Avaliação Funcional de neurotoxinas Biológica em Culturas em Rede de Células-Tronco derivadas do Sistema Nervoso Central Neurônios

O objetivo deste procedimento é medir com precisão o efeito que as neurotoxinas clostridiais exercem sobre a transmissão sináptica em culturas neuronais interconectadas derivadas de células-tronco embrionárias de camundongo. Isso é realizado primeiramente adaptando as células-tronco embrionárias a um cultivo em suspensão livre de células de suporte e mantendo as células adaptadas em estado pluripotente. O segundo passo consiste em diferenciar as células-tronco adaptadas em suspensão em neurônios ou ESNs, utilizando uma variação da técnica de diferenciação em quatro estágios.

Em seguida, as ESNs são tratadas com uma série de meios para promover a maturação em neurônios conectados e ativos sinapticamente. O passo final consiste em tratar as ESNs com neurotoxinas clostridiais ou outras neurotoxinas e medir os efeitos sobre a atividade monossináptica utilizando eletrofisiologia por grampo de tensão em célula inteira. Por fim, as alterações na produção espontânea de atividade monossináptica são quantificadas a partir de gravações eletrofisiológicas normalizadas em relação a neurônios controle pareados por idade e lote, e comparadas entre diferentes condições, como doses, tempos ou tratamentos farmacológicos.

A principal vantagem desta técnica é que as ESNs são o primeiro modelo baseado em células a replicar as patologias funcionais responsáveis pelas manifestações clínicas do botulismo e da tétano. Tivemos a ideia inicial deste método ao descobrirmos que as ESNs são altamente suscetíveis a todas as neurotoxinas clostridiais com base no clivagem das proteínas SNARE, além de demonstrarem atividade sináptica espontânea em comportamento de rede emergente. A demonstração do procedimento será realizada pela técnica Megan Lyman, do meu laboratório. Comece transferindo o cultivo em suspensão livre de células alimentadoras adaptado.

Transfira os agregados de ESC para um tubo cônico de 15 mililitros e deixe os agregados sedimentarem formando um pellet compacto. Após a sedimentação dos agregados, aspire o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Em seguida, adicione cinco mililitros de PBS para lavar as células e centrifugue a 100 × g durante 2,5 minutos.

Aspire cuidadosamente o PBS e então adicione 500 microlitros de tripsina e inverta o tubo várias vezes para interromper suavemente o pellet celular. Em seguida, coloque o tubo no banho-maria a 37 graus Celsius e incube por três minutos. Após o tempo de incubação ter decorrido, retorne o tubo à cabine de cultura de tecidos e adicione 500 microlitros de meio ESC para diluir a tripsina.

Em seguida, pipete a suspensão de células CEL de cinco a 10 vezes com a pipeta P 1000 para obter uma suspensão de células simples. Conte uma alíquota das células utilizando um hemocitômetro e centrifugue o restante da suspensão celular a 200 × g por três minutos. Após a aspiração do sobrenadante, suspenda as células em uma concentração final de 1 × 10⁷ células por mililitro com o meio ESC.

Em seguida, transfira 150 microlitros da suspensão para 10 mililitros de meio ESC em uma placa bacteriana de 10 centímetros e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. As ESCs são rotineiramente subcultivadas usando este protocolo. A cada 48 horas, a diferenciação das ESCs em neurônios começa durante a passagem celular de rotina.

Dissocie as ESCs como anteriormente, mas inclua uma placa adicional para diferenciação neuronal. Transfira 350 microlitros da suspensão celular para um recipiente de 10 centímetros com fundo de baixa adesão contendo 25 mililitros de meio de diferenciação. Coloque o recipiente sobre um agitador orbital ajustado a 30 a 45 RPM dentro de uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e incube por 48 horas.

Após 48 horas, utilize uma pipeta de 25 mililitros para transferir os agregados celulares em diferenciação para um tubo cônico de 50 mililitros. Imediatamente após, adicione 25 mililitros de meio de diferenciação fresco à placa de Petri.

