Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz
11 de maio de 2018
Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização de projeção dos neurônios motores e arborização do axônio em embriões de rato transgénicos Hb9::GFP . Depois de imunocoloração para os neurônios motores, usamos a microscopia de fluorescência folha de luz aos embriões de imagem para posterior análise quantitativa. Este protocolo é aplicável a outros processos de navegação do neurônio no sistema nervoso central.
O objetivo geral deste protocolo é permitir a avaliação qualitativa e quantitativa dos padrões de arborização do axônio do neurônio motor usando microscópio de folha de luz e software de análise de imagem em embriões de camundongos. Este método pode ajudar a entender o desenvolvimento do neurônio motor em coordenação com movimentos complexos. A principal vantagem dessa técnica é que você pode observar e visualizar padrões de arborização de axônios de neurônios motores de vários ângulos e analisar quantitativamente cada nervo individual.
Demonstrando o procedimento estarão Ya-Ping Yen e Ee Shan Liau, dois alunos de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, fixe os embriões individualmente em uma placa de 24 poços com um mililitro de paraformaldeído a 4% recém-preparado em PBS por poço a quatro graus Celsius em um shaker durante a noite. No dia seguinte, lave os embriões fixados pelo menos três vezes, cada uma por cinco a 10 minutos, com um mililitro de 1X PBS e incube-os durante a noite a quatro graus Celsius.
Em seguida, permeabilize cada embrião em um mililitro de 0,5% PBST durante a noite a quatro graus Celsius em um shaker. Bloqueie cada amostra com um mililitro de 10% FBS preparado em 1X PBS durante a noite a 4 graus Celsius em um shaker. Em seguida, incubar cada embrião com um mililitro de anticorpo primário anti-GFP a 4 graus Celsius por 72 horas com agitação constante.
Após a incubação do anticorpo primário, lave cada embrião com um mililitro de 0,5% PBST ao longo de um a dois dias a quatro graus Celsius em um shaker. Depois, aplique um mililitro de anticorpo secundário e incube durante a noite no escuro a quatro graus Celsius com agitação constante. No dia seguinte, lave cada embrião com um mililitro de 0,5% PBST pelo menos três vezes a quatro graus Celsius em uma coqueteleira ao longo de dois a três dias.
Em seguida, incube cada embrião em um reagente comercial de limpeza com um índice de refração de 1,49 nd em um tubo de 1,5 mililitro protegido da luz à temperatura ambiente durante a noite. Configure a óptica de iluminação 5X/0.1 e a óptica de detecção 5X/0.16. Monte o porta-amostras e o capilar da amostra.
Preparar a câmara de recolha de amostras enchendo-a com uma solução de limpeza. Para montar o embrião, prepare uma ponta de pipeta P200 cortando a parte superior de modo que ela se ajuste ao diâmetro do capilar e remova a parte pontiaguda para a fixação da amostra. Em seguida, derreta a extremidade embotada da ponta da pipeta usando uma pequena chama.
Apague a chama e prenda rapidamente o embrião verticalmente na extremidade derretida. Encaixe a parte superior da ponta da pipeta com o capilar de amostra e coloque a câmara de amostra preparada no microscópio. Usando o software de imagem, selecione Localizar capilar na guia Localizar e ajuste os eixos X, Y e Z.
Em seguida, selecione Localizar amostra e amplie para 0,6X para focar no embrião. Deixe o tampão da câmara se equilibrar com o embrião por algum tempo para limpar quaisquer detritos ou bolhas. Para aquisição de imagem na guia Aquisição, defina os parâmetros do caminho de luz, como Detetive
Marque a caixa de seleção Varredura dinâmica para redução de sombra. Em seguida, defina as configurações de aquisição, Bit Bepth para 16 bits, Zoom para a faixa entre 0,36 e 0,7X, iluminação de local único ou iluminação de local duplo. Clique em Contínuo e defina a Intensidade do laser, o Tempo de exposição, a Potência do laser e a Posição da folha de luz.
