Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

O objetivo deste procedimento é isolar e cultivar de forma eficiente neurônios primários do mesencéfalo ventral de roedores. Isso é realizado primeiramente dissecando o mesencéfalo de embriões de roedores. O segundo passo é isolar cuidadosamente o mesencéfalo ventral.

Em seguida, o tecido neuronal deve ser dissociado para obter uma suspensão de células isoladas. O passo final consiste em semear os neurônios primários em pequeno volume sobre lamínulas antes de transferir as células aderidas para uma placa de 24 poços posteriormente. Por fim, utiliza-se anticorpo e microscopia de imunofluorescência para identificar os neurônios dopaminérgicos dentro do cultivo.

Os neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo estão envolvidos em diversas funções, incluindo o controle do movimento e da emoção na cognição e no sistema de recompensa do cérebro. Eles também estão implicados em condições neurológicas e neuropsiquiátricas, como a doença de Parkinson, dependência química e esquizofrenia. O método de reparação do mesencéfalo ventral.

As culturas neuronais podem ser utilizadas para estudar a fisiologia e as propriedades celulares dos neurônios dopaminérgicos, bem como para compreender a causa de sua degeneração durante o curso de distúrbios como a doença de Parkinson. Primeiro, prepare as lamínulas.

Ferva-os em etanol 70% por pelo menos 30 minutos para remover qualquer vestígio de graxa. Em seguida, esterilize as lamínulas em autoclave. Transfira as lamínulas para placas de 24 poços e adicione meio mililitro de poliol alcatene a cada poço.

Bem, deixe as placas incubarem por uma hora à temperatura ambiente. Observe que a vida útil da solução de poliol ou de Athene é de um mês. Em seguida, lave as lamínulas três vezes com meio mililitro de água por lavagem.

Sem as três lavagens, as células cultivadas não sobreviveriam por 24 horas. Em seguida, prepare a solução de laminina. Certifique-se de descongelá-la lentamente sobre gelo.

Em seguida, dissolva a laminina em D-M-E-M-F 12 frio e utilize-a imediatamente. Adicione agora meio mililitro da solução de trabalho de laminina recém-preparada a cada poço e deixe as placas incubarem durante a noite a 37 graus Celsius. Por fim, ao preparar a pipeta de vidro, polimento as pontas até a metade do tamanho normal.

Realize uma incisão abdominal para expor os sacos uterinos e, com o auxílio de pinça, solte o útero. Transfira o útero para HBSS gelado em uma placa de 100 milímetros e comece a remover os embriões com pinça. Transfira os embriões isolados para uma nova placa com HBSS frio.

Agora, sob um microscópio estereoscópico, prepare-se para acessar esta região do mesencéfalo ventral com uma ampliação de 10x. Disseque a região do mesencéfalo e do arco cefálico cortando o cérebro no istmo e na região limite entre o mesencéfalo e o diencéfalo cefálico, utilizando tesoura cirúrgica ou pinça. Após remover todo o mesencéfalo, faça um corte no mesencéfalo dorsal medial.

Usando pinças, remova as meninges. Esta etapa é fundamental para o sucesso do cultivo neuronal. Células não neuronais morrerão em cultura e emitirão sinais prejudiciais para os neurônios vizinhos.

Agora achate o tecido do mesencéfalo em formato de borboleta. Corte cerca da metade de cada asa com uma lâmina estéril, deixando o mesencéfalo ventral. Transfira o mesencéfalo ventral para HBSS gelado em um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, prossiga para dissecar o próximo embrião, processando o maior número possível de embriões dentro de uma hora. Embriões mantidos em gelo por mais de uma hora apresentam baixa viabilidade celular. Para garantir alta viabilidade dos neurônios dopaminérgicos, o tempo entre a dissecção e o plaqueamento não deve exceder uma hora.

Além disso, a remoção das meninges é crucial para a sobrevivência dos neurônios sob uma capela. Remova o HBSS da coleta de mesencéfalo ventral. Em seguida, adicione um mililitro de tripsina a 0,05% aquecida A DTA, quantidade suficiente de solução para 12 fragmentos de tecido.

Incube o tecido a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. Sob a capela, substitua a tripsina A DTA por um mililitro do meio de desativação. Agite suavemente para misturar e, em seguida, remova o meio de desativação, mas deixe quantidade suficiente de meio para que as células dissociadas não sejam descartadas.

Em seguida, lave os tecidos com meio completo duas vezes sem perder as células. Agora, adicione um mililitro de meio completo. Em seguida, triture o tecido com a pipeta flamejada sem formar bolhas até obter uma suspensão de células simples.

Cerca de oito a dez passagens devem ser suficientes. Após esse período, centrifugue as células a 400 Gs por cinco minutos. Remova o meio e ressuspenda as células em um mililitro de meio completo.

Pipete as células até quatro vezes para obter uma suspensão. Comece contando e avaliando a viabilidade das células na suspensão. Utilize a exclusão com tripano azul com um hemocitômetro.

Agora, ajuste a suspensão celular para 1500 células por microlitro. Em seguida, transfira as tampas de tubos microcêntrifugos esterilizadas para placas de 100 milímetros. Coloque as lamínulas preparadas sobre as tampas utilizando pinça.

Não lave as lamínulas e evite que sequem. Adicione 100 microlitros de suspensão em cada lamínula. Esse método um tanto incomum proporciona 90% de viabilidade celular e é uma etapa crítica para o sucesso.

Em seguida, feche a placa de Petri e transfira-a para a estufa por uma hora; após a incubação, transfira cuidadosamente as lamínulas com o meio para placas de 24 poços contendo 400 microlitros de meio completo aquecido a 37 graus Celsius em cada poço, e então incube as células durante a noite. As primeiras horas são as mais críticas para a sobrevivência celular nas primeiras 24 horas. Adicione suavemente meio meio mililitro de meio completo a cada poço.

A cada duas semanas. Troque metade do meio de cultura. Se o meio ficar amarelo, a troca de metade do meio pode ser realizada mais cedo, mas ainda assim deve ser infrequente.

Neurônios dopaminérgicos sobreviverão por mais de seis semanas sob essas condições. Após duas semanas de cultivo, a imunohistoquímica contra tirosina, hidroxilase e marcadores neuronais mostra que 1% das células são dopaminérgicas. Projeções neuronais aparecem dentro de duas horas após a semeadura.

No final do primeiro dia em cultura, axônios e dendritos são distinguíveis. Em última análise, os neurônios sobrevivem por mais de seis semanas e apresentam crescimento extenso após este procedimento. Outros métodos, como transdução viral, imunofluorescência ou eletrofisiologia, podem ser realizados para responder perguntas mecanicistas em neurônios dopaminérgicos.