Avaliação Funcional de neurotoxinas Biológica em Culturas em Rede de Células-Tronco derivadas do Sistema Nervoso Central Neurônios

O objetivo deste procedimento é medir com precisão o efeito que as neurotoxinas clostridiais têm na transmissão sináptica em culturas em rede de neurônios derivados de células-tronco embrionárias de camundongos. Isso é feito primeiro adaptando células-tronco embrionárias a uma cultura de suspensão livre de células alimentadoras e mantendo as células adaptadas em um estado pluripotente. O segundo passo é diferenciar células-tronco adaptadas à suspensão em neurônios ou ESNs, usando uma variação da técnica de diferenciação quatro quatro.

Em seguida, os ESNs são tratados com uma série de meios para promover a maturação em neurônios em rede sinapticamente ativos. A etapa final é tratar ESNs com clostridial, neurotoxinas ou outras neurotoxinas e medir os efeitos na atividade monossináptica usando eletrofisiologia de grampo de adesivo de célula inteira. Em última análise, as mudanças na produção espontânea da atividade monossináptica são quantificadas a partir de registros eletrofisiológicos normalizados para neurônios de controle pareados por idade e lote e comparados entre diferentes condições, como doses, horários ou tratamentos medicamentosos.

A principal vantagem dessa técnica é que os ESNs são o primeiro modelo baseado em células a replicar as patologias funcionais responsáveis pelas manifestações clínicas do botulismo e do tétano. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando descobrimos que os ESNs eram altamente suscetíveis a todas as neurotoxinas clostridiais com base na clivagem da proteína snare e também demonstraram atividade sináptica espontânea no comportamento da rede emergente. Demonstrando o procedimento estará a Sra. Megan Lyman, uma técnica do meu laboratório Comece transferindo a cultura de suspensão livre de células alimentadoras adaptada.

O ESC agrega a um tubo cônico de 15 mililitros e permite que os agregados se depositem em um pellet compacto. Uma vez que os agregados tenham assentado, aspire o SUP natant tomando cuidado para não romper o pellet celular. Em seguida, adicione cinco mililitros de PBS para lavar as células e centrifugue a 100 vezes G por 2,5 minutos.

Aspire cuidadosamente o PBS e, em seguida, adicione 500 microlitros de tripsina e inverta o tubo várias vezes para romper suavemente o pellet celular. Em seguida, coloque o tubo no banho-maria a 37 graus Celsius e incube por três minutos. Decorrido o tempo de incubação, retorne o tubo à capa de cultura de tecidos e adicione 500 microlitros de meio ESC para diluir a tripsina.

Em seguida, itrate a suspensão CEL cinco a 10 vezes com a pipeta P 1000 para obter uma suspensão de célula única. Contar um eloqua das células utilizando um hemo, citómetro e centrifugar o resto da suspensão celular a 200 vezes G durante três minutos. Após aspirar o supinato, suspendemos as células até uma concentração final de um vez por cento, as sete células por mililitro com meio ESC.

Em seguida, transfira 150 microlitros da suspensão para 10 mililitros de meio ESC em um prato bacteriano de 10 centímetros e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. E ESCs são rotineiramente passados usando este protocolo. A cada 48 horas, a diferenciação de ESCs em neurônios começa durante uma passagem celular de rotina.

Dissocie as ESCs como antes, mas inclua uma placa adicional para diferenciação neuronal. Transfira 350 microlitros da suspensão celular para um prato de fixação baixo de 10 centímetros contendo 25 mililitros de diferenciação. Média. Coloque o prato em um agitador orbital ajustado para 30 a 45 RPM dentro de uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e incube por 48 horas.

Após 48 horas, use uma pipeta de 25 ml para transferir os agregados celulares diferenciados para um tubo cônico de 50 mililitros. Imediatamente depois, adicione 25 mililitros de diferenciação fresca. Médio para a placa de Petri.

