Um método simplificado para Ultra-Baixa Densidade, Long-Term Primária do hipocampo Neuron Cultura

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer culturas saudáveis de longa duração de neurônios primários do hipocampo de camundongo em densidade ultra-baixa, a fim de facilitar a marcação por imunocitoquímica e o estudo de mecanismos celulares neuronais autônomos. Este estudo pode ajudar a compreender algumas questões fundamentais na área de pesquisa em neurociência, como os estudos sobre a especificidade de proteínas na neuromorfologia da função do desenvolvimento. A principal vantagem desta técnica é que ela permite que os neurônios cresçam em densidade ultra-baixa sobre uma lamínula, sem o apoio de uma camada de células gliais de suporte.

Quem demonstrará o procedimento será Mariel Piechowicz, uma estudante do meu laboratório. Prepare duas placas de 24 poços de alta densidade e duas placas de 24 poços de baixa densidade. Utilizando uma agulha de 28 gauge, risque o fundo das placas de 24 poços, de modo que o plástico deslocado atue como suporte para as lamínulas com neurônios de baixa densidade crescendo sobre elas.

Transfira as lamínulas de vidro estéreis para as duas placas de 24 poços designadas para culturas de baixa densidade. Revesta as quatro placas com 300 microlitros de poli-D-lisina a 0,1 miligrama por mililitro diluída em tampão borato e devolva-as ao incubador para um revestimento com incubação durante a noite. Antes da coleta do tecido, prepare dois recipientes de Petri de 10 centímetros cheios com HBSS estéril gelado.

Sob o microscópio, segure o embrião pelo pescoço com a pinça e faça o primeiro corte exatamente na linha média, logo abaixo do nível do cerebelo. Em seguida, faça um corte no lado esquerdo da base do crânio. Depois, faça outro corte no lado direito da base do crânio.

Deixe uma pequena parte do osso do crânio e do tecido cutâneo na extremidade rostral sem cortar, para que todo o cérebro possa ser virado para o lado com facilidade durante a extração. Agora, transfira o cérebro para a solução HBSS. Examine o cérebro para garantir que esteja intacto, sem regiões visivelmente seccionadas.

Em seguida, repita os procedimentos para coletar os demais cérebros de embriões em uma nova placa de Petri contendo 20 mililitros de tampão HBSS frio. Posicione cada cérebro com o lado ventral voltado para cima. Enquanto segura o cérebro com uma pinça na extremidade caudal, faça um corte diagonalmente entre o ponto rostral médio e a região temporal caudal com uma pinça afiada.

Repita isso para o outro hemisfério. Em seguida, separe os dois hemisférios com hipocampo intacto do restante dos tecidos do tronco encefálico. Repita os procedimentos para todos os cérebros e reúna todos os hemisférios dissecados em um único grupo.

Em seguida, remova as meninges utilizando dois pares de pinças. Identifique o hipocampo em desenvolvimento como uma estrutura curva que está dobrada dentro do lobo temporal e separe-o dos tecidos corticais adjacentes. Colete e reúna todos os tecidos dos hipocampos.

Neste procedimento, transfira todos os hipocampos dissecados para a solução enzimática de digestão em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, coloque o tubo em banho-maria e incube a 37 graus Celsius por 25 minutos. Após 25 minutos, remova cuidadosamente a solução enzimática.

Em seguida, adicione cinco mililitros de meio de lavagem morno para completar um volume total de 10 mililitros. Lave suavemente o tecido invertendo lentamente o tubo cinco vezes. Remova o meio de lavagem e adicione novamente 10 mililitros de meio de lavagem, para uma lavagem adicional.

Depois disso, remova o meio de lavagem e adicione novamente três mililitros de meio de lavagem fresco e aquecido. Agite o tubo manualmente com vigor 15 vezes para destacar os neurônios digeridos do tecido. O meio deve ficar turvo assim que as células forem separadas do tecido e entrarem no meio de lavagem.

