Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.

Este protocolo é significativo porque estamos aprendendo que a glia é regionalmente heterogênea, morfológica, funcional e geneticamente. A principal vantagem dessa técnica é que você pode estudar três subconjuntos separados de glia de quatro regiões distintas do sistema nervoso central. Demonstrando esse procedimento estaremos eu e Rachel Tinky, uma estudante de pós-graduação em meu laboratório.

Use uma tesoura fina para cortar a camada cutânea ao longo da linha média da cabeça do filhote, começando caudalmente e movendo-se rostral até atingir o focinho. Evite cortar profundamente o crânio para evitar qualquer dano ao tecido. Inclinando a cabeça para baixo, puxe a camada cutânea para cada lado do crânio e use uma tesoura de mola para fazer uma incisão ao longo da linha média do crânio, começando no forame magno.

Separe as metades do crânio com uma pinça de ponta fina, expondo o córtex, o cerebelo e o tronco cerebral. Uma vez exposto, levante suavemente o cérebro para fora do crânio e coloque-o em uma placa de Petri de 10 centímetros com 10 mililitros de PBS e solução antibiótica. Certifique-se de que o cérebro permaneça intacto com o cérebro posterior conectado.

Retire o cerebelo com uma pinça de ponta curva fina. Coloque em um tubo cônico designado de 15 mililitros no gelo. Separe o mesencéfalo do córtex.

Remova as meninges corticais e coloque-as em um tubo cônico designado. O tecido deve ser cuidadosamente examinado para garantir a remoção completa das meninges. Se as células meníngeas permanecerem na cultura, elas podem ser prejudiciais ao crescimento das células gliais.

Para dissecar a medula espinhal, coloque-a com o lado ventral para cima e use uma tesoura fina para cortar as vértebras, alternando entre os lados esquerdo e direito até que o tecido da medula espinhal fique exposto. Remova suavemente a medula espinhal e as meninges e coloque-as no tubo cônico designado no gelo. Adicione um mililitro de 0,05% de tripsina com 0,53 milimolar de EDTA a cada tubo com tecido.

Triturar a mistura com uma pipeta de 10 mililitros aproximadamente 20 vezes. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico vazio de 50 mililitros. Incube a solução a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 15 minutos.

Agitando suavemente os lisados após oito minutos. Após a incubação, adicione cinco mililitros de MGM e 200 microlitros de DNase I, um a cada tubo, para uma concentração final de 50 microgramas por mililitro. Triturar cada lisado 10 vezes com uma pipeta de 10 mililitros.

Em seguida, deixe a suspensão celular descansar por três minutos em temperatura ambiente para permitir que o tecido não dissociado se deposite no fundo do tubo. Transferir as suspensões celulares para novos tubos cônicos de 50 mililitros, deixando para trás o tecido não dissociado. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de MGM e triture-o 20 vezes Coloque as suspensões celulares em frascos T25 revestidos e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Troque a mídia após 24 horas para remover os detritos celulares. Para realizar o isolamento das células precursoras de oligodendrócitos, agite as células por 15 horas, remova o sobrenadante do frasco e coloque-o em uma placa de Petri estéril. Incube o sobrenadante a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos.

Girando após 15 minutos para remover a micróglia restante. Remova o sobrenadante celular não aderente, conte as células e coloque-as em uma superfície revestida com Poli-D-Lisina na concentração desejada. Retorne as células à incubadora por pelo menos uma hora.

Em seguida, aspire suavemente 95% do meio e adicione lentamente o meio OPC quente, pipetando-o contra a parede do poço para minimizar a interrupção dos OPCs. Este método foi usado para demonstrar que a sinalização gama de interferon influencia a diferenciação e maturação do OPC. Sem o receptor de interferon gama, as OPCs corticais não se diferenciam em oligodendrócitos mielinizantes maduros, diz prontamente, o que é evidenciado pela ausência de coloração MBP.

A expressão de GFAP também foi analisada. As células deficientes em gamainterferon expressam fortemente GFAP, sugerindo que elas podem estar adotando um fenótipo astrocítico. A heterogeneidade regional nas células do SNC é evidenciada pela variação da morfologia dos astrócitos no córtex, cerebelo, tronco encefálico e medula espinhal.

Os astrócitos da mesma região também podem exibir heterogeneidade morfológica, apoiando a noção de que esse subtipo glial é altamente dinâmico. As respostas regionais das OPCs à estimulação diferencial de citocinas também foram exploradas. A sinalização de citocinas influencia significativamente o comportamento das células-tronco e do sistema imunológico e pode afetar a forma como os OPCs se diferenciam em oligodendrócitos mielinizantes maduros.

Após o isolamento regional das células gliais, as células podem ser usadas em uma variedade de condições experimentais e ácidas usando várias técnicas, incluindo imuno-histoquímica, PCR quantitativo em tempo real e Western blotting.