuga-se como acima. Suspender o sedimento final em uma quantidade mínima (200 ul) de Ensaio Solução mitocondrial (MAS). NOTA: As proteínas são ensaiadas nesta fase devido tampão CP não tem BSA, enquanto que MAS em que as amostras serão posteriormente suspenso BSA tem nele. </li></ol> 4. Estimar o conteúdo mitocondrial por medir a concentração de proteína utilizando um kit de ensaio BCA Protein <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: Utilize este concentração para calcular a quantidade de mitocôndrias utilizados para carregamento para uma microplaca de 24 poços para medições respirométricos, ou para experimentos de Western blot. Leve em conta o fator de diluição (10) para o cálculo da concentração de proteína. 5. Realizar os ensaios XF como descrito por Rogers, GW, et ai. 12 NOTA: visualize a taxa de consumo de O 2 (OCR) em pMoles O 2 / min, ou os níveis absolutos de O 2 e pH na saída de dados. <ol><li> Use 1x MAS para preparar os compostos a ser injectado. Adicionar uma concentração dos compostos para o AD 10x portas para dar uma concentração final como se segue: Uma porta, ADP [-diphosphate Adenosina 5 &#39;, 2 mM, 50 ul]; porto B, oligomicina (2 mM, 55 mL); porta C, FCCP [cianeto de 4- (trifluorometoxi) fenil-hidrazona carbonilo, 6 uM, 60 ul]; e porta D, 2 uM antimicina-A (65 uL). Prepararvolume suficiente de compostos para o número necessário de poços. </li><li> Determinar a quantidade óptima de mitocôndrias por titulação. Por exemplo, carga de 1,0 ug, 2,5 ug e 5,0 ug de mitocôndrias por poço num volume de 50 ul de 1x MAS geladas contendo substrato. Para minimizar a variabilidade entre os poços, primeiro diluir 10x mitocôndrias em substrato frio 1x MAS +. Em seguida, entregar 50 ul desta suspensão a cada poço (excepto os poços de correcção de fundo). </li><li> Centrifugar a placa a 2000 x g, 20 min a 4 ° C. Após a centrifugação, adiciona suavemente 450 ul de 1x MAS + succinato (10 mM) e rotenona (2 uM) (condições iniciais; ver abaixo) a cada poço. Ver as mitocôndrias sob o microscópio para assegurar a aderência homogénea, para o bem antes de transferir a placa para o analisador XF. NOTA: As condições iniciais utilizados irá depender do facto de a respiração é accionado por I ou II complexo complexo ETC. Para complexo respiração impulsionado-II, use succinate (10 mM) e rotenona (2 uM) como condições iniciais. Rotenona complexo blocos I e succinato fornece combustível para o complexo II (succinato-desidrogenase). Para estudar a respiração impulsionado por complexo I, ou utilizar piruvato e malato, cada um a uma concentração final de 5 mM ou glutamato e malato cada um a uma concentração final de 10 mM como condições iniciais. Este último pode ajudar na distinção entre disfunção ciclo do ácido tricarboxílico e transporte de substrato. Para estudar a respiração impulsionado por ambos I complexo e complexo II, incluem piruvato e succinato sem rotenone ou malato como condições iniciais. Use palmitoil carnitina como um substrato para β-oxidação. </li><li> Sequencialmente medir a respiração mitocondrial em tempo real usando o respirômetro, programando-o como descrito anteriormente 12. Use as configurações para o respirômetro apresentados na Tabela 2. NOTA: Uma breve explicação de vários estados respiração mitocondrial são os seguintes: </li><li&gt; State 2 = estado juntamente com substrato presente; Estado 3 = fosforilantes respiração na presença de saturar ADP; Estado 4 o = respiração não fosforilar induzida por oligomicina; 3U State = máxima respiração desacoplada estimulada pela FCCP desacoplador; Residual não mitocondrial respiração = respiração após complexo III inibição por antimicina-A. Deve também salientar-se que, o comprimento da medição OCR em combinação com a concentração mitocondrial poderia influenciar os dados através da redução de oxigénio durante os períodos de medição. </li></ol> 6. Transferência de Western NOTA: Determine o marcador mitocondrial COX IV e GAPDH tecido inteiro por Western blot para assegurar o enriquecimento de mitocôndrias na amostra final <ol><li> Separe o mitocôndrias isoladas e extrato de tecido inteiro por 12% de sódio dodecil sulfato de géis de poliacrilamida. </li><li> Transferem-se as proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF).</li><li> Incubar com anticorpo de COX IV (1: 20.000), seguido de peroxidase de rábano (HRP) conjugado a anticorpos secundários. Por determinação GAPDH, tira o blot e sonda com um anticorpo monoclonal GAPDH (1: 2.000). NOTA: Se as diferenças de contaminação ER são motivo de preocupação, incluem marcadores ER como ERp72, calnexin, ou calreticulina na análise. </li></ol>

