Um método simplificado para Ultra-Baixa Densidade, Long-Term Primária do hipocampo Neuron Cultura

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer culturas saudáveis de longo prazo de neurônios primários do hipocampo de camundongos em densidade ultrabaixa, a fim de facilitar a marcação imunocitoquímica e o estudo dos mecanismos autônomos das células neuronais. Este estudo pode ajudar a entender algumas questões-chave no campo da pesquisa em neurociências, como os estudos sobre a especificidade da proteína na neuromorfologia da função do desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os neurônios cresçam em densidade ultrabaixa em uma lamínula sem o suporte de uma camada alimentadora glial.

Demonstrando o procedimento estará Mariel Piechowicz, uma estudante do meu laboratório. Prepare duas placas de 24 poços de alta densidade e duas de baixa densidade. Usando uma agulha de calibre 28, grave o fundo de placas de 24 poços, de modo que os plásticos deslocados atuem como suporte para as lamínulas com neurônios de baixa densidade crescendo nelas.

Transfira as lamínulas de vidro estéreis para as duas placas de 24 poços designadas para culturas de baixa densidade. Cubra todas as quatro placas com 300 microlitros de 0,1 miligrama por mililitro de poli-D-lisina diluída em tampão borato e devolva-as à incubadora para revestimento de incubação durante a noite. Antes da coleta de tecidos, prepare duas placas de Petri de 10 centímetros cheias de HBSS estéril gelado.

Sob o microscópio, segure o embrião pelo pescoço com a pinça e faça o primeiro corte bem na linha média, abaixo do nível do cerebelo. Em seguida, faça um corte no lado esquerdo da base do crânio. Em seguida, faça outro corte no lado direito da base do crânio.

Deixe uma pequena parte do osso do crânio e do tecido da pele na extremidade rostral sem cortes, para que todo o cérebro possa ser virado de lado para extração facilmente. Agora transfira o cérebro para a solução HBSS. Inspecione o cérebro para certificar-se de que está intacto, sem regiões de corte grosseiro.

Em seguida, repita os procedimentos para coletar o restante do cérebro do embrião em uma nova placa de Petri contendo 20 mililitros de tampão HBSS frio. Posicione cada cérebro com o lado ventral para cima. Enquanto segura o cérebro com uma pinça na extremidade caudal, faça um corte diagonal entre o ponto rostral médio e a região temporal caudal com uma pinça afiada.

Repita isso para o outro hemisfério. Depois, separe os dois hemisférios com hipocampo intacto do resto dos tecidos-tronco do cérebro. Repita os procedimentos para todos os cérebros e agrupe todos os hemisférios dissecados.

Em seguida, remova as meninges usando dois pares de pinças. Identifique o hipocampo em desenvolvimento como uma estrutura curva que é dobrada dentro do lobo temporal e separe-a dos tecidos corticais adjacentes. Colete e agrupe todos os tecidos do hipocampo.

Neste procedimento, transferir todos os hipocampos dissecados para a solução de digestão enzimática num tubo cónico de 15 ml. Em seguida, coloque o tubo dentro de um banho-maria e incube a 37 graus Celsius por 25 minutos. Após 25 minutos, remova cuidadosamente a solução enzimática.

Em seguida, adicione cinco mililitros de meio de lavagem quente para elevar o volume total para 10 mililitros. Lave suavemente o tecido invertendo lentamente o tubo cinco vezes. Remova o meio de lavagem e adicione 10 mililitros de meio de lavagem novamente, para uma lavagem adicional.

Depois disso, remova o meio de lavagem e adicione três mililitros de meio de lavagem quente novamente. Agite o tubo com a mão rigorosamente 15 vezes para desalojar os neurônios digeridos do tecido. O meio deve ficar turvo quando as células são separadas do tecido para o meio de lavagem.

