Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

O objetivo geral deste procedimento é examinar o controle respiratório em mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético obtido por biópsia. Isso é realizado primeiramente obtendo-se uma pequena quantidade de músculo por biópsia percutânea com agulha. O segundo passo é isolar mitocôndrias do músculo biopsiado por meio de homogeneização.

Em seguida, as mitocôndrias isoladas são lavadas e separadas das frações não mitocondriais por meio de centrifugação e passagem da amostra através de uma gaze dobrada. O passo final consiste em semear as mitocôndrias isoladas para realizar análise respirométrica por ensaios de fluxo extracelular, a fim de visualizar a taxa de consumo de oxigênio. Em última instância, o analisador de fluxo extracelular Seahorse é utilizado para examinar o controle respiratório em mitocôndrias isoladas.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela requer uma quantidade mínima de tecido muscular, tão baixa quanto 20 miligramas, e limita a variabilidade entre experimentos. Essas características tornam esta técnica adequada para aplicações em pesquisas clínicas. As implicações dessa técnica são para o diagnóstico de disfunção mitocondrial em pacientes.

A demonstração visual deste método é essencial, pois a biópsia muscular e o isolamento de mitocôndrias requerem manipulações precisas que são melhor demonstradas visualmente, em vez de descritas apenas por escrito. Para realizar a biópsia localmente, administre lidocaína a 1%, tomando cuidado para não infiltrar o músculo. Em seguida, aguarde 10 minutos.

Para permitir uma anestesia adequada, colete as biópsias da região mediana do músculo entre a inserção e a origem, evitando áreas subfasciais e miotendíneas. Para isso, utilize inicialmente uma agulha percutânea e siga o estalo fascial ou a resistência da fáscia como guia. Estime a profundidade com a agulha de anestesia, depois sinta-a com a lâmina fina do bisturi e faça uma incisão de quatro a cinco milímetros através da fáscia.

Avance a agulha através da incisão até que ela seja inserida no músculo. Colete várias amostras com a janela virada em diferentes direções. Aplique sucção contínua usando uma seringa de 60 centímetros cúbicos enquanto avança e retira as amostras musculares para dentro da agulha percutânea de duas a quatro vezes em diferentes direções.

Desligue a sucção e remova a agulha. Peça a um assistente que aplique pressão firme no local da punção por cinco minutos. Para estabelecer a hemostasia, desconecte a agulha do tubo de sucção e remova cuidadosamente as amostras musculares da janela e do corpo do dispositivo.

Realize uma segunda passagem se mais músculo for necessário, repetindo este procedimento. Remova quaisquer coágulos sanguíneos visíveis da amostra de músculo utilizando pinça. Em seguida, pese a amostra e coloque-a imediatamente em um tubo contendo gelo.

Solução salina tamponada com fosfato fria ou DPBS. Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo visível da amostra utilizando tesoura fina e pinça. Lave os espécimes três a quatro vezes com tampão DPBS gelado.

Para remover o sangue, mantenha as amostras em DPBS gelado e processe o mais rápido possível. Dentro de 45 minutos após a biópsia, tome cuidado para remover cuidadosamente quaisquer tendões ou tecido adiposo da amostra muscular. Remova uma pequena porção de qualquer tecido extra para armazenamento a menos 80 graus Celsius.

Isso pode ser usado para outros experimentos, como blotagens sulternas. Pique imediatamente o tecido muscular em pedaços finos. Usando uma tesoura estéril, suspenda então em 500 microlitros a um mililitro de um inibidor da ECA proteica da Sistine, como nagars dissolvidos em tampão CP um na concentração de 0,2 miligramas por grama de tecido.

Pique a amostra até que pareça bem suspensa. Em seguida, realize uma incubação de cinco minutos em temperatura ambiente antes de transferir para gelo, certificando-se de que o homogeneizador seja completamente lavado anteriormente. Homogeneíze o tecido picado tratado com nagars.

Usando um homogeneizador automático. Mantenha a amostra sobre gelo durante todo este processo. Homogeneíze cada amostra de tecido quatro vezes, sendo cada homogeneização um pulso de dois segundos.

Usando o homogeneizador automático em uma velocidade de 10.000 RPM, coloque a amostra de volta no gelo. Lave a sonda com etanol 70% seguido por água destilada entre os tecidos. Agora, lave o tecido homogeneizado com um volume igual de tampão chapel Perry one ou CP one.

Em seguida, lave o tecido com o dobro do volume do tampão CP dois. Adicione o tubo de equilíbrio acrescentando água até atingir o mesmo volume em outro tubo cônico. Colete o conteúdo em um tubo de centrífuga e centrifugue a 600 ×g, a quatro graus Celsius, por 10 minutos. Umedeça previamente o pano de musselina para permitir que todas as partículas passem através dele e não fiquem retidas no tecido.

