Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic
19 de fevereiro de 2015
As causas da degeneração dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo durante a doença de Parkinson não são totalmente compreendidas. Os sistemas de cultura celular fornecem uma ferramenta essencial para o estudo das propriedades neurofisiológicas desses neurônios. Aqui apresentamos um protocolo otimizado, que pode ser utilizado para modelagem in vitro da neurodegeneração.
O objetivo deste procedimento é isolar e cultivar de forma eficiente neurônios primários do mesencéfalo ventral de roedores. Isso é realizado primeiramente dissecando o mesencéfalo de embriões de roedores. O segundo passo é isolar cuidadosamente o mesencéfalo ventral.
Em seguida, o tecido neuronal deve ser dissociado para obter uma suspensão de células isoladas. O passo final consiste em semear os neurônios primários em pequeno volume sobre lamínulas antes de transferir as células aderidas para uma placa de 24 poços posteriormente. Por fim, utiliza-se anticorpo e microscopia de imunofluorescência para identificar os neurônios dopaminérgicos dentro do cultivo.
Os neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo estão envolvidos em diversas funções, incluindo o controle do movimento e da emoção na cognição e no sistema de recompensa do cérebro. Eles também estão implicados em condições neurológicas e neuropsiquiátricas, como a doença de Parkinson, dependência química e esquizofrenia. O método de reparação do mesencéfalo ventral.
As culturas neuronais podem ser utilizadas para estudar a fisiologia e as propriedades celulares dos neurônios dopaminérgicos, bem como para compreender a causa de sua degeneração durante o curso de distúrbios como a doença de Parkinson. Primeiro, prepare as lamínulas.
Ferva-os em etanol 70% por pelo menos 30 minutos para remover qualquer vestígio de graxa. Em seguida, esterilize as lamínulas em autoclave. Transfira as lamínulas para placas de 24 poços e adicione meio mililitro de poliol alcatene a cada poço.
Bem, deixe as placas incubarem por uma hora à temperatura ambiente. Observe que a vida útil da solução de poliol ou de Athene é de um mês. Em seguida, lave as lamínulas três vezes com meio mililitro de água por lavagem.
Sem as três lavagens, as células cultivadas não sobreviveriam por 24 horas. Em seguida, prepare a solução de laminina. Certifique-se de descongelá-la lentamente sobre gelo.
Em seguida, dissolva a laminina em D-M-E-M-F 12 frio e utilize-a imediatamente. Adicione agora meio mililitro da solução de trabalho de laminina recém-preparada a cada poço e deixe as placas incubarem durante a noite a 37 graus Celsius. Por fim, ao preparar a pipeta de vidro, polimento as pontas até a metade do tamanho normal.
Realize uma incisão abdominal para expor os sacos uterinos e, com o auxílio de pinça, solte o útero. Transfira o útero para HBSS gelado em uma placa de 100 milímetros e comece a remover os embriões com pinça. Transfira os embriões isolados para uma nova placa com HBSS frio.
Agora, sob um microscópio estereoscópico, prepare-se para acessar esta região do mesencéfalo ventral com uma ampliação de 10x. Disseque a região do mesencéfalo e do arco cefálico cortando o cérebro no istmo e na região limite entre o mesencéfalo e o diencéfalo cefálico, utilizando tesoura cirúrgica ou pinça. Após remover todo o mesencéfalo, faça um corte no mesencéfalo dorsal medial.
Usando pinças, remova as meninges. Esta etapa é fundamental para o sucesso do cultivo neuronal. Células não neuronais morrerão em cultura e emitirão sinais prejudiciais para os neurônios vizinhos.
Agora achate o tecido do mesencéfalo em formato de borboleta. Corte cerca da metade de cada asa com uma lâmina estéril, deixando o mesencéfalo ventral. Transfira o mesencéfalo ventral para HBSS gelado em um tubo cônico de 15 mililitros.