Em seguida, colete a suspensão celular em um novo tubo cônico de 15 mililitros, deixando o tecido restante no tubo. Depois disso, adicione mais dois mililitros de meio de lavagem ao tecido e separe delicadamente o tecido restante triturando com uma pipeta de plástico 15 vezes. Deixe a suspensão celular descansar por cinco minutos antes de agrupá-la em um novo tubo cônico de 15 mililitros que contém as células coletadas do shake off.

Em seguida, conte a densidade dos neurônios com um hemocitômetro. Calcule o volume de suspensão celular necessário para produzir uma densidade de 250.000 neurônios por mililitro e adicione-o a um dos dois tubos cônicos contendo 30 mililitros de meio de cultura completo, para produzir um meio de revestimento de neurônios de alta densidade. Transfira 1,2 mililitros desta solução de neurônios de alta densidade para outros 30 mililitros de meio de cultura completo, para obter uma concentração de 10.000 neurônios por mililitro, e use esta solução para semear as lamínulas de baixa densidade.

Neste procedimento, coloque placas de 24 poços com fundos gravados para neurônios de alta densidade na capela de cultura. Remova 300 microlitros do meio pré-condicionado por vácuo e, em seguida, coloque 0,6 mililitros de suspensão de células de alta densidade a 250.000 neurônios por mililitro. Coloque as outras duas placas de 24 poços com lamínulas na capa de cultura.

Remova 300 microlitros do meio pré-condicionado por vácuo, antes de plaquear 0,6 mililitros de suspensão de células de baixa densidade a 10.000 neurônios por mililitro nas lamínulas. Depois, retorne todas as quatro placas de 24 poços para a incubadora e incube por duas horas. Depois disso, vire as lamínulas de baixa densidade com os neurônios aderentes à cultura de alta densidade e certifique-se de que os neurônios estejam voltados um para o outro.

Em seguida, devolva as duas placas com co-cultura à incubadora. Alimente as co-culturas adicionando 300 microlitros de meio de alimentação fresco no DIV cinco. Após esta alimentação inicial, adicione 300 microlitros de meio de alimentação fresco sem arabinosídeo de citosina a cada poço todas as semanas.

Se a cultura for mantida por mais de um mês, substitua metade do meio por meio de alimentação fresco todas as semanas além de um mês. Morfologicamente, os neurônios de alta e baixa densidade devem parecer saudáveis por até três meses. Aqui, a marcação imunocitoquímica é usada para revelar as sinapses glutamatérgicas funcionais nas quais a subunidade NR1 do receptor NMDA e a subunidade GluR1 do receptor ApoE são marcadas com coloração dupla.

E as sinapses funcionais podem ser prontamente identificadas e quantificadas usando a imagem J. Os neurônios de baixa densidade também são marcados com anticorpos contra o marcador de proteína dendrítica MAP2 em combinação com o marcador de proteína axonal p-Tau. Essa dupla marcação permite uma distinção clara de dendritos e axônios. Culturas de baixa densidade também podem ser transfectadas com sucesso com plasmídeos de DNA usando métodos de fosfato de cálcio, embora a taxa de transfecção seja tipicamente muito baixa em estágios posteriores.

Esta figura ilustra que a transfecção de EGFP pode revelar a morfologia neuronal e tornar visíveis as estruturas finas da coluna dendrítica. Por fim, como prova de conceito, os neurônios de densidade ultrabaixa podem ser cultivados sob condições que promovem a formação de autapses. Esses neurônios autápticos de densidade ultrabaixa cultivados em microilhas revestidas com poli-D-lisina podem ser sustentados pelos neurônios alimentadores de alta densidade por mais de dois meses com este protocolo de co-cultura.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas a três horas no dia da cultura de células, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é fundamental revestir as lamínulas de vidro e os fundos das placas de 24 poços com Poli-D-lisina. Uma simples gravação do fundo da placa é adequada para fornecer suporte mecânico e nutricional aos neurônios do hipocampo de baixa densidade para crescer nas lamínulas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como cultivar neurônios embrionários primários do hipocampo de camundongos de densidade ultrabaixa, na ausência de uma camada alimentadora glial. Espero que você possa utilizar este método para seu próprio propósito experimental.