Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz
May 11th, 2018
Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização de projeção dos neurônios motores e arborização do axônio em embriões de rato transgénicos Hb9::GFP . Depois de imunocoloração para os neurônios motores, usamos a microscopia de fluorescência folha de luz aos embriões de imagem para posterior análise quantitativa. Este protocolo é aplicável a outros processos de navegação do neurônio no sistema nervoso central.
O objetivo geral deste protocolo é permitir a avaliação qualitativa e quantitativa dos padrões de arborização do axônio do neurônio motor usando microscópio de folha de luz e software de análise de imagem em embriões de camundongos. Este método pode ajudar a entender o desenvolvimento do neurônio motor em coordenação com movimentos complexos. A principal vantagem dessa técnica é que você pode observar e visualizar padrões de arborização de axônios de neurônios motores de vários ângulos e analisar quantitativamente cada nervo individual.
Demonstrando o procedimento estarão Ya-Ping Yen e Ee Shan Liau, dois alunos de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, fixe os embriões individualmente em uma placa de 24 poços com um mililitro de paraformaldeído a 4% recém-preparado em PBS por poço a quatro graus Celsius em um shaker durante a noite. No dia seguinte, lave os embriões fixados pelo menos três vezes, cada uma por cinco a 10 minutos, com um mililitro de 1X PBS e incube-os durante a noite a quatro graus Celsius.
Em seguida, permeabilize cada embrião em um mililitro de 0,5% PBST durante a noite a quatro graus Celsius em um shaker. Bloqueie cada amostra com um mililitro de 10% FBS preparado em 1X PBS durante a noite a 4 graus Celsius em um shaker. Em seguida, incubar cada embrião com um mililitro de anticorpo primário anti-GFP a 4 graus Celsius por 72 horas com agitação constante.
Após a incubação do anticorpo primário, lave cada embrião com um mililitro de 0,5% PBST ao longo de um a dois dias a quatro graus Celsius em um shaker. Depois, aplique um mililitro de anticorpo secundário e incube durante a noite no escuro a quatro graus Celsius com agitação constante. No dia seguinte, lave cada embrião com um mililitro de 0,5% PBST pelo menos três vezes a quatro graus Celsius em uma coqueteleira ao longo de dois a três dias.
Em seguida, incube cada embrião em um reagente comercial de limpeza com um índice de refração de 1,49 nd em um tubo de 1,5 mililitro protegido da luz à temperatura ambiente durante a noite. Configure a óptica de iluminação 5X/0.1 e a óptica de detecção 5X/0.16. Monte o porta-amostras e o capilar da amostra.
Preparar a câmara de recolha de amostras enchendo-a com uma solução de limpeza. Para montar o embrião, prepare uma ponta de pipeta P200 cortando a parte superior de modo que ela se ajuste ao diâmetro do capilar e remova a parte pontiaguda para a fixação da amostra. Em seguida, derreta a extremidade embotada da ponta da pipeta usando uma pequena chama.
Apague a chama e prenda rapidamente o embrião verticalmente na extremidade derretida. Encaixe a parte superior da ponta da pipeta com o capilar de amostra e coloque a câmara de amostra preparada no microscópio. Usando o software de imagem, selecione Localizar capilar na guia Localizar e ajuste os eixos X, Y e Z.
Em seguida, selecione Localizar amostra e amplie para 0,6X para focar no embrião. Deixe o tampão da câmara se equilibrar com o embrião por algum tempo para limpar quaisquer detritos ou bolhas. Para aquisição de imagem na guia Aquisição, defina os parâmetros do caminho de luz, como Detetive
Marque a caixa de seleção Varredura dinâmica para redução de sombra. Em seguida, defina as configurações de aquisição, Bit Bepth para 16 bits, Zoom para a faixa entre 0,36 e 0,7X, iluminação de local único ou iluminação de local duplo. Clique em Contínuo e defina a Intensidade do laser, o Tempo de exposição, a Potência do laser e a Posição da folha de luz.
Em seguida, pressione Parar para encerrar a aquisição da imagem. É importante garantir que a amostra transparente seja posicionada dentro do caminho de luz mais curto para permitir a aquisição detalhada de imagens de estruturas arborizadas finas em nervos motores individuais. Para aquisição multidimensional, defina a pilha Z movendo a posição z para a primeira e a última imagem.
Clique em Ideal para definir o número da fatia. Em seguida, clique em Iniciar experimento para adquirir a pilha Z selecionada. Quando terminar, salve a imagem no formato czi.
Para quantificar a arborização do axônio, abra o arquivo de imagem no software de análise de imagem. Ajuste a cor, o brilho e o contraste da imagem usando a janela Ajuste de Exibição para detectar filamentos com base no contraste de intensidade local. Em seguida, clique no ícone Adicionar novos filamentos e selecione o algoritmo Autopath no menu suspenso.
Selecione a região de interesse e, em seguida, defina os pontos inicial e inicial atribuindo as medidas de diâmetro maior e mais fino que podem ser medidas usando o modo Slice. Atribua um ponto de partida na borda da região de interesse. Para obter a adição ou remoção manual de pontos de partida, primeiro altere o modo do ponteiro, navegue pela seleção e, em seguida, shift e clique com o botão direito do mouse nos pontos de interesse.
Em seguida, selecione limites manuais para pontos de semente para garantir que toda a arborização visível seja marcada. Em seguida, adicione ou remova manualmente os pontos de semente. Marque a caixa Remover segmentos desconectados e remover pontos iniciais ao redor dos pontos iniciais.