Em seguida, prossiga para dissecar o próximo embrião, processando o maior número possível de embriões dentro de uma hora. Embriões mantidos em gelo por mais de uma hora apresentam baixa viabilidade celular. Para garantir alta viabilidade dos neurônios dopaminérgicos, o tempo entre a dissecção e o plaqueamento não deve exceder uma hora.
Além disso, a remoção das meninges é crucial para a sobrevivência dos neurônios sob uma capela. Remova o HBSS da coleta de mesencéfalo ventral. Em seguida, adicione um mililitro de tripsina a 0,05% aquecida A DTA, quantidade suficiente de solução para 12 fragmentos de tecido.
Incube o tecido a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. Sob a capela, substitua a tripsina A DTA por um mililitro do meio de desativação. Agite suavemente para misturar e, em seguida, remova o meio de desativação, mas deixe quantidade suficiente de meio para que as células dissociadas não sejam descartadas.
Em seguida, lave os tecidos com meio completo duas vezes sem perder as células. Agora, adicione um mililitro de meio completo. Em seguida, triture o tecido com a pipeta flamejada sem formar bolhas até obter uma suspensão de células simples.
Cerca de oito a dez passagens devem ser suficientes. Após esse período, centrifugue as células a 400 Gs por cinco minutos. Remova o meio e ressuspenda as células em um mililitro de meio completo.
Pipete as células até quatro vezes para obter uma suspensão. Comece contando e avaliando a viabilidade das células na suspensão. Utilize a exclusão com tripano azul com um hemocitômetro.
Agora, ajuste a suspensão celular para 1500 células por microlitro. Em seguida, transfira as tampas de tubos microcêntrifugos esterilizadas para placas de 100 milímetros. Coloque as lamínulas preparadas sobre as tampas utilizando pinça.
Não lave as lamínulas e evite que sequem. Adicione 100 microlitros de suspensão em cada lamínula. Esse método um tanto incomum proporciona 90% de viabilidade celular e é uma etapa crítica para o sucesso.
Em seguida, feche a placa de Petri e transfira-a para a estufa por uma hora; após a incubação, transfira cuidadosamente as lamínulas com o meio para placas de 24 poços contendo 400 microlitros de meio completo aquecido a 37 graus Celsius em cada poço, e então incube as células durante a noite. As primeiras horas são as mais críticas para a sobrevivência celular nas primeiras 24 horas. Adicione suavemente meio meio mililitro de meio completo a cada poço.
A cada duas semanas. Troque metade do meio de cultura. Se o meio ficar amarelo, a troca de metade do meio pode ser realizada mais cedo, mas ainda assim deve ser infrequente.
Neurônios dopaminérgicos sobreviverão por mais de seis semanas sob essas condições. Após duas semanas de cultivo, a imunohistoquímica contra tirosina, hidroxilase e marcadores neuronais mostra que 1% das células são dopaminérgicas. Projeções neuronais aparecem dentro de duas horas após a semeadura.
No final do primeiro dia em cultura, axônios e dendritos são distinguíveis. Em última análise, os neurônios sobrevivem por mais de seis semanas e apresentam crescimento extenso após este procedimento. Outros métodos, como transdução viral, imunofluorescência ou eletrofisiologia, podem ser realizados para responder perguntas mecanicistas em neurônios dopaminérgicos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para o isolamento e cultivo de neurônios primários do mesencéfalo ventral de roedores, essencial para o estudo da degeneração de neurônios dopaminérgicos na doença de Parkinson. O método envolve dissecção, dissociação do tecido e semeadura de neurônios, seguidos por microscopia de imunofluorescência para identificação neuronal.
Principais Componentes do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Neurodegeneração
Antecedentes
- A doença de Parkinson envolve a degeneração de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo.
- Os mecanismos por trás dessa degeneração não são totalmente compreendidos.
- Modelos in vitro são essenciais para o estudo das propriedades neurofisiológicas.
- Culturas primárias de neurônios podem fornecer insights sobre a neurodegeneração.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo otimizado para o cultivo de neurônios dopaminérgicos.
- Facilitar a pesquisa sobre as propriedades neurofisiológicas desses neurônios.
- Aprimorar a compreensão dos mecanismos da doença de Parkinson.
Métodos Utilizados
- Dissecação do mesencéfalo embrionário de roedor.
- Isolamento do mesencéfalo ventral.
- Dissociação do tecido neuronal para criar uma suspensão de células simples.
- Plaqueamento de neurônios primários em lamínulas e transferência para uma placa de 24 poços.
Resultados Principais
- Isolamento e cultura bem-sucedidos de neurônios dopaminérgicos primários.
- Implementação da microscopia de imunofluorescência para identificação de neurônios.
- Estabelecimento de um modelo in vitro confiável para o estudo da neurodegeneração.
- Aplicações potenciais na pesquisa da doença de Parkinson.
Conclusões
- O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para o estudo de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo.
- Ele aprimora a compreensão dos mecanismos celulares envolvidos na neurodegeneração.
- Esse método pode auxiliar no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para a doença de Parkinson.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento confiável e a cultura de longo prazo de neurônios dopaminérgicos mesencefálicos primários permitem a investigação mecanicista da neurodegeneração relacionada à doença de Parkinson e distúrbios associados. Este sistema fornece uma plataforma fisiologicamente relevante para validação de alvos, análise de vias e desvio preditivo de riscos em portfólios de descoberta inicial e neurociência pré-clínica. A manutenção robusta in vitro desses neurônios sustenta a continuidade translacional e o avanço ajustado ao risco de programas neuroterapêuticos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a testagem direta de hipóteses terapêuticas em neurônios dopaminérgicos relevantes para a doença.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao permitir a manipulação e observação da sobrevivência e degeneração neuronal.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio de leituras quantitativas e morfológicas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece um sistema neuronal validado para triagem de compostos e desenvolvimento de ensaios fenotípicos.
- Garante reprodutibilidade e padronização por meio de protocolos otimizados de cultura e identificação.
- Oferece resultados quantitativos, como viabilidade celular e crescimento de neuritos, para avaliação confiável de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha-se à biologia relevante para a doença na exploração translacional de biomarcadores.
- Permite continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, apoiando a manutenção neuronal de longo prazo.
- Reduz o risco translacional ao modelar aspectos-chave da vulnerabilidade e sobrevivência de neurônios dopaminérgicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de cultura de neurônios primários integra-se ao continuum de descoberta até a fase pré-clínica, apoiando a validação de alvos, a identificação de compostos líderes e estudos mecanicistas na pesquisa de neurodegeneração.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses e a elucidação de vias na degeneração de neurônios dopaminérgicos.
- Triagem: Fornece culturas prontas para ensaios e reprodutíveis para estudos com compostos e perturbações genéticas.
- Análises: Permite a medição quantitativa da sobrevivência neuronal, da morfologia e da expressão de marcadores.
- Pesquisa Translacional: Apoia a correlação com mecanismos da doença e o desenvolvimento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para diversos projetos em neurobiologia e neurodegeneração.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de neurodegeneração.
- Valor Operacional: Padroniza o cultivo e a identificação de neurônios para fluxos de trabalho reprodutíveis e escaláveis.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao permitir validação robusta em estágios iniciais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos neuroterapêuticos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de embriões e técnicas de cultivo neuronal.
- Exige acesso a instalações estéreis de cultura de tecidos e microscopia de imunofluorescência.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes nos protocolos de dissecação, semeadura e identificação.
- A adaptação a outros subtipos neuronais ou espécies pode exigir otimização do protocolo.
- A viabilidade celular e o sucesso do cultivo são altamente sensíveis ao tempo e dependem de manipulação precisa.