<ol><li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li>
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<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317(2011).</li>
</ol>

O autor, George Rogers, é funcionário da Seahorse Bioscience que produz o instrumento usado neste artigo. As taxas de acesso aberto foram apoiadas pela Seahorse Biosciences.

Mitocôndrias isoladas são muitas vezes utilizados em estudos que examinam o papel da função ETC, bem como outras atividades mitocondriais, incluindo o transporte de substrato e função ciclo TCA. Ensaios respirométricos usando organelas isoladas permitir uma análise direta dos processos básicos de fosforilação oxidativa e propriedades intrínsecas da ETC. Respirométricos perfis de mitocôndrias isoladas, em comparação com células completas ou permeabilizadas fibras musculares tem as vantagens de interpretação de dados relativamente fácil e a ausência de &quot;interferência&quot; de processos não-mitocondriais ou alterações na massa mitocondrial / biogénese. A normalização dos dados baseia-se no teor de proteína mitocondrial, permitindo desse modo simples comparação cruzada entre as amostras de mitocôndrias. Profiling respirômetro de mitocôndrias isoladas é uma abordagem preferida quando o objetivo do estudo é determinar os mecanismos subjacentes e identificação de alvos específicos, como componente ETCs / complexos, ou mecanismos de transporte mitocondrial. Descreve-se um protocolo para a biópsia do músculo e isolamento das mitocôndrias funcionais a partir de pequenas amostras de tecido. Este método produz resultados reproduzíveis entre os usuários, devido à utilização de um homogeneizador automatizado contra mão operada homogeneizadores DOUNCE. Isolamento de mitocôndrias pode ser realizada com menos de 20 mg de tecido muscular. A quantidade de mitocôndrias isoladas que podem ser obtidas a partir deste tamanho da amostra é suficiente para executar marinho respirometria à base de placa, deixando as mitocôndrias excedentes para outras experiências e de armazenamento para outras análises moleculares. Pode notar-se que este método pode ser traduzido para o XF 96, onde mesmo quantidades menores de mitocôndrias pode ser usado (1-2 ug por poço). Vários protocolos para isolamento de mitocôndrias confiar em homogeneizadores Dounce para ruptura de tecido inicial. A desvantagem deste método é o hands-on da natureza do tecido inicialhomogeneização. A força ea velocidade do pilão no homogeneizador pode variar significativamente entre os operadores 6. Isto pode resultar na variação da experiência para experiência, assim como a variação de laboratório para laboratório, e conduz a dificuldade de se comparar dados entre experiências. Isto é de particular preocupação em estudos de intervenção humana quando os dados dos participantes são coletadas em momentos distintos, tipicamente antes e após o tratamento, e, potencialmente, em múltiplos locais. Nós usamos um homogeneizador automatizado para uma abordagem mais coerente que produz resultados mais reprodutíveis com variação limitada de pessoa a pessoa. A velocidade de preparação também torna esta abordagem adequada para o tratamento de várias amostras ao mesmo tempo. Tipicamente, até três experiências podem ser realizadas num único dia. Limitações potenciais da técnica descrita aqui surgem a partir da utilização de organelos isolados e a utilização de um formato de placa de base. Por exemplo, Picard et al. tem demôniostrated que mitocôndrias isoladas possuem características funcionais que diferem fundamentalmente daqueles de mitocôndrias intactas em myofibers permeabilizadas. Propuseram que técnicas de isolamento mitocondriais resultar em função alterada bioenergética, tais como um aumento significativo em comparação com RCR miofibras permeabilizadas acompanhadas por uma maior produção de espécies reactivas de oxigénio 13. Em comparação com as fibras musculares permeabilizadas, isolamento de mitocôndrias não requerem mais tempo de preparação. Além disso, a perda de conteúdo celular diminui relevância fisiológica, algo que é retida em células inteiras e mesmo as fibras permeabilizadas. O uso de respirometria à base de placa com as licenças técnica descrita replicar ensaios por amostra. No entanto, as mitocôndrias deve aderir ao fundo de cada poço. Esta configuração é diferente do seu ambiente normal e pode afectar as características funcionais. Além disso, deve notar-se que a utilização deste protocolo para o isolamento mitocondrial terap,e podem ainda ser a contaminação do retículo endoplasmático (ER) na preparação mitocondrial. As diferenças na contaminação ER podem afetar a determinação do rendimento e influenciar resultados mitocondriais. Em conclusão, o presente estudo apresenta dados que confirma que as mitocôndrias isoladas de tecidos, utilizando este procedimento são funcionalmente activo e pode ser utilizado para estudos / aplicações que requerem de elevada qualidade mitocôndrias isoladas a partir de uma quantidade mínima de amostras de músculo esquelético. A vantagem deste método é que: i) é possível isolar mitocôndrias a partir de quantidades mínimas de músculo esquelético, ii) o procedimento é rápido, iii) com a tecnologia de placa de base, é possível executar várias amostras ao mesmo tempo, e iv) há tecido excedente suficiente e mitocôndrias isoladas após o ensaio bioenergético para armazenamento de amostras e outras investigações de biologia molecular.

As mitocôndrias são as unidades de produção de energia primária na célula e têm um papel importante no envelhecimento, bem como vários distúrbios relacionados com a idade, como doença cardiovascular, doença de Alzheimer, diabetes, câncer e obesidade. Profiling respirômetro de mitocôndrias isoladas fornece análise direta da função da cadeia de transporte de elétrons (ETC) e tem contribuído significativamente para a nossa compreensão da biologia mitocondrial e seu papel na saúde e na doença. Mitocôndrias isoladas são usadas para estudar vários aspectos da bioenergética como, o transporte de substrato, atividade ATP sintase, vazamento de prótons, etc. A metodologia descrita neste manuscrito foi otimizado para permitir uma análise respirômetro de mitocôndrias isoladas de biópsias de tecido músculo esquelético obtidos a partir de seres humanos. O protocolo de biópsia descrito neste manuscrito tem sido utilizado por nossa equipe durante os últimos 12 anos. Nosso grupo já realizou mais de 700 procedimentos em adultos de várias idades,até 90 anos de idade, e com várias condições de doenças crônicas, sem quaisquer problemas de segurança adversos. Um aspecto fundamental deste protocolo é que ele é projetado especificamente para utilizar quantidades mínimas de tecido, facilitando assim a sua utilização em estudos de pesquisa clínica. Vários protocolos têm sido desenvolvidos para o isolamento de mitocôndrias. Fernandez-Vizarra et al. 1,2 descreveu um método para isolar mitocôndrias a partir de vários tecidos de rato, bem como células cultivadas. Garcia-Cazarin et al. 3 relataram um método para o isolamento de mitocôndrias de músculo esquelético de rato e ratinho. Um método para o isolamento de mitocôndrias do cérebro de ratazana foi também relatado por Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al., 5 relatado um método de isolamento de mitocôndrias utilizando o barocycler e / ou a máquina trituradora PCT. Recentemente, Franko et al. 6 relataram um método de isolamento de mitocôndrias altamente enriquecidas utilizando anticorpos anti-TOM22 Esferas magnéticas. Embora estes protocolos produzir excelentes resultados, os requisitos de tamanho do tecido são elevados em comparação com o método descrito neste manuscrito. Por exemplo, Gross et 5 al., Utilizando 1,5-1,8 g do músculo gastrocnémio, e cerca de 2 g de tecido renal. Da mesma forma, Franco et al. 6 utilizadas 500 mg de tecido de fígado de rato. Pela nossa experiência, rendimentos típicos de se esperar de percutânea agulha de biópsia do músculo esquelético (vasto lateral) variam de 100-200 mg. A capacidade de avaliar a função mitocondrial em 20-50 mg de tecido muscular utilizando o protocolo descrito aqui permite aos usuários executar múltiplas avaliações por biópsia e para armazenar amostras para uso futuro em outros experimentos de biologia molecular. Este é um elemento fundamental para a investigação clínica e de outros estudos que requerem o uso diligente das amostras. Deve notar-se que as mitocôndrias não previamente congelados são bons para estudar a respiração acoplado devido ao OUTEr dano à membrana mitocondrial e perda de atividade do citocromo C. O nosso método foi adaptado e modificado a partir do método publicado por Chappell e Perry 7. Usando os métodos descritos neste manuscrito, temos informou recentemente que o perfil respirômetro de mitocôndrias isoladas de Vastus humano lateral está diretamente relacionada com a capacidade física, medida como a velocidade de marcha 8.

<table><tbody><tr><td>Homogeneizador de Equipamentos</td><td></td> Bio-Gen PRO200 Centrífuga BioExpress <td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5804 R</td><td>Rotor tardio Deepwell da Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr>&<tr><td></td>nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Seringa Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mm University College Hospital Agulha</td><td>Cadência</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 cc</td><td>Fisher Scientific</td> Leitor de placas de 96 poços <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tecan (Genios-basic)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 24-3 analisador</td><td>Seahorse Biosciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de gel de proteína</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak Gel Logic 112</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de câmera Kodak</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consumíveis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de cultura de células XF24 V7 e cartucho de sensor XF24</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>100867-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)</td><td>Acros</td><td>12421-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate tamponado salino&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Ácido graxo livre BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase bacteriana</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P-8038</td><td></td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Magnésio cloreto (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína BCA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>PI23227</td><td></td></tr><tr><td>Ácido succínico</td>*<td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pirúvico*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Ácido málico*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>2288</td><td></td></tr><tr><td>ADP(K+ sal)*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>XF Kit de teste de estresse mito</td><td>de células Seahorse Biosciences</td><td>101706</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&nbsp;</td><td>SC-29113</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0343BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de Transferência de Immobilizina (0,45 um)</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 litro</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos primários (mAB para VDAC1/Porina)</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos primários (mAB para GAPDH)</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (cabra),</td><td>PerkinElmer</td><td>marcado com</td> HRP NEF822E001EA <td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho (cabra),</td><td>PerkinElmer</td> NEF812E001EA marcado com <td>HRP</td><td></td></tr><tr><td>*ADP, ácido succínico, ácido pirúvico e ácido málico devem ser ajustados para pH 7,4 apenas com KOH&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação e avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Profiling respirômetro de mitocôndrias isoladas é comumente usado para investigar elétron função cadeia de transporte. Descreve-se um método para obtenção de amostras de vasto lateral humanos, isolando mitocôndrias de quantidades mínimas de tecido do músculo esquelético, e a placa de base de perfis respirométricos usando um analisador de fluxo extracelular (XF). Comparação dos perfis respirométricos obtidos usando 1,0, 2,5 e 5,0 ug de mitocôndrias indicam que 1,0 ug é suficiente para medir a respiração e que 5,0 ug proporciona resultados mais consistentes com base na comparação de erros padrão. A análise de Western blot de mitocôndrias isoladas de marcador mitocondrial COX IV e não-tecido marcador mitocondrial GAPDH indicam que existe a contaminação não limitado mitocondrial usando este protocolo. A capacidade de estudar respirometria mitocondrial em menos de 20 mg de tecido muscular permite que os usuários utilizem biópsias individuais para vários desfechos do estudo em clínicaprojetos de pesquisa.

A Figura 1 descreve um fluxograma detalhado de todo o protocolo. Perfis de Western blot de COX IV / GAPDH (Figura 2) descrevem a expressão da proteína mitocondrial, COX IV, e o marcador não-mitocondrial, GAPDH. A expressão de COX tanto IV e de GAPDH são evidentes em todo o lisado muscular. Depois de mitocôndrias são isolados utilizando a técnica descrita neste protocolo, bandas COX IV ainda são evidentes, enquanto GAPDH é ausente com a mesma exposição. Exposições mais longas podem revelar uma banda GAPDH fraco. Estas manchas indicam que as mitocôndrias isoladas têm contaminação não mitocondrial mínima. Além disso, a expressão de COX IV em mitocôndrias isoladas é consistente entre as amostras. A Figura 3 mostra os perfis respirométricos típicos accionados por complexo II (succinato e rotenona), utilizando 1,0 ug, 2,5 ug e 5,0 ug de mitocôndrias. Como esperado, o OCR é aumentado geral wom maior quantidade de mitocôndrias. O índice de controlo respiratório calculado (RCR) para este ensaio é de 7,95, o que indica que a preparação mitocondrial é de alta qualidade. Além disso, 3u estado OCR é ligeiramente maior do que a do estado 3, confirmando a qualidade mitocondrial. A fim de comparar a consistência dos resultados de perfis quando diferentes quantidades de mitocôndrias, foi realizada ANOVA (análise de variância) e calculada a soma dos quadrados (SS) como valores reais da variância, utilizando 1,0 ug, 2,5 ug e 5,0 ug de mitocôndrias carregado por bem (Figura 4). SS é apresentado para o estado 2, estado 3, 3U estado, antimicina A, e RCR. Para o estado 2 e 3 medições estado, one way ANOVA foi estatisticamente significativa (p &lt;0,01 e p &lt;0,05, respectivamente). Da mesma forma, o one way ANOVA foi estatisticamente significativa para antimicina e RCR (p &lt;0,01 e p &lt;0,0001, respectivamente. Nenhuma diferença significativa foi observada para 3U estado entre os grupos. ThEsses resultados indicam que 5,0 ug por poço de mitocôndrias deu o menor SS em comparação com outras concentrações e é a quantidade óptima a utilizar no sistema XF 24 com a população dos participantes. Figura 5 serve como um guia para indicar a quantidade de proteína mitocondrial pode ser esperado com base no tamanho da amostra inicial muscular. Como esperado há uma forte correlação entre a quantidade de músculo (mg) e processado o teor total de proteína mitocondrial (mg) da amostra final. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Tampão Chappel-Perry I (CPI) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 mM </td></tr&gt; <tr><td> pH </td><td> 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Tampão Chappel-Perry II (CPII) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> BSA livre de ácidos graxos </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondrial Solution Assay (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> 35 mM </td></tr><tr><td> Manitol </td><td> 110 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1,0 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> BSA livre de ácidos graxos </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondrial Ensaio Solution (MAS) com complexos II condições iniciais </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Succinate </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondrial Ensaio Solution (MAS) com complexos I condições iniciais </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvate</td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Malate </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7,4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * Todos os tampões devem ser feitas em água desionizada </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Solução-tampão e receitas. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Protocolo de Passos </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> Comando </td><td> Tempo (min) </td><td> Porto </td></tr><tr><td> Calibrar </td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td> Espere </td><td> 10.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Espere </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Espere </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Injetar </td><td></td><td> A </td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Injetar </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Injetar </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Injetar </td><td></td><td> D </td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Mix, medir, e misture configuração ciclo para o respirômetro. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> Figura 1. Fluxograma de todo o protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2. A blot representante ocidental para o tecido muscular esquelético todo, bem como mitocôndrias isoladas. Extracto de tecido todo, bem como mitocôndrias isoladas foram imunotransferidas com anticorpo COX IV como marcador mitocondrial e anticorpo GAPDH para controle não mitocondrial. Nenhuma banda GAPDH foi observado no mitocôndrias isoladas indicando pouca ou nenhuma contaminação de fontes não-mitocondriais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> Figura 3. Perfil respirométrico Representante de mitocôndrias isoladas de Vastus humano lateral. Três concentrações de mitocôndrias isoladas, 5,0 mg, 2,5 ug, e 1,0 ug nós<html> re usado neste ensaio. As concentrações finais dos compostos após as injeções portuárias foram ADP 2 mM (porta A); 2 ï¿½ oligomicina (porta B); 6 um FCCP (porta C); e 2 mM antimicina A (porto D). RCR Calculado para esta corrida era 7,95. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> Figura 4. Soma dos quadrados. Soma dos quadrados para os diferentes estados respiração mitocondrial e RCR usando 5,0 mg, 2,5 mg e 1,0 mg mitocôndrias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Isto pode ser utilizado como um guia para estimar a quantidade de proteína mitocondrial que pode ser esperado a partir da análise de regressão inicial músculo peso da amostra:. Da quantidade de músculo (mg) e a produção de proteína mitocondrial total (mg). Como esperado, existe uma correlação positiva directa entre a quantidade de músculo e a proteína total obtida mitocondrial.

Métodos para biópsia de vasto lateral, a preparação de mitocôndrias purificada e profiling respirométrico são descritos. O uso de volume muscular pequeno torna esta técnica adequada para aplicações de pesquisa clínica.

Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

O objetivo geral deste procedimento é examinar o controle respiratório em mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético obtido por biópsia. Isso é realizado primeiramente obtendo-se uma pequena quantidade de músculo por biópsia percutânea com agulha. O segundo passo é isolar mitocôndrias do músculo biopsiado por meio de homogeneização.Em seguida, as mitocôndrias isoladas são lavadas e separadas das frações não mitocondriais por meio de centrifugação e passagem da amostra através de uma gaze dobrada. O passo final consiste em semear as mitocôndrias isoladas para realizar análise respirométrica por ensaios de fluxo extracelular, a fim de visualizar a taxa de consumo de oxigênio. Em última instância, o analisador de fluxo extracelular Seahorse é utilizado para examinar o controle respiratório em mitocôndrias isoladas.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela requer uma quantidade mínima de tecido muscular, tão baixa quanto 20 miligramas, e limita a variabilidade entre experimentos. Essas características tornam esta técnica adequada para aplicações em pesquisas clínicas. As implicações dessa técnica são para o diagnóstico de disfunção mitocondrial em pacientes.A demonstração visual deste método é essencial, pois a biópsia muscular e o isolamento de mitocôndrias requerem manipulações precisas que são melhor demonstradas visualmente, em vez de descritas apenas por escrito. Para realizar a biópsia localmente, administre lidocaína a 1%, tomando cuidado para não infiltrar o músculo. Em seguida, aguarde 10 minutos.Para permitir uma anestesia adequada, colete as biópsias da região mediana do músculo entre a inserção e a origem, evitando áreas subfasciais e miotendíneas. Para isso, utilize inicialmente uma agulha percutânea e siga o estalo fascial ou a resistência da fáscia como guia. Estime a profundidade com a agulha de anestesia, depois sinta-a com a lâmina fina do bisturi e faça uma incisão de quatro a cinco milímetros através da fáscia.Avance a agulha através da incisão até que ela seja inserida no músculo. Colete várias amostras com a janela virada em diferentes direções. Aplique sucção contínua usando uma seringa de 60 centímetros cúbicos enquanto avança e retira as amostras musculares para dentro da agulha percutânea de duas a quatro vezes em diferentes direções.Desligue a sucção e remova a agulha. Peça a um assistente que aplique pressão firme no local da punção por cinco minutos. Para estabelecer a hemostasia, desconecte a agulha do tubo de sucção e remova cuidadosamente as amostras musculares da janela e do corpo do dispositivo.Realize uma segunda passagem se mais músculo for necessário, repetindo este procedimento. Remova quaisquer coágulos sanguíneos visíveis da amostra de músculo utilizando pinça. Em seguida, pese a amostra e coloque-a imediatamente em um tubo contendo gelo.Solução salina tamponada com fosfato fria ou DPBS. Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo visível da amostra utilizando tesoura fina e pinça. Lave os espécimes três a quatro vezes com tampão DPBS gelado.Para remover o sangue, mantenha as amostras em DPBS gelado e processe o mais rápido possível. Dentro de 45 minutos após a biópsia, tome cuidado para remover cuidadosamente quaisquer tendões ou tecido adiposo da amostra muscular. Remova uma pequena porção de qualquer tecido extra para armazenamento a menos 80 graus Celsius.Isso pode ser usado para outros experimentos, como blotagens sulternas. Pique imediatamente o tecido muscular em pedaços finos. Usando uma tesoura estéril, suspenda então em 500 microlitros a um mililitro de um inibidor da ECA proteica da Sistine, como nagars dissolvidos em tampão CP um na concentração de 0,2 miligramas por grama de tecido.Pique a amostra até que pareça bem suspensa. Em seguida, realize uma incubação de cinco minutos em temperatura ambiente antes de transferir para gelo, certificando-se de que o homogeneizador seja completamente lavado anteriormente. Homogeneíze o tecido picado tratado com nagars.Usando um homogeneizador automático. Mantenha a amostra sobre gelo durante todo este processo. Homogeneíze cada amostra de tecido quatro vezes, sendo cada homogeneização um pulso de dois segundos.Usando o homogeneizador automático em uma velocidade de 10.000 RPM, coloque a amostra de volta no gelo. Lave a sonda com etanol 70% seguido por água destilada entre os tecidos. Agora, lave o tecido homogeneizado com um volume igual de tampão chapel Perry one ou CP one.Em seguida, lave o tecido com o dobro do volume do tampão CP dois. Adicione o tubo de equilíbrio acrescentando água até atingir o mesmo volume em outro tubo cônico. Colete o conteúdo em um tubo de centrífuga e centrifugue a 600 ×g, a quatro graus Celsius, por 10 minutos. Umedeça previamente o pano de musselina para permitir que todas as partículas passem através dele e não fiquem retidas no tecido.Passe o sobrenatante por uma gaze dupla, coletando o filtrado e descartando o precipitado, removendo assim a maior parte das frações não mitocondriais. Em seguida, ultracentrifugue o sobrenatante a 10.000 ×g a 4 °C por 10 minutos. Suspenda o precipitado em quatro mililitros de tampão CP2 antes de centrifugar pela segunda vez da mesma maneira após a centrifugação.Descarte o sobrenadante e re-suspenda o precipitado em dois mililitros de tampão CP1. Neste ponto, coloque uma alíquota pequena dessa suspensão em um tubo de ensaio separado para ser usada na estimativa de proteína. Re-suspenda a amostra restante em tampão CP1 e centrifugue.Como antes, observe que a placa de proteína deve ser preparada com os padrões durante as etapas anteriores de centrifugação. Por fim, ressuspenda o pellet final em uma quantidade mínima de solução para ensaio mitocondrial ou massa. Realize ensaios XF para visualizar a taxa de consumo de oxigênio ou OCR em pico mols de oxigênio por minuto ou níveis absolutos de oxigênio e pH.No resultado dos dados. Adicione uma concentração 10 x dos compostos em uma massa X às portas A a D do respirômetro baseado em placa para obter uma concentração final conforme listado no protocolo do texto. Prepare volume suficiente dos compostos para o número necessário de poços.Utilize os cálculos de proteína medidos anteriormente para determinar as concentrações de mitocôndrias a serem adicionadas. Determine a quantidade ideal de mitocôndrias titulando um micrograma, 2,5 microgramas e cinco microgramas de mitocôndrias por poço. Da placa de 24 poços para minimizar a variabilidade entre os poços.Primeiro, dilua 10 x mitocôndrias em massa fria um x mais substrato. Em seguida, adicione 50 microlitros dessa suspensão a cada poço. Deixe quatro poços contendo apenas 50 microlitros de massa para serem usados como leituras de fundo.Coloque a placa de calibração pré-hidratada, juntamente com o cartucho superior do passo anterior, no respirômetro para realizar a calibração do instrumento. Para se preparar para a execução da placa de teste, centrifugue a placa a 2000 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação.Adicione cuidadosamente 450 microlitros de uma massa x, mais succinato e rotenona, a cada poço. Observe atentamente as mitocôndrias ao microscópio para garantir uma aderência homogênea ao fundo do poço antes de transferir a placa para o analisador XF. Sequentialmente. Meça a respiração mitocondrial em tempo real utilizando o respirômetro, programando-o com as configurações para o respirômetro