Deixe os agregados assentarem por dois a cinco minutos, produzindo um pellet visível com um a dois milímetros de profundidade. Aspire cuidadosamente o meio, ignorando quaisquer células isoladas ou pequenos agregados ainda em suspensão, e use uma pipeta P 1000 para transferir a paleta de células de volta para a placa de Petri. Retorne o prato ao agitador rotativo na incubadora.

Após mais 48 horas, repita o procedimento de troca de mídia. Desta vez a 30 mililitros de meio de diferenciação suplementado com seis micromolares de ácido trans-retinóico. O pellet formado agora terá de dois a quatro milímetros de profundidade após a incubação das células.

Como antes, repita o procedimento de troca de meio com suplementação de ácido retinóico pela última vez. O pellet terá de quatro a oito milímetros de profundidade neste ponto no dia seguinte. Prepare as superfícies de revestimento conforme descrito na parte escrita do protocolo na tarde do dia do revestimento, ou cinco mililitros de meio de tripsina MPC pré-revestido e 0,1% de inibidor de tentina de soja a 37 graus Celsius.

Em seguida, use uma pipeta de 25 mililitros para transferir agregados diferenciadores da placa de cultura para um tubo cônico de 50 mililitros. Deixe os agregados repousar por três a cinco minutos e, em seguida, aspire cuidadosamente o meio sem perturbar o pellet. Em seguida, lave o pellet com cinco a 10 mililitros de PBS e depois que os agregados se assentarem.

Aspire o PBS e repita a lavagem. Após a segunda lavagem do PBS. Adicione cinco mililitros de meio MPC ao pellet e incube-o a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Agitando suavemente o tubo duas a três vezes durante a incubação. Em seguida, adicione cinco mililitros de inibidor de tripsina de soja a 0,1% às células e misture rapidamente invertendo. Em seguida, tritrate suavemente as células 10 a 15 vezes com uma pipeta de 10 mililitros até que uma suspensão celular relativamente homogênea seja produzida.

Filtre lentamente a suspensão celular através de um filtro de células de 40 ou 70 mícrons colocado em cima de um tubo cônico de 50 mililitros. Então, uma vez que toda a suspensão tenha sido filtrada a um mililitro de N dois, médio para o filtro para lavar as células restantes através do filtro. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue por seis minutos a 200 vezes G.Depois de aspirar o meio sem perturbar o triturato de pellets em dois mililitros de N dois meios, adicione N dois meios a um volume total de 10 mililitros.

Centrifugue por cinco minutos 200 vezes. G. Aspire a mídia e repita o processo de lavagem de pellets novamente. Resus suspendendo o pellet em 10 mililitros de N dois meios.

Remova uma alíquota das células e conte com um hemocitômetro e, em seguida, repita a centrifugação Reese. Suspenda as células em N dois médios a uma concentração final de um vezes 10 elevado a sete células por mililitro e plaquee com uma densidade de 150.000 a 200.000 células por centímetro quadrado. O índico é preparado em DIV menos um e colocado na incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius.

Mantenha os ESNs de acordo com as instruções do protocolo escrito. Primeiro, dilua a neurotoxina botulínica sorotipo A a 100 vezes a concentração final desejada em cultura ESN, média e quente a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione um volume apropriado de toxina às culturas DIV 21 mais ESN.

Inche o prato de cultura e volte para a incubadora no momento desejado. Aspirar o meio de cultura ESN e lavar duas vezes com tampão de registo extracelular ou ERB. Em seguida, adicione quatro mililitros de ERB suplementado com cinco tetrodatoxinas micromolares para bloquear os potenciais de ação e 10 micromolares bi colina para antagonizar a atividade do receptor de gabaa.

Em seguida, transfira o prato para o equipamento de eletrofisiologia. Nem a perfusão nem o controle de temperatura são necessários para a inibição medida da transmissão sináptica ou ensaio de névoa. Depois de usar um extrator de micropipeta para puxar pipetas de silicato bo com cinco a 10 mega ohms de resistência, preencha uma pipeta com tampão de gravação intracelular.

Em seguida, mergulhe suavemente a pipeta em reagente de silício. Prenda a pipeta de gravação no suporte do eletrodo e conecte uma seringa cheia de ar ao tubo que é portado para o suporte do eletrodo. Forneça pressão positiva constante através da seringa enquanto abaixa a pipeta de registro no ERB.

Depois de pousar suavemente a pipeta de registro no SOR do neurônio a ser registrado. Veja a pressão positiva quebrando o selo da seringa. Reconecte a seringa e aplique pressão negativa sustentada por meio de inspiração suave para formar uma vedação de giga ohm.

Assim que a vedação giga ome for formada, diminua a tensão de retenção para menos 70 milivolts. Em seguida, aplique cuidadosamente pulsos curtos de pressão negativa usando a seringa para quebrar a configuração de célula inteira. Monitore os picos de capacitância por 30 segundos para confirmar se o patch está estável.

Cancele os picos de capacitância no software HEA e mude para o modo de pinça de corrente para monitorar e registrar o potencial de membrana em repouso sem ajuste para potenciais de junção de líquido. O potencial de membrana em repouso pode estar entre menos 67 e menos 82 milivolts. Ajuste o ganho para dois milivolts por pico amp.

Mude para o modo de grampo de tensão e execute uma gravação contínua de menos 70 milivolts por três a cinco minutos para detectar correntes pós-sinápticas excitatórias em miniatura. Analise de três a cinco minutos de dados registrados para detectar PSCs usando as configurações padrão para EPCs do receptor AMPA em mini análise, colete e salve informações sobre eventos detectados. Depois de coletar frequências M-E-P-S-C para oito a 12 controles e oito a 12 amostras tratadas com neurotoxina botulínica para cada condição de exposição.

Analise a frequência em relação aos controles pareados por idade e lote e, em seguida, determine a significância estatística da inibição percentual da atividade sináptica usando testes estatísticos apropriados da div sete à div 49, ESNs expressam compartimentos neurotrópicos e formam punção sináptica. Interfaces dendríticas do Taxo. Os ESNs sofrem inibição da atividade sináptica quando expostos aos sorotipos de neurotoxina botulínica a TG e toxina tetânica.

Esses traços representativos de ESNs foram coletados 20 horas após a edição do banho de sorotipos de neurotoxina botulínica, A TG tétano, neurotoxina ou veículo. Cada neurotoxina reduziu a atividade sináptica em mais de 95% em comparação com os controles. As quatro imagens a seguir mostram a sensibilidade do uso de névoa para medir a atividade monossináptica no sorotipo de neurotoxina botulínica, ESNs tratados com A.

Esta primeira imagem mostra traços representativos de medições perdidas da atividade sináptica 20 horas após a edição do banho do sorotipo A da neurotoxina botulínica. Os segmentos de traços de grampo de voltagem exibiram uma diminuição na frequência de MEPC após a exposição ao sorotipo A da neurotoxina botulínica. A concentração inibitória mediana foi determinada com o ajuste de mínimos quadrados de uma regressão não linear usando uma inclinação variável de quatro parâmetros. Observe que o limite de detecção por névoa no SNS é de pelo menos 0,005 picaMolar.

Este gráfico de barras mostra a quantificação da citometria da clivagem do SNAP 25 medida por western blot. Observe a sensibilidade reduzida da clivagem da proteína do laço como uma leitura de intoxicação. Em comparação com a névoa, um único asterisco indica um valor de P inferior a 0,05.

Um asterisco triplo indica um valor de P inferior a 0,001. Essas descobertas demonstram que populações em rede de neurônios derivados de células-tronco oferecem um modelo fisiologicamente relevante baseado em células de envenenamento por neurotoxina clostridial. Espera-se que o uso do SNS reduza significativamente o sofrimento e a morte dos animais, servindo como um substituto adequado para o ensaio de letalidade em camundongos com o benefício adicional de melhorar a especificidade e a sensibilidade da velocidade.

Essa técnica abre caminho para que pesquisadores no campo da neurotoxicologia empreguem técnicas de triagem de rendimento moderado baseadas na atividade da rede neuronal para facilitar a triagem terapêutica e a detecção de toxinas para neurotoxinas clostridiais.