Deixe os agregados sedimentarem por dois a cinco minutos, formando um pellet visível com profundidade de um a dois milímetros. Aspire cuidadosamente o meio, ignorando quaisquer células isoladas ou pequenos agregados ainda em suspensão, e utilize uma pipeta P 1000 para transferir a palheta celular de volta para a placa de Petri. Retorne a placa ao agitador rotativo no interior do incubador.

Após mais 48 horas, repita o procedimento de troca de meio. Desta vez, utilize 30 mililitros de meio de diferenciação suplementado com seis micromolares de ácido retinóico trans-retnóico. O pellet formado terá agora de dois a quatro milímetros de profundidade após a incubação das células.

Como antes, repita o procedimento de troca de meio com suplementação de ácido retinóico pela última vez. No dia seguinte, o pellet terá entre quatro e oito milímetros de profundidade. Prepare as superfícies de plaqueamento conforme descrito na parte escrita do protocolo na tarde do dia do plaqueamento, ou cinco mililitros de cada: meio de tripsina MPC pré-revestido e inibidor de tripsina de soja a 0,1%, ambos a 37 graus Celsius.

Em seguida, utilize uma pipeta de 25 mililitros para transferir os agregados em diferenciação da placa de cultura para um tubo cônico de 50 mililitros. Deixe os agregados sedimentarem por três a cinco minutos e, então, aspire cuidadosamente o meio sem perturbar o pellet. A seguir, lave o pellet com cinco a 10 mililitros de PBS, após a sedimentação dos agregados.

Aspire o PBS e repita a lavagem. Após a segunda lavagem com PBS, adicione cinco mililitros de meio de maturação MPC ao pellet e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Agite suavemente o tubo duas a três vezes durante a incubação. Em seguida, adicione cinco mililitros de inibidor de tripsina de soja a 0,1% às células e misture rapidamente por inversão. Então, triture delicadamente as células de 10 a 15 vezes com uma pipeta de 10 mililitros até que seja obtida uma suspensão celular relativamente homogênea.

Filtre lentamente a suspensão celular através de um filtro de células de 40 ou 70 micrômetros colocado sobre um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, após toda a suspensão ter sido filtrada, adicione um mililitro do meio N2 ao filtro para lavar as células remanescentes através do filtro. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue por seis minutos a 200 × g. Após aspirar o meio sem perturbar o pellet, redissolva-o em dois mililitros de meio N2 e então adicione meio N2 até um volume total de 10 mililitros.

Centrifugue por cinco minutos a 200 vezes. G. Aspire o meio e repita novamente o processo de lavagem do pellet. Re-suspenda o pellet em 10 mililitros de meio N dois.

Retire uma alíquota das células e conte com um hemocitômetro, e então repita a centrifugação Reese. Suspenda as células em meio N dois até uma concentração final de um vezes 10 à sétima células por mililitro e plaque numa densidade de 150.000 a 200.000 células por centímetro quadrado. O indicador é preparado no DIV menos um e colocado no incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius.

Mantenha os ESNs de acordo com as instruções no protocolo escrito. Primeiro, dilua a neurotoxina botulínica do sorotipo A até 100 vezes a concentração final desejada no meio de cultura de ESN e aqueça a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione um volume apropriado de toxina a culturas de ESN com DIV 21 ou mais.

Incubar a placa de cultura e retornar ao incubador no tempo desejado. Aspirar cuidadosamente o meio de cultura ESN e lavar duas vezes com tampão de gravação extracelular ou ERB. Em seguida, adicionar quatro mililitros de ERB suplementado com cinco micromolares de tetrodotoxina para bloquear potenciais de ação e 10 micromolares de bicuculina para antagonizar a atividade dos receptores gabaA.

Em seguida, transfira a placa para o aparato de eletrofisiologia. Nem perfusão nem controle de temperatura são necessários para a inibição medida da transmissão sináptica ou para o ensaio mist. Após usar um puxador de micropipetas para puxar pipetas de borossilicato com resistência de cinco a 10 megaohms, preencha uma pipeta com o tampão intracelular de gravação.

Em seguida, mergulhe suavemente a pipeta no reagente de silício. Fixe a pipeta de gravação no porta-eletrodo e conecte uma seringa cheia de ar à tubulação que se conecta ao porta-eletrodo. Aplique uma pressão positiva constante por meio da seringa enquanto abaixa a pipeta de gravação no ERB.

