Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central
4 de junho de 2020
Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.
Este protocolo é significativo porque estamos aprendendo que a glia é regionalmente heterogênea, morfológica, funcional e geneticamente. A principal vantagem dessa técnica é que você pode estudar três subconjuntos separados de glia de quatro regiões distintas do sistema nervoso central. Demonstrando esse procedimento estaremos eu e Rachel Tinky, uma estudante de pós-graduação em meu laboratório.
Use uma tesoura fina para cortar a camada cutânea ao longo da linha média da cabeça do filhote, começando caudalmente e movendo-se rostral até atingir o focinho. Evite cortar profundamente o crânio para evitar qualquer dano ao tecido. Inclinando a cabeça para baixo, puxe a camada cutânea para cada lado do crânio e use uma tesoura de mola para fazer uma incisão ao longo da linha média do crânio, começando no forame magno.
Separe as metades do crânio com uma pinça de ponta fina, expondo o córtex, o cerebelo e o tronco cerebral. Uma vez exposto, levante suavemente o cérebro para fora do crânio e coloque-o em uma placa de Petri de 10 centímetros com 10 mililitros de PBS e solução antibiótica. Certifique-se de que o cérebro permaneça intacto com o cérebro posterior conectado.
Retire o cerebelo com uma pinça de ponta curva fina. Coloque em um tubo cônico designado de 15 mililitros no gelo. Separe o mesencéfalo do córtex.
Remova as meninges corticais e coloque-as em um tubo cônico designado. O tecido deve ser cuidadosamente examinado para garantir a remoção completa das meninges. Se as células meníngeas permanecerem na cultura, elas podem ser prejudiciais ao crescimento das células gliais.
Para dissecar a medula espinhal, coloque-a com o lado ventral para cima e use uma tesoura fina para cortar as vértebras, alternando entre os lados esquerdo e direito até que o tecido da medula espinhal fique exposto. Remova suavemente a medula espinhal e as meninges e coloque-as no tubo cônico designado no gelo. Adicione um mililitro de 0,05% de tripsina com 0,53 milimolar de EDTA a cada tubo com tecido.
Triturar a mistura com uma pipeta de 10 mililitros aproximadamente 20 vezes. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico vazio de 50 mililitros. Incube a solução a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 15 minutos.
Agitando suavemente os lisados após oito minutos. Após a incubação, adicione cinco mililitros de MGM e 200 microlitros de DNase I, um a cada tubo, para uma concentração final de 50 microgramas por mililitro. Triturar cada lisado 10 vezes com uma pipeta de 10 mililitros.
Em seguida, deixe a suspensão celular descansar por três minutos em temperatura ambiente para permitir que o tecido não dissociado se deposite no fundo do tubo. Transferir as suspensões celulares para novos tubos cônicos de 50 mililitros, deixando para trás o tecido não dissociado. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de MGM e triture-o 20 vezes Coloque as suspensões celulares em frascos T25 revestidos e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Troque a mídia após 24 horas para remover os detritos celulares. Para realizar o isolamento das células precursoras de oligodendrócitos, agite as células por 15 horas, remova o sobrenadante do frasco e coloque-o em uma placa de Petri estéril. Incube o sobrenadante a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos.
Girando após 15 minutos para remover a micróglia restante. Remova o sobrenadante celular não aderente, conte as células e coloque-as em uma superfície revestida com Poli-D-Lisina na concentração desejada. Retorne as células à incubadora por pelo menos uma hora.
Em seguida, aspire suavemente 95% do meio e adicione lentamente o meio OPC quente, pipetando-o contra a parede do poço para minimizar a interrupção dos OPCs. Este método foi usado para demonstrar que a sinalização gama de interferon influencia a diferenciação e maturação do OPC. Sem o receptor de interferon gama, as OPCs corticais não se diferenciam em oligodendrócitos mielinizantes maduros, diz prontamente, o que é evidenciado pela ausência de coloração MBP.
A expressão de GFAP também foi analisada. As células deficientes em gamainterferon expressam fortemente GFAP, sugerindo que elas podem estar adotando um fenótipo astrocítico. A heterogeneidade regional nas células do SNC é evidenciada pela variação da morfologia dos astrócitos no córtex, cerebelo, tronco encefálico e medula espinhal.
Os astrócitos da mesma região também podem exibir heterogeneidade morfológica, apoiando a noção de que esse subtipo glial é altamente dinâmico. As respostas regionais das OPCs à estimulação diferencial de citocinas também foram exploradas. A sinalização de citocinas influencia significativamente o comportamento das células-tronco e do sistema imunológico e pode afetar a forma como os OPCs se diferenciam em oligodendrócitos mielinizantes maduros.
Após o isolamento regional das células gliais, as células podem ser usadas em uma variedade de condições experimentais e ácidas usando várias técnicas, incluindo imuno-histoquímica, PCR quantitativo em tempo real e Western blotting.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para o isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais do sistema nervoso central (SNC) de camundongo, incluindo micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos. A metodologia permite o estudo dos fenótipos distintos de cada tipo celular glial em diversos sistemas de cultura, destacando sua heterogeneidade regional.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia de Células Gliais
Contexto
- As células gliais exibem heterogeneidade regional na morfologia, função e genética.