Em seguida, pressione Parar para encerrar a aquisição da imagem. É importante garantir que a amostra transparente seja posicionada dentro do caminho de luz mais curto para permitir a aquisição detalhada de imagens de estruturas arborizadas finas em nervos motores individuais. Para aquisição multidimensional, defina a pilha Z movendo a posição z para a primeira e a última imagem.
Clique em Ideal para definir o número da fatia. Em seguida, clique em Iniciar experimento para adquirir a pilha Z selecionada. Quando terminar, salve a imagem no formato czi.
Para quantificar a arborização do axônio, abra o arquivo de imagem no software de análise de imagem. Ajuste a cor, o brilho e o contraste da imagem usando a janela Ajuste de Exibição para detectar filamentos com base no contraste de intensidade local. Em seguida, clique no ícone Adicionar novos filamentos e selecione o algoritmo Autopath no menu suspenso.
Selecione a região de interesse e, em seguida, defina os pontos inicial e inicial atribuindo as medidas de diâmetro maior e mais fino que podem ser medidas usando o modo Slice. Atribua um ponto de partida na borda da região de interesse. Para obter a adição ou remoção manual de pontos de partida, primeiro altere o modo do ponteiro, navegue pela seleção e, em seguida, shift e clique com o botão direito do mouse nos pontos de interesse.
Em seguida, selecione limites manuais para pontos de semente para garantir que toda a arborização visível seja marcada. Em seguida, adicione ou remova manualmente os pontos de semente. Marque a caixa Remover segmentos desconectados e remover pontos iniciais ao redor dos pontos iniciais.
Em seguida, ajuste o limite para subtração de fundo e conclua o processo. É necessário remover artefatos de fundo e confirmar que o caminho do detector reflete a verdadeira arborização do axônio para uma quantificação precisa. No final, escolha o estilo e a cor desejados.
Na guia Estatísticas, selecione Detalhado e use o número do filamento, pontos terminais dendríticos para quantificar os terminais nervosos motores como um indicador de arborização do axônio motor. Em seguida, exporte a imagem do axônio reconstruído como um arquivo tiff. O LSFM fornece visualização 3D detalhada da arborização do axônio motor em embriões de camundongos.
Os neurônios motores são submetidos ao protocolo descrito acima e marcados com GFP expressa transgenicamente. Para obter imagens da arborização do axônio com mais detalhes e realizar a quantificação, a ampliação pode ser ajustada para que todas as estruturas finamente arborizadas possam ser reveladas. Finalmente, o padrão de arborização do axônio dos nervos individuais dos membros anteriores pode ser reconstruído usando software de análise de imagem.
O algoritmo de autopath no software rastreia o filamento e quantifica o número total de terminais de axônio. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras e obter imagens de axônios de neurônios motores de embriões de camundongos usando microscópio fluorescense de folha de luz. Além disso, você saberá como avaliar quantitativamente o padrão de arborização de cada nervo motor individual por MRS.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para visualizar a projeção de neurônios motores e a arborização axonal em embriões de camundongos transgênicos Hb9::GFP. Utilizando microscopia de folha de luz com fluorescência, o método permite avaliações qualitativas e quantitativas dos padrões axonais, avançando o entendimento do desenvolvimento dos neurônios motores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neurodesenvolvimento
- Técnicas de Imagem
Contexto
- O protocolo foca nos neurônios motores, essenciais para coordenar movimentos complexos.
- A arborização axonal dos neurônios motores é fundamental para a formação de circuitos neurais funcionais.
- Compreender esses padrões pode revelar informações sobre os processos neurodesenvolvimentais.
Objetivo do Estudo
- Visualizar e analisar quantitativamente a arborização axonal de neurônios motores.
- Estabelecer um método que possa ser adaptado para outros processos de navegação neuronal.
- Ampliar nossa compreensão do desenvolvimento de neurônios motores em embriões de camundongo.
Métodos Utilizados
- A plataforma principal utilizada é a microscopia de folha de luz com fluorescência.
- Embriões de camundongo que expressam GFP sob o promotor Hb9 servem como modelo biológico.
- Os embriões são preparados por meio de técnicas de imunomarcação e clareamento antes da aquisição de imagens.
