Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz

O objetivo geral deste protocolo é permitir a avaliação qualitativa e quantitativa dos padrões de arborização do axônio do neurônio motor usando microscópio de folha de luz e software de análise de imagem em embriões de camundongos. Este método pode ajudar a entender o desenvolvimento do neurônio motor em coordenação com movimentos complexos. A principal vantagem dessa técnica é que você pode observar e visualizar padrões de arborização de axônios de neurônios motores de vários ângulos e analisar quantitativamente cada nervo individual.

Demonstrando o procedimento estarão Ya-Ping Yen e Ee Shan Liau, dois alunos de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, fixe os embriões individualmente em uma placa de 24 poços com um mililitro de paraformaldeído a 4% recém-preparado em PBS por poço a quatro graus Celsius em um shaker durante a noite. No dia seguinte, lave os embriões fixados pelo menos três vezes, cada uma por cinco a 10 minutos, com um mililitro de 1X PBS e incube-os durante a noite a quatro graus Celsius.

Em seguida, permeabilize cada embrião em um mililitro de 0,5% PBST durante a noite a quatro graus Celsius em um shaker. Bloqueie cada amostra com um mililitro de 10% FBS preparado em 1X PBS durante a noite a 4 graus Celsius em um shaker. Em seguida, incubar cada embrião com um mililitro de anticorpo primário anti-GFP a 4 graus Celsius por 72 horas com agitação constante.

Após a incubação do anticorpo primário, lave cada embrião com um mililitro de 0,5% PBST ao longo de um a dois dias a quatro graus Celsius em um shaker. Depois, aplique um mililitro de anticorpo secundário e incube durante a noite no escuro a quatro graus Celsius com agitação constante. No dia seguinte, lave cada embrião com um mililitro de 0,5% PBST pelo menos três vezes a quatro graus Celsius em uma coqueteleira ao longo de dois a três dias.

Em seguida, incube cada embrião em um reagente comercial de limpeza com um índice de refração de 1,49 nd em um tubo de 1,5 mililitro protegido da luz à temperatura ambiente durante a noite. Configure a óptica de iluminação 5X/0.1 e a óptica de detecção 5X/0.16. Monte o porta-amostras e o capilar da amostra.

Preparar a câmara de recolha de amostras enchendo-a com uma solução de limpeza. Para montar o embrião, prepare uma ponta de pipeta P200 cortando a parte superior de modo que ela se ajuste ao diâmetro do capilar e remova a parte pontiaguda para a fixação da amostra. Em seguida, derreta a extremidade embotada da ponta da pipeta usando uma pequena chama.

Apague a chama e prenda rapidamente o embrião verticalmente na extremidade derretida. Encaixe a parte superior da ponta da pipeta com o capilar de amostra e coloque a câmara de amostra preparada no microscópio. Usando o software de imagem, selecione Localizar capilar na guia Localizar e ajuste os eixos X, Y e Z.

Em seguida, selecione Localizar amostra e amplie para 0,6X para focar no embrião. Deixe o tampão da câmara se equilibrar com o embrião por algum tempo para limpar quaisquer detritos ou bolhas. Para aquisição de imagem na guia Aquisição, defina os parâmetros do caminho de luz, como Detetive

Marque a caixa de seleção Varredura dinâmica para redução de sombra. Em seguida, defina as configurações de aquisição, Bit Bepth para 16 bits, Zoom para a faixa entre 0,36 e 0,7X, iluminação de local único ou iluminação de local duplo. Clique em Contínuo e defina a Intensidade do laser, o Tempo de exposição, a Potência do laser e a Posição da folha de luz.

Em seguida, pressione Parar para encerrar a aquisição da imagem. É importante garantir que a amostra transparente seja posicionada dentro do caminho de luz mais curto para permitir a aquisição detalhada de imagens de estruturas arborizadas finas em nervos motores individuais. Para aquisição multidimensional, defina a pilha Z movendo a posição z para a primeira e a última imagem.

Clique em Ideal para definir o número da fatia. Em seguida, clique em Iniciar experimento para adquirir a pilha Z selecionada. Quando terminar, salve a imagem no formato czi.

Para quantificar a arborização do axônio, abra o arquivo de imagem no software de análise de imagem. Ajuste a cor, o brilho e o contraste da imagem usando a janela Ajuste de Exibição para detectar filamentos com base no contraste de intensidade local. Em seguida, clique no ícone Adicionar novos filamentos e selecione o algoritmo Autopath no menu suspenso.

Selecione a região de interesse e, em seguida, defina os pontos inicial e inicial atribuindo as medidas de diâmetro maior e mais fino que podem ser medidas usando o modo Slice. Atribua um ponto de partida na borda da região de interesse. Para obter a adição ou remoção manual de pontos de partida, primeiro altere o modo do ponteiro, navegue pela seleção e, em seguida, shift e clique com o botão direito do mouse nos pontos de interesse.

Em seguida, selecione limites manuais para pontos de semente para garantir que toda a arborização visível seja marcada. Em seguida, adicione ou remova manualmente os pontos de semente. Marque a caixa Remover segmentos desconectados e remover pontos iniciais ao redor dos pontos iniciais.

Em seguida, ajuste o limite para subtração de fundo e conclua o processo. É necessário remover artefatos de fundo e confirmar que o caminho do detector reflete a verdadeira arborização do axônio para uma quantificação precisa. No final, escolha o estilo e a cor desejados.

Na guia Estatísticas, selecione Detalhado e use o número do filamento, pontos terminais dendríticos para quantificar os terminais nervosos motores como um indicador de arborização do axônio motor. Em seguida, exporte a imagem do axônio reconstruído como um arquivo tiff. O LSFM fornece visualização 3D detalhada da arborização do axônio motor em embriões de camundongos.

Os neurônios motores são submetidos ao protocolo descrito acima e marcados com GFP expressa transgenicamente. Para obter imagens da arborização do axônio com mais detalhes e realizar a quantificação, a ampliação pode ser ajustada para que todas as estruturas finamente arborizadas possam ser reveladas. Finalmente, o padrão de arborização do axônio dos nervos individuais dos membros anteriores pode ser reconstruído usando software de análise de imagem.

O algoritmo de autopath no software rastreia o filamento e quantifica o número total de terminais de axônio. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras e obter imagens de axônios de neurônios motores de embriões de camundongos usando microscópio fluorescense de folha de luz. Além disso, você saberá como avaliar quantitativamente o padrão de arborização de cada nervo motor individual por MRS.