Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

O objetivo deste procedimento é isolar e cultivar com eficiência os neurônios primários do mesencéfalo ventral de roedores. Isso é feito dissecando primeiro o mesencéfalo de embriões de roedores. O segundo passo é isolar cuidadosamente o mesencéfalo ventral.

Em seguida, o tecido neuronal deve ser dissociado para produzir uma única suspensão celular. A etapa final é colocar os neurônios primários em um pequeno volume em lamínulas antes de transferir as células anexadas para uma placa de 24 poços tardiamente. Em última análise, a microscopia de anticorpos e imunofluorescência é usada para identificar os neurônios dopaminérgicos dentro da cultura.

Os neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo estão envolvidos em várias funções, incluindo o controle do movimento e da emoção na cognição e a secreção de recompensa do cérebro. Eles também estão implicados em condições neurológicas e neuropsiquiátricas, incluindo doença de Parkinson, vício e esquizofrenia. O método de reparo do mesencéfalo ventral.

As culturas neuronais podem ser usadas para estudar a fisiologia e as propriedades celulares dos neurônios dopaminérgicos, bem como para entender a causa de sua degeneração. Durante o curso de distúrbios como a doença de Parkinson. Primeiro, prepare as lamínulas.

Ferva-os em etanol a 70% por pelo menos 30 minutos para remover quaisquer vestígios de gordura. Em seguida, autoclave as lamínulas. Transfira as lamínulas para placas de 24 poços e adicione meio mililitro de poliol todo o ateno a cada uma.

Bem, deixe as placas incubarem por uma hora em temperatura ambiente. Observe que o prazo de validade da solução de poliol ou Athene de trabalho é de um mês. Em seguida, lave as lamínulas três vezes com meio mililitro de água por lavagem.

Sem as três lavagens, as células cultivadas não sobreviveriam 24 horas. Em seguida, repare a solução de laminina. Certifique-se de descongelá-lo lentamente no gelo.

Em seguida, dissolva a laminina em D-M-E-M-F 12 frio e use-a imediatamente. Agora, com meio mililitro de solução de laminina recém-feita para cada poço e deixe as placas incubarem durante a noite a 37 graus Celsius. Por fim, ao preparar a pipeta de vidro, poli suas pontas até a metade do tamanho normal.

Faça uma incisão abdominal para expor os sacos uterinos e, usando uma pinça, corte o útero. Transfira o útero para HBSS gelado em um prato de 100 milímetros e comece a remover os embriões com uma pinça. Transfira os embriões isolados para um novo prato de HBSS frio.

Agora, sob um microscópio de dissecação, prepare-se para acessar este local do mesencéfalo ventral com ampliação de 10x. Dissecar as medidas e o arco cefálico cortando o cérebro no istmo e a região limite cefálica e cefálica usando uma tesoura biológica ou fórceps. Depois de retirar todo o mesencéfalo, faça um corte no mesencéfalo dorsal medial.

Usando uma pinça, remova as meninges. Esta etapa é fundamental para o sucesso da cultura neuronal. As células não neuronais morrerão sob cultura e condições e sinalizarão adversamente os neurônios vizinhos.

Agora achate o tecido do mesencéfalo em forma de borboleta. Corte cerca de metade de cada asa com uma lâmina estéril deixando o mesencéfalo ventral. Transfira o mesencéfalo ventral para HBSS gelado em um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, prossiga para dissecar o próximo processo embrionário o maior número possível de embriões dentro de uma hora. Embriões mantidos no gelo por mais de uma hora têm baixa viabilidade celular. Para garantir a alta viabilidade dos neurônios dopaminérgicos, o tempo desde a dissecção até o plaqueamento não deve exceder uma hora.

Além disso, a remoção das meninges é crucial para a sobrevivência dos neurônios sob um capô. Remova o HBSS da coleção do mesencéfalo ventral. Em seguida, adicione um mililitro de 0,05% de tripsin A DTA quente, solução suficiente para 12 pedaços de tecido.

Incube o tecido a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. Sob o capô, substitua o tripsin A DTA por um mililitro de desativação. Inche suavemente para misturar e, em seguida, remova o meio de desativação, mas deixe meio suficiente para trás para que as células dissociadas não sejam descartadas.

Em seguida, lave os tecidos com meio completo duas vezes sem perder as células. Agora adicione um mililitro de meio completo. Em seguida, triturar o tecido com a pipeta polida a fogo sem formar bolhas até obter uma suspensão de célula única.

Cerca de oito a 10 passes devem ser suficientes. Após a duração, centrifugue as células de 400 Gs por cinco minutos. Remova o meio e ressuspenda as células em um mililitro de meio completo.

Pipete as células até quatro vezes para obter uma suspensão. Comece contando e avaliando a saúde das células da suspensão. Usando exclusão de triam blue com um hemocitômetro.

Agora ajuste a suspensão celular para 1500 células por microlitro. Em seguida, transfira as tampas esterilizadas dos tubos de microcentrífuga para pratos de 100 milímetros. Coloque as lamínulas preparadas nas tampas usando uma pinça.

Não lave as lamínulas e tente não deixá-las secar. Carregue 100 microlitros de suspensão em cada lamínula. Este método um tanto incomum fornece 90% de viabilidade da cultura e é um passo crítico para o sucesso.

Em seguida, feche a placa de Petri e transfira-a para a incubadora por uma hora após a incubação, transfira cuidadosamente as lamínulas com o meio para placas de 24 poços contendo 400 microlitros de meio completo quente a 37 graus Celsius em cada poço e incube as células durante a noite. As primeiras horas são as mais críticas para a sobrevivência celular em 24 horas. Adicione delicadamente meio mililitro de meio completo a cada poço.

A cada duas semanas. Mude metade da mídia. Se a cultura ficar amarela, a meia troca de meio pode ser realizada mais cedo, mas a mudança ainda deve ser pouco frequente.

Os neurônios dopaminérgicos sobreviverão por mais de seis semanas nessas condições. Após duas semanas de cultura, a imuno-histoquímica contra tirosina, hidroxilase e marcadores neuronais mostra que 1% das células são dopaminérgicas. As projeções neuronais aparecem dentro de duas horas após o revestimento.

No final do primeiro dia de cultura, axônios e dendritos são distinguíveis. Em última análise, os neurônios sobrevivem por mais de seis semanas e mostram crescimento extenso após este procedimento. Outros métodos como transdução viral, imunofluorescência ou eletrofisiologia podem ser realizados para responder a questões mecanicistas em neurônios dopaminérgicos.