Em seguida, ajuste o limite para subtração de fundo e conclua o processo. É necessário remover artefatos de fundo e confirmar que o caminho do detector reflete a verdadeira arborização do axônio para uma quantificação precisa. No final, escolha o estilo e a cor desejados.
Na guia Estatísticas, selecione Detalhado e use o número do filamento, pontos terminais dendríticos para quantificar os terminais nervosos motores como um indicador de arborização do axônio motor. Em seguida, exporte a imagem do axônio reconstruído como um arquivo tiff. O LSFM fornece visualização 3D detalhada da arborização do axônio motor em embriões de camundongos.
Os neurônios motores são submetidos ao protocolo descrito acima e marcados com GFP expressa transgenicamente. Para obter imagens da arborização do axônio com mais detalhes e realizar a quantificação, a ampliação pode ser ajustada para que todas as estruturas finamente arborizadas possam ser reveladas. Finalmente, o padrão de arborização do axônio dos nervos individuais dos membros anteriores pode ser reconstruído usando software de análise de imagem.
O algoritmo de autopath no software rastreia o filamento e quantifica o número total de terminais de axônio. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras e obter imagens de axônios de neurônios motores de embriões de camundongos usando microscópio fluorescense de folha de luz. Além disso, você saberá como avaliar quantitativamente o padrão de arborização de cada nervo motor individual por MRS.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para visualizar a projeção de neurônios motores e arborização de axônios em embriões de camundongos transgênicos Hb9::GFP. Usando microscopia de fluorescência em folha de luz, o método permite avaliações qualitativas e quantitativas dos padrões de axônios, avançando a compreensão do desenvolvimento de neurônios motores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neurodesenvolvimento
- Técnicas de Imagem
Fundo
- O protocolo se concentra em neurônios motores, vitais para coordenar movimentos complexos.
- A arborização do axônio do neurônio motor é crítica para a circuitaria neural funcional.
- Entender esses padrões pode revelar insights sobre processos de neurodesenvolvimento.
Propósito do Estudo
- Visualizar e analisar quantitativamente a arborização do axônio do neurônio motor.
- Estabelecer um método que possa ser adaptado para outros processos de navegação neuronal.
- Aprimorar nossa compreensão do desenvolvimento de neurônios motores em embriões de camundongos.
Métodos Utilizados
- A plataforma principal utilizada é a microscopia de fluorescência em folha de luz.
- Embriões de camundongos expressando GFP sob o promotor Hb9 servem como modelo biológico.
- Os embriões são preparados através de técnicas de imunocoloração e clarificação antes da imagem.
- Passos críticos envolvem fixação, permeabilização e incubação com anticorpos das amostras.
Principais Resultados
- As descobertas confirmam a capacidade de visualizar detalhes finos da arborização de axônios em 3D.
- A análise quantitativa facilita a avaliação dos padrões de arborização de nervos motores individuais.
- Este método permite ajustes na magnificação para revelar estruturas intrincadas.
Conclusões
- O estudo demonstra um protocolo robusto para analisar o desenvolvimento de neurônios motores.
- O método aprimora insights sobre o comportamento neuronal e potencial aplicação em outros estudos.
- As descobertas contribuem para uma compreensão mais ampla dos mecanismos neurais subjacentes ao movimento.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Visualizing motor axon navigation and arborization in mouse embryos provides mechanistic insights into neurodevelopmental processes relevant to target validation in neurodegenerative disease models. Quantitative assessment of axon terminal patterns supports predictive confidence in evaluating genetic or pharmacological interventions affecting motor neuron connectivity. This approach enables early de-risking of therapeutic hypotheses by linking molecular perturbations to structural phenotypes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing motor axon trajectory defects in genetic mutants or disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative analysis of axon arborization as a phenotypic readout.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by correlating molecular changes with neurodevelopmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible 3D imaging data suitable for high-content screening of compound libraries.
- Quantitative Output: Provides filament number and terminal point measurements enabling dose-response analysis of axon growth inhibitors or enhancers.
- Scalability: Compatible with clearing and immunostaining workflows adaptable to multi-well embryo processing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to motor neuron disease models (e.g., ALS, SMA) using Hb9::GFP reporter lines to assess axonal pathology.
- Translational Continuity: Bridges discovery phenotypes to preclinical validation by quantifying arborization deficits predictive of functional impairment.
- Biomarker Alignment: Axon terminal counts serve as quantifiable histopathological endpoints correlating with motor circuit integrity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing structural phenotyping downstream of target engagement and upstream of functional behavioral assays in motor neuron disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of axon guidance molecules via qualitative and quantitative arborization profiling.
- Screening: Enables assay standardization through consistent clearing, staining, and imaging parameters across genetic backgrounds.
- Analytics: Generates morphometric data (filament count, terminal points) for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural phenotypes to functional outcomes in preclinical models of motor neuron degeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for neurodevelopmental and neurodegeneration programs across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in motor neuron development studies through direct visualization of axon patterning.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized fixation, clearing, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural validation of target modulation in neurodevelopmental pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on axon arborization profiles in disease-relevant embryonic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, immunostaining, and optical clearing techniques.
- Dependent on access to light sheet fluorescence microscopy and compatible image analysis software (e.g., Imaris).
- Necessitates standardization of antibody incubation and washing steps to minimize variability in GFP signal detection.
- Adaptation to alternative models may require optimization of clearing reagents and refractive index matching.
- Practical limitations include embryo size constraints and potential signal quenching during prolonged clearing or storage.