Passe o sobrenatante por uma gaze dupla, coletando o filtrado e descartando o precipitado, removendo assim a maior parte das frações não mitocondriais. Em seguida, ultracentrifugue o sobrenatante a 10.000 ×g a 4 °C por 10 minutos. Suspenda o precipitado em quatro mililitros de tampão CP2 antes de centrifugar pela segunda vez da mesma maneira após a centrifugação.

Descarte o sobrenadante e re-suspenda o precipitado em dois mililitros de tampão CP1. Neste ponto, coloque uma alíquota pequena dessa suspensão em um tubo de ensaio separado para ser usada na estimativa de proteína. Re-suspenda a amostra restante em tampão CP1 e centrifugue.

Como antes, observe que a placa de proteína deve ser preparada com os padrões durante as etapas anteriores de centrifugação. Por fim, ressuspenda o pellet final em uma quantidade mínima de solução para ensaio mitocondrial ou massa. Realize ensaios XF para visualizar a taxa de consumo de oxigênio ou OCR em pico mols de oxigênio por minuto ou níveis absolutos de oxigênio e pH.

No resultado dos dados. Adicione uma concentração 10 x dos compostos em uma massa X às portas A a D do respirômetro baseado em placa para obter uma concentração final conforme listado no protocolo do texto. Prepare volume suficiente dos compostos para o número necessário de poços.

Utilize os cálculos de proteína medidos anteriormente para determinar as concentrações de mitocôndrias a serem adicionadas. Determine a quantidade ideal de mitocôndrias titulando um micrograma, 2,5 microgramas e cinco microgramas de mitocôndrias por poço. Da placa de 24 poços para minimizar a variabilidade entre os poços.

Primeiro, dilua 10 x mitocôndrias em massa fria um x mais substrato. Em seguida, adicione 50 microlitros dessa suspensão a cada poço. Deixe quatro poços contendo apenas 50 microlitros de massa para serem usados como leituras de fundo.

Coloque a placa de calibração pré-hidratada, juntamente com o cartucho superior do passo anterior, no respirômetro para realizar a calibração do instrumento. Para se preparar para a execução da placa de teste, centrifugue a placa a 2000 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação.

Adicione cuidadosamente 450 microlitros de uma massa x, mais succinato e rotenona, a cada poço. Observe atentamente as mitocôndrias ao microscópio para garantir uma aderência homogênea ao fundo do poço antes de transferir a placa para o analisador XF. Sequentialmente. Meça a respiração mitocondrial em tempo real utilizando o respirômetro, programando-o com as configurações para o respirômetro fornecidas no protocolo textual mostrado aqui, que são perfis respirométricos típicos conduzidos pelo complexo dois, utilizando um micrograma, 2,5 microgramas e cinco microgramas de mitocôndrias, conforme esperado.

No geral, a OCR aumenta com quantidades maiores de mitocôndrias. A razão de controle respiratório calculada, ou RCR, para este ensaio é de 7,95, indicando que o preparo mitocondrial é de alta qualidade, permitindo comparar a consistência dos resultados ao analisar diferentes quantidades de mitocôndrias. A análise de variantes ou Inova foi realizada e a soma dos quadrados foi calculada. A soma dos quadrados, ou SS, é apresentada para o estado dois, estado três, estado três desacoplado, antimicina A e RCR para as medições do estado dois e estado três de uma via.

Innova foi estatisticamente significativo, assim como para ANTIMYCIN e RCR. Nenhuma diferença significativa foi observada para o estado três desacoplado entre os grupos. Esses resultados indicam que cinco microgramas de mitocôndrias por poço proporcionaram o menor SS em comparação com outras concentrações.

Este gráfico serve como orientação para indicar a quantidade de proteína mitocondrial que pode ser esperada com base no tamanho inicial da amostra muscular. Como esperado, há uma forte correlação entre a quantidade de músculo processada e o conteúdo total de proteína mitocondrial da amostra final. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em menos de três horas, se realizada corretamente.

Após a biópsia muscular, é importante garantir que o paciente não tome aspirina, ibuprofeno ou outros medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais sem prescrição médica nos próximos três dias, a fim de assegurar uma boa cicatrização dos tecidos que foram biopsiados. Em seguida, é necessário garantir que o paciente não realize nenhuma atividade física intensa nas próximas trinta e seis horas, evitando, portanto, exercícios de impacto, como basquete ou uso de trampolim, embora possa continuar com suas atividades normais.

Também solicitamos que mantenham a área seca por 24 horas, mas, na primeira vez em que ficar molhada, que seja durante um banho de chuveiro, para que quaisquer tipos de bactérias que possam estar presentes na pele e que não tenham sido removidos não entrem na incisão. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão mais clara de como realizar uma biópsia de tecido muscular esquelético lateral, isolar mitocôndrias e medir o controle respiratório.