Name: Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a isolar neurônios, macrófagos e microglia de cérebros de larvas de zebrafish e extrair RNA de alta qualidade para análises de qPCR e transcriptômica. Este protocolo permite estudar perfis de expressão gênica em condições fisiológicas e patológicas.

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Agradecemos o Dr. Claire Davis e Dr. Miron Veronique (a rainha Instituto de investigação médica, Edimburgo, Kingdome Unidos) pela ajuda inicial e discussões sobre a abordagem experimental, a estrutura de classificação de células e a citometria de fluxo QMRI. Este trabalho foi apoiado por um Cancer Research UK carreira estabelecimento Award para Dr. Dirk Sieger.

1. amostra e preparação de meios de comunicação
<ol><li>Prepare o suporte de embrião (E3) pela dissolução de 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O em H2O.</li>
	<li>Colete embriões zebrafish imediatamente após a fertilização (0 dpf).<ol>
<li>Dividi o zebrafish embriões em 50 por prato de petri de 90 mm. Criar embriões a 28,5 ° C em 50 mL de meio de embrião (E3) tratado com 200 µM 1-fenil-2-tioureia (PTU), do final do primeiro dia do desenvolvimento (0 dpf) para a duração do experimento para inibir a pigmentação.</li>
		<li>Muda o E3 + médio PTU diariamente para a duração do experimento.</li>
		<li>Tela mpeg1:eGFP e larvas de NBT:DsRed no dpf 2 usando um microscópio fluorescente para a expressão do transgene positivo, macrófagos GFP+ /microglia e DsRed+ neurônios.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparem-se todos os meios no dia anterior o experimento sob uma capa de cultura de tecidos para evitar a contaminação e, em seguida, armazene-os em 4 ° C.<ol>
<li>Preparar a mídia A dissolvendo Hepes de 15 mM e 25 mM D-glicose em HBSS 1 x.</li>
		<li>Prepare o médio gradiente de densidade (100%) misturando 9 volumes do meio de gradiente de densidade de 1 volume de HBSS 10 x.</li>
		<li>Prepare o suporte de gradiente de densidade (22%) diluindo 22 mL de meio de gradiente de densidade (100%) em 88 mL de DPBS 1 x.</li>
		<li>Preparar DPBS 1 x.</li>
		<li>Prepare E3 médio + tricaina misturando E3 médio com 450 μM tricaina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. homogeneização
Nota: Todas as etapas são realizadas 4 ° C.
<ol><li>Adicione 1,5 mL metanosulfonato (15 mM) de 90 mm placas de Petri contendo 50 larvas em 50 mL de meio de embrião E3 tratado com 200 µM PTU para anestesia terminal.<ol>
<li>Puxa-saco 10 larvas anestesiadas desde os pratos de petri com uma mL 3 pipetas de plástico grosