Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

O objetivo geral deste procedimento é examinar o controle respiratório em mitocôndrias, isoladas de tecido muscular esquelético biopsiado. Isso é feito obtendo primeiro uma pequena quantidade de músculo por biópsia percutânea por agulha. O segundo passo é isolar as mitocôndrias do músculo biopsiado por homogeneização.

Em seguida, as mitocôndrias isoladas são lavadas e separadas das frações não mitocondriais por centrifugação e passagem da amostra por uma gaze casada. A etapa final é a placa de mitocôndrias isoladas para realizar a análise respiratória métrica por meio de ensaios de fluxo extracelular para visualizar a taxa de consumo de oxigênio. Em última análise, o analisador de fluxo extracelular de cavalos-marinhos é usado para examinar o controle respiratório em mitocôndrias isoladas.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que ela requer uma quantidade mínima de tecido muscular tão baixa quanto 20 miligramas e limita a variabilidade interexperimental. Esses recursos tornam essa técnica adequada para aplicações de pesquisa clínica. As implicações para esta técnica são para o diagnóstico de disfunção mitocondrial em pacientes.

A demonstração visual desse método é crítica, pois a biópsia muscular e o isolamento mitocondrial exigem manipulações precisas que são melhor demonstradas visualmente do que apenas descritas no texto. Para realizar a biópsia localmente, administrar lidocaína a 1%, tomando cuidado para não infiltrar o músculo. Siga isso com um período de espera de 10 minutos.

Para permitir anestesia suficiente, faça as biópsias da região média do músculo entre a inserção e a origem, evitando áreas subfasciais e miotendonosas. Para conseguir isso primeiro, use uma agulha percutânea e siga um estalo fascial ou resistência da fáscia como guia. Estime a profundidade com a agulha de anestesia, depois sinta-a com a lâmina estreita do bisturi e faça uma incisão de quatro a cinco milímetros através da fáscia.

Avance a agulha pela incisão até que ela seja inserida no músculo. Colete várias amostras com a janela virada em direções diferentes. Aplique sucção contínua usando uma seringa de 60 centímetros cúbicos enquanto avança e retira amostras de músculo na agulha percutânea duas a quatro vezes em direções diferentes.

Interrompa a sucção e remova a agulha. Peça a um assistente que aplique pressão firme no local da punção por cinco minutos. Para estabelecer a hemostasia, desconecte a agulha do tubo de sucção e remova cuidadosamente as amostras musculares da janela e do barril.

Faça uma segunda passagem se for necessário mais músculo, repetindo este procedimento. Remova quaisquer coágulos sanguíneos visíveis da amostra muscular usando uma pinça. Em seguida, pesar a amostra e colocá-la imediatamente num tubo contendo gelo.

ECCOs frios tamponados com fosfato salino ou DPBS. Remova o tecido conjuntivo visível da amostra usando uma tesoura afiada e uma pinça. Completamente. Lave as amostras três a quatro vezes com tampão DPBS gelado.

Para remover o sangue, mantenha as amostras em DPBS geladas e processe o mais rápido possível. Dentro de 45 minutos após a biópsia, tome cuidado para remover cuidadosamente quaisquer tendões ou tecido adiposo da amostra muscular. Remova uma pequena porção de qualquer tecido extra para armazenamento a 80 graus Celsius negativos.

Isso pode ser usado para outros experimentos, como Western blots. Corte imediatamente o tecido muscular em pedaços finos. Usando uma tesoura estéril, suspenda em 500 microlitros a um mililitro de um inibidor da proteína Sistina da ECA, como nagares dissolvidos em CP um tampão a uma concentração de 0,2 miligramas por grama de tecido.

Pique a amostra até que pareça bem suspensa. Em seguida, faça uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente antes de transferir para o gelo, certificando-se de que o homogeneizador esteja bem lavado. Antecipadamente. Homogeneizar o tecido picado tratado com nagars.

Usando um homogeneizador automatizado. Mantenha a amostra no gelo durante todo este processo. Homogeneizar cada amostra de tecido quatro vezes de cada vez por um pulso de dois segundos.

Usando o homogeneizador automatizado a uma velocidade de 10.000 RPM, coloque a amostra de volta no gelo. Lave a sonda com etanol a 70% seguido de água destilada entre os tecidos. Agora, lave o tecido homogeneizado com um volume igual de capela Perry um ou CP um tampão.

Em seguida, lave o tecido com o dobro do volume de tampão CP dois. Adicione o tubo de equilíbrio trazendo água até o mesmo volume em outro tubo cônico. Colete o conteúdo em um tubo de centrífuga e centrifugue a 600 GS a quatro graus Celsius ou 10 minutos antes de umedecer o pano de algodão para permitir que todas as partículas passem e não fiquem presas no pano.

Passe o sobrenadante por uma gaze casada, coletando o filtrado e descartando o pellet, removendo assim a maioria das frações não mitocondriais. Em seguida, ultracentrifugar o sobrenadante a 10 000 GS a quatro graus Celsius durante 10 minutos. Suspender o pellet em quatro mililitros de tampão CP dois antes de centrifugar uma segunda vez da mesma maneira após a centrifugação.

Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o patê em dois mililitros de CP um tampão. Neste ponto, coloque uma pequena alíquota desta suspensão em um tubo de ensaio separado para ser usado para estimativa de proteína. Resus, suspenda a amostra restante em um tampão CP e centrífuga.

Como antes, observe que a placa de proteína deve ser configurada com os padrões durante as etapas anteriores de centrifugação. Finalmente, ressuspenda o pellet final em uma quantidade mínima de solução ou massa de ensaio mitocondrial. Realize ensaios XF para visualizar a taxa de consumo de oxigênio ou OCR em pico moles de oxigênio por minuto ou níveis absolutos de oxigênio e pH.

Na saída de dados. Adicione uma concentração de 10 x dos compostos em uma massa X às portas de A a D do respirômetro baseado em placas para obter uma concentração final conforme listado no protocolo de texto. Prepare um volume suficiente de compostos para o número necessário de poços.

Use os cálculos de proteínas medidos anteriormente para determinar as concentrações de mitocôndrias a serem adicionadas. Determine a quantidade ideal de mitocôndrias titulando um micrograma, 2,5 microgramas e cinco microgramas de mitocôndrias por poço. Da placa de 24 poços para minimizar a variabilidade entre os poços.

Primeiro diluir 10 x mitocôndrias em substrato frio, uma x massa mais substrato. Em seguida, entregue 50 microlitros dessa suspensão em cada poço. Deixando quatro poços contendo apenas 50 microlitros de massa para serem usados como leituras de fundo.

Coloque a placa de calibração pré-embebida junto com o cartucho superior anterior no respirômetro para realizar a calibração do instrumento. Preparando-se para a execução da placa de teste, centrifugue a placa a 2000 GS por 20 minutos a quatro graus Celsius. Após centrifugação.

Adicione delicadamente 450 microlitros de uma massa x, mais succinato e podre conhecido por cada um. Visualize as mitocôndrias ao microscópio para garantir a aderência homogênea ao poço antes de transferir a placa para o analisador XF. Sequencialmente. Meça a respiração mitocondrial em tempo real usando o respirômetro, programando-o usando as configurações do respirômetro fornecidas no protocolo de texto mostrado aqui são perfis métricos típicos do Respiro conduzidos pelo complexo dois usando um micrograma, 2,5 microgramas e cinco microgramas de mitocôndrias, conforme esperado.

No geral, o OCR é aumentado com maiores quantidades de mitocôndrias. A taxa de controle respiratório calculada ou RCR para este ensaio é de 7,95, indicando que a preparação mitocondrial é de alta qualidade para comparar a consistência dos resultados ao traçar o perfil de diferentes quantidades de mitocôndrias, a análise de variantes ou Inova foi realizada e a soma dos quadrados foi calculada. A soma dos quadrados ou SS é apresentada para o estado dois, estado três, estado três, antimicina A desacoplada e RCR para medições de estado dois e estado três de uma maneira.

Innova foi estatisticamente significativo, assim como para ANTIMICINA e RCR. Nenhuma diferença significativa foi observada para o estado três desacoplado entre os grupos. Esses resultados indicam que cinco microgramas de mitocôndrias por poço deram o SS mais baixo em comparação com outras concentrações.

Este gráfico serve como um guia para indicar quanta proteína mitocondrial pode ser esperada com base no tamanho inicial da amostra muscular. Como esperado, há uma forte correlação entre a quantidade de músculo processado e o conteúdo total de proteína mitocondrial da amostra final. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em menos de três horas se for executada corretamente.

Após a biópsia muscular, é importante certificar-se de que o paciente não tome aspirina ou ibuprofeno ou outros não esteróides de venda livre nos próximos três dias, a fim de garantir que haja uma boa cicatrização dos tecidos que biopsiamos. A próxima coisa é que queremos ter certeza de que eles não façam nenhuma atividade extenuante também no próximo dia e meio, então nada como chocante. Isso seria uma fábrica de trampolim de basquete, mas eles podem fazer suas próprias atividades normais.

Também pedimos que mantenham a área seca por 24 horas, mas na primeira vez que molhar para tomar banho para que qualquer tipo de bactéria que possa estar na pele que não limpamos não entre na incisão. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma melhor compreensão de como fazer uma biópsia do tecido muscular esquelético lateral S, isolar as mitocôndrias e medir o controle respiratório.