- Os passos críticos envolvem fixação, permeabilização e incubação com anticorpos das amostras.
Resultados Principais
- Os resultados confirmam a capacidade de visualizar detalhes finos da arborização axonal em 3D.
- A análise quantitativa facilita a avaliação dos padrões de arborização de nervos motores individuais.
- Este método permite ajustes na ampliação para revelar estruturas intricadas.
Conclusões
- O estudo demonstra um protocolo robusto para analisar o desenvolvimento de neurônios motores.
- O método aprimora o entendimento sobre o comportamento dos neurônios e sua aplicação potencial em outros estudos.
- Os achados contribuem para uma compreensão mais ampla dos mecanismos neurais subjacentes ao movimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A visualização da navegação e arborização de axônios motores em embriões de camundongo fornece subsídios mecanicistas sobre processos neurodesenvolvimentais relevantes para a validação de alvos em modelos de doenças neurodegenerativas. A avaliação quantitativa dos padrões terminais dos axônios sustenta a confiança preditiva na análise de intervenções genéticas ou farmacológicas que afetam a conectividade dos neurônios motores. Esta abordagem permite a redução precoce de riscos em hipóteses terapêuticas ao associar perturbações moleculares a fenótipos estruturais em um sistema relevante para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização de defeitos na trajetória de axônios motores em mutantes genéticos ou modelos de doenças.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da análise quantitativa da arborização axonal como leitura fenotípica.
- Valor Preditivo: Facilita a redução de riscos mecanicistas ao correlacionar alterações moleculares com desfechos neurodesenvolvimentais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera dados padronizados e reproduzíveis de imagem 3D adequados para triagem de alta densidade de bibliotecas de compostos.
- Saída Quantitativa: Fornece medições do número de filamentos e de pontos terminais, permitindo análise dose-resposta de inibidores ou potenciadores do crescimento axonal.
- Escalabilidade: Compatível com protocolos de clareamento e imunomarcação adaptáveis ao processamento de embriões em placas de múltiplas poças.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicável diretamente a modelos de doenças dos neurônios motores (por exemplo, ELA, AEM) que utilizam linhagens repórter Hb9::GFP para avaliar a patologia axonal.
- Continuidade Translacional: Conecta fenótipos descobertos à validação pré-clínica ao quantificar déficits de arborização preditivos de comprometimento funcional.
- Alinhamento com Biomarcadores: A contagem de terminações axônicas serve como pontos finais histopatológicos quantificáveis, correlacionando-se com a integridade do circuito motor.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho iniciais de descoberta ao fornecer fenotipagem estrutural após o engajamento do alvo e antes dos ensaios comportamentais funcionais em modelos de doenças dos neurônios motores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre moléculas de orientação axonal por meio de perfis qualitativos e quantitativos da arborização.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio de parâmetros consistentes de clareamento, coloração e aquisição de imagens em diferentes origens genéticas.
- Análises: Gera dados morfométricos (contagem de filamentos, pontos terminais) para comparação estatística entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona fenótipos estruturais com resultados funcionais em modelos pré-clínicos de degeneração de neurônios motores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável para programas de neurodesenvolvimento e neurodegeneração em diversas áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em estudos sobre o desenvolvimento de neurônios motores por meio da visualização direta do padrão de axônios.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de fixação, clareamento e imagem aplicáveis em diferentes laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou interromper projetos ao fornecer validação estrutural da modulação de alvos em vias neurodesenvolvimentais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em perfis de arborização axonal em sistemas embrionários relevantes para doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de embriões, imunomarcação e técnicas de clareamento óptico.
- Depende do acesso à microscopia de folha de luz com fluorescência e software compatível de análise de imagens (por exemplo, Imaris).
- Necessita padronização das etapas de incubação com anticorpos e lavagens para minimizar a variabilidade na detecção do sinal GFP.
- A adaptação a modelos alternativos pode exigir otimização dos reagentes de clareamento e do ajuste do índice de refração.
- As limitações práticas incluem restrições relacionadas ao tamanho do embrião e possível atenuação do sinal durante clareamento prolongado ou armazenamento.