- Compreender as populações distintas de células gliais é essencial para explorar seus papéis no SNC.
- Este protocolo permite aos pesquisadores estudar a interação entre diferentes tipos de células gliais.
- O isolamento de populações distintas pode fornecer informações sobre suas contribuições específicas para a função do SNC.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para isolar populações específicas de células gliais de diferentes regiões do SNC.
- Investigar as características fenotípicas das populações gliais isoladas.
- Examinar as respostas regionais de precursores de oligodendrócitos à estimulação por citocinas.
Métodos Utilizados
- A metodologia de cultivo celular in vitro foi empregada para o isolamento de células gliais.
- O modelo biológico inclui células gliais derivadas de fragmentos do SNC de camundongo.
- Nenhum fluxo de trabalho de multiômica foi mencionado.
- Os passos principais incluem técnicas de dissecção, tripsinização e preparo de suspensão celular.
- Os períodos de incubação e plating celular foram definidos para obter resultados ideais.
Resultados Principais
- O protocolo isolou com sucesso populações distintas de células gliais de diferentes regiões do SNC.
- O estudo observou que o sinal da interferona gama influencia a diferenciação das células precursoras de oligodendrócitos.
- Os astrócitos exibiram heterogeneidade morfológica com base na sua região de origem no SNC.
- Foram destacadas implicações potenciais para o entendimento de como o sinal das citocinas afeta o comportamento das células gliais.
Conclusões
- Este estudo demonstra um método valioso para dissecar o papel das células gliais na função do SNC.
- Ao permitir o isolamento de subconjuntos específicos de células gliais, os pesquisadores podem compreender melhor suas contribuições únicas.
- Este protocolo apoia investigações futuras sobre a dinâmica das células gliais e sua resposta a sinais ambientais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A heterogeneidade regional das células gliais impacta a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos para o SNC. Este protocolo permite o isolamento de micróglias, células progenitoras de oligodendrócitos e astrócitos de quatro regiões do SNC murino para apoiar triagem fenotípica e desenvolvimento de ensaios. Ao fornecer sistemas relevantes para a doença com composição celular definida, melhora a confiabilidade preditiva em modelos pré-clínicos e orienta estratégias de identificação de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de fenótipos de subconjuntos de células gliais nas regiões cortical, cerebelar, do tronco encefálico e medular para esclarecer a biologia do alvo e reduzir os riscos de hipóteses mecanicistas.
- Valor Operacional: Oferece o isolamento reprodutível de micróglias, OPCs e astrócitos para estudos consistentes de engajamento do alvo e modulação de vias.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera culturas gliais com definição regional para triagem de compostos e avaliação dos efeitos mediados por citocinas na diferenciação e maturação de OPCs.
- Valor Operacional: Padroniza o preparo de células gliais por meio de dissociação mecânica e plaqueamento em matriz definida, garantindo prontidão para ensaios e escalabilidade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a avaliação das respostas gliais regionais ao interferon gama e outras citocinas, contribuindo para o alinhamento de biomarcadores e a relevância fisiopatológica.
- Valor Operacional: Permite sistemas de co-cultivo e de tipo celular único para modelar interações glianeurais e avaliar desfechos mediados por alvo em fluxos de trabalho pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer populações gliais validadas para validação de alvos, desenvolvimento de ensaios e redução de riscos mecanicistas antes da identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses sobre a heterogeneidade glial regional e as vias de sinalização de citocinas na modulação de alvos no SNC.
- Triagem: Fornece suspensões gliais padronizadas com composição celular definida para triagem reprodutível de compostos e leituras fenotípicas.
- Análises: Permite medições quantitativas da diferenciação glial, expressão de marcadores (por exemplo, MBP, GFAP) e respostas funcionais à estimulação por citocinas.
- Pesquisa Translacional: Conecta fenótipos gliais regionais a sistemas relevantes para doenças, apoiando decisões de avanço com ajuste de risco em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma escalável de isolamento glial aplicável a múltiplas regiões do SNC e condições experimentais para uso sustentado em P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos gliais por meio da redução da ambiguidade mecanicista e de insights funcionais específicos da região.
- Valor Operacional: Protocolos padronizados de dissociação, semeadura e separação celular garantem reprodutibilidade e escalabilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção ao esclarecer o engajamento de alvos gliais e reduzir riscos biológicos em estágios avançados em programas do SNC.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em dados de fenótipo glial regional e perfis de resposta a citocinas.
Considerações de Implementação
- É necessária experiência em neuroanatomia e dissecação estéril de tecidos para isolar regiões do SNC e remover as meninges sem contaminação.
- O acesso a centrífugas, pipetas, incubadoras de CO2 e frascos de cultura revestidos é necessário para a dissociação, semeadura e expansão de gliócitos.
- A padronização dos protocolos de tripsinização, tratamento com DNase e trituração entre equipes garante um rendimento e viabilidade consistentes de gliócitos.
- A adaptação a sistemas modelo alternativos (por exemplo, gliócitos derivados de iPSCs humanos) requer a validação de marcadores regionais e da eficiência de dissociação.
- As limitações incluem a necessidade de processamento rápido do tecido para manter a integridade dos gliócitos e evitar o supercrescimento de células meningeais em cultura.