Em seguida, colete a suspensão celular em um novo tubo cônico de 15 mililitros, deixando o tecido remanescente no tubo. Depois disso, adicione outros dois mililitros de meio de lavagem ao tecido e separe suavemente o tecido restante por trituração com uma pipeta de plástico 15 vezes. Deixe a suspensão celular repousar por cinco minutos antes de reunir o material em um novo tubo cônico de 15 mililitros que contém as células coletadas da sobrenadante.

Em seguida, conte a densidade de neurônios utilizando um hemocitômetro. Calcule o volume da suspensão celular necessário para obter uma densidade de 250.000 neurônios por mililitro e adicione-o a um dos dois tubos cónicos contendo 30 mililitros de meio de cultura completo, obtendo assim um meio de placa de neurônios em alta densidade. Transfira 1,2 mililitro dessa solução de alta densidade para outros 30 mililitros de meio de cultura completo, obtendo uma concentração de 10.000 neurônios por mililitro, e utilize esta solução para semear as lamínulas em baixa densidade.

Neste procedimento, coloque placas de 24 poços com fundo gravado para neurônios de alta densidade na capela de cultura. Remova 300 microlitros do meio pré-condicionado por vácuo, em seguida plaque 0,6 mililitros de suspensão celular de alta densidade com 250.000 neurônios por mililitro. Coloque as outras duas placas de 24 poços com lamínulas na capela de cultura.

Remova 300 microlitros do meio condicionado por vácuo, antes de semear 0,6 mililitros de suspensão celular de baixa densidade com 10.000 neurônios por mililitro sobre as lamínulas. Em seguida, devolva as quatro placas de 24 poços ao incubador e incube por duas horas. Após isso, inverta as lamínulas de baixa densidade com neurônios aderidos para a cultura de alta densidade e certifique-se de que os neurônios estejam voltados um para o outro.

Posteriormente, retorne as duas placas com o co-cultivo ao incubador. Alimente os co-cultivos adicionando 300 microlitros de meio de alimentação fresco no DIV cinco. Após esta alimentação inicial, adicione 300 microlitros de meio de alimentação fresco sem arabinosídeo de citosina a cada poço semanalmente.

Se a cultura precisar ser mantida por mais de um mês, substitua metade do meio por meio fresco a cada semana após o ponto de um mês. Morfologicamente, tanto neurônios de alta densidade quanto de baixa densidade devem apresentar aparência saudável por até três meses. Aqui, a marcação por imunocitoquímica é utilizada para revelar sinapses glutamatérgicas funcionais nas quais o subunidade do receptor NMDA NR1 e o subunidade do receptor ApoE GluR1 são marcados com dupla coloração.

E as sinapses funcionais podem ser facilmente identificadas e quantificadas usando o ImageJ. Neurônios de baixa densidade também são marcados com anticorpo contra o marcador proteico dendrítico MAP2 em combinação com o marcador proteico axonal p-Tau. Esse duplo marcador permite uma distinção clara entre dendritos e axônios. Culturas de baixa densidade também podem ser transfectadas com sucesso com plasmídeos de DNA usando métodos de fosfato de cálcio, embora a taxa de transfeção seja tipicamente muito baixa em estágios posteriores.

Esta figura ilustra que a transfeção com EGFP pode revelar a morfologia neuronal e tornar visíveis estruturas finas das espinhas dendríticas. Por fim, como prova de conceito, neurônios de ultra-baixa densidade podem ser cultivados em condições que promovem a formação de autofapses. Esses neurônios autofápticos de ultra-baixa densidade, cultivados em microilhas revestidas com poli-D-lisina, podem ser mantidos por neurônios de apoio de alta densidade por mais de dois meses com este protocolo de cocultura.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas a três horas no dia do cultivo celular, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é essencial revestir as lamínulas de vidro e os fundos da placa de 24 poços com poli-D-lisina. Uma simples corrosão dos fundos da placa é suficiente para fornecer suporte mecânico e nutricional aos neurônios hipocampais de baixa densidade para crescerem sobre as lamínulas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar neurônios primários hipocampais de embrião de camundongo em densidade ultra-baixa, na ausência de uma camada de células gliais como suporte. Espera-se que você consiga utilizar este método para seus próprios fins experimentais.