Após pousar suavemente a pipeta de gravação na SOR do neurônio a ser registrado. Observe a pressão positiva rompendo o selo na seringa. Reconecte a seringa e aplique pressão negativa sustentada por meio de inspiração suave para formar um selo de giga ohm.

Uma vez formado o selo giga ome, reduza a voltagem de retenção para menos 70 milivolts. Em seguida, aplique cuidadosamente pulsos curtos de pressão negativa utilizando a seringa para romper e alcançar a configuração de célula inteira. Monitore os picos de capacitância por 30 segundos para confirmar que o selamento está estável.

Cancelar os picos de capacitância no software HEA e alternar para o modo de fixação de corrente para monitorar e registrar o potencial de membrana em repouso sem ajuste para potenciais de junção líquida. O potencial de membrana em repouso pode estar entre menos 67 e menos 82 milivolts. Ajustar o ganho para dois milivolts por picoampère.

Alterne para o modo de fixação de voltagem e realize uma gravação contínua em menos 70 milivolts durante três a cinco minutos para detectar correntes excitatórias miniaturas pós-sinápticas. Analise três a cinco minutos dos dados gravados para detectar ME-PSCs utilizando as configurações padrão para EPCs de receptores AMPA no Mini Analysis, colete e salve as informações sobre os eventos detectados. Após coletar as frequências de ME-PSCs de oito a 12 controles e de oito a 12 amostras tratadas com neurotoxina botulínica para cada condição de exposição.

Analise a frequência em relação à idade e controles pareados por lote, então determine a significância estatística da porcentagem de inibição da atividade sináptica utilizando testes estatísticos apropriados do div sete ao div 49. As ESNs expressam compartimentos neurotrópicos e formam puncta sinápticos. Interfaces dendríticas taxonômicas. As ESNs sofrem inibição da atividade sináptica quando expostas aos serotipos do neurotoxina botulínica A TG e à toxina tetânica.

Esses traços representativos de ESNs foram coletados 20 horas após a adição na solução de neurotoxinas botulínicas dos sorotipos A TG tétano, neurotoxina ou veículo. Cada neurotoxina reduziu a atividade sináptica em mais de 95% em comparação com os controles. As quatro imagens a seguir mostram a sensibilidade do uso de névoa para medir a atividade monossináptica em ESNs tratados com neurotoxina botulínica do sorotipo A.

Esta primeira imagem mostra traços representativos de medições perdidas de atividade sináptica 20 horas após a adição na solução do banho da neurotoxina botulínica do sorotipo A. Os segmentos dos traços em clamp de voltagem exibiram uma diminuição na frequência de C-E-P-S-M após exposição à neurotoxina botulínica do sorotipo A. Esta imagem mostra a quantificação da frequência de C-E-P-S-M e confirma uma redução dependente da dose na frequência de C-E-P-S-M. A concentração inibitória mediana foi determinada pelo ajuste dos mínimos quadrados de uma regressão não linear utilizando uma curva de quatro parâmetros com inclinação variável. Observe que o limite de detecção por mist no SNS é de pelo menos 0,005 picoMolar.

Este gráfico de barras mostra a quantificação por citometria da clivagem do SNAP 25 medida por western blot. Observe a sensibilidade reduzida da clivagem da proteína snare como indicador de intoxicação. Em comparação com mist, um único asterisco indica um valor de P inferior a 0,05.

Um asterisco triplo indica um valor de P inferior a 0,001. Esses resultados demonstram que populações interconectadas de neurônios derivados de células-tronco oferecem um modelo celular baseado em sistema fisiologicamente relevante para o envenenamento por neurotoxinas clostridiais. A utilização do SNS deverá reduzir significativamente o sofrimento e a morte de animais, servindo como substituto adequado ao ensaio de letalidade em camundongos, com o benefício adicional de maior velocidade, especificidade e sensibilidade.

Essa técnica abre caminho para pesquisadores na área de neurotoxicologia empregarem técnicas de triagem de média produtividade baseadas na atividade de redes neurais para facilitar a triagem terapêutica e a detecção de toxinas para neurotoxinas clostridiais.