fornecidas no protocolo textual mostrado aqui, que são perfis respirométricos típicos conduzidos pelo complexo dois, utilizando um micrograma, 2,5 microgramas e cinco microgramas de mitocôndrias, conforme esperado.No geral, a OCR aumenta com quantidades maiores de mitocôndrias. A razão de controle respiratório calculada, ou RCR, para este ensaio é de 7,95, indicando que o preparo mitocondrial é de alta qualidade, permitindo comparar a consistência dos resultados ao analisar diferentes quantidades de mitocôndrias. A análise de variantes ou Inova foi realizada e a soma dos quadrados foi calculada. A soma dos quadrados, ou SS, é apresentada para o estado dois, estado três, estado três desacoplado, antimicina A e RCR para as medições do estado dois e estado três de uma via.Innova foi estatisticamente significativo, assim como para ANTIMYCIN e RCR. Nenhuma diferença significativa foi observada para o estado três desacoplado entre os grupos. Esses resultados indicam que cinco microgramas de mitocôndrias por poço proporcionaram o menor SS em comparação com outras concentrações.Este gráfico serve como orientação para indicar a quantidade de proteína mitocondrial que pode ser esperada com base no tamanho inicial da amostra muscular. Como esperado, há uma forte correlação entre a quantidade de músculo processada e o conteúdo total de proteína mitocondrial da amostra final. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em menos de três horas, se realizada corretamente.Após a biópsia muscular, é importante garantir que o paciente não tome aspirina, ibuprofeno ou outros medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais sem prescrição médica nos próximos três dias, a fim de assegurar uma boa cicatrização dos tecidos que foram biopsiados. Em seguida, é necessário garantir que o paciente não realize nenhuma atividade física intensa nas próximas trinta e seis horas, evitando, portanto, exercícios de impacto, como basquete ou uso de trampolim, embora possa continuar com suas atividades normais.Também solicitamos que mantenham a área seca por 24 horas, mas, na primeira vez em que ficar molhada, que seja durante um banho de chuveiro, para que quaisquer tipos de bactérias que possam estar presentes na pele e que não tenham sido removidos não entrem na incisão. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão mais clara de como realizar uma biópsia de tecido muscular esquelético lateral, isolar mitocôndrias e medir o controle respiratório.

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Este protocolo descreve um procedimento para estudar a respiração das mitocôndrias isoladas dos músculos esqueléticos. Este método foi adaptado de...

Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

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Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

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Aqui, apresentamos uma modificação de um método relatado anteriormente que permite o isolamento de mitocôndrias purificadas e de alta qualidade de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo. Este procedimento resulta em mitocôndrias altamente acopladas que respiram com alta função durante ensaios respiratórios baseados em microplacas.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

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Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

Projetamos e construímos um laboratório móvel para medir as taxas respiratórias em mitocôndrias isoladas de animais silvestres capturados em locais de campo. Aqui, descrevemos o projeto e o equipamento de um laboratório mitocondrial móvel e os protocolos laboratoriais associados.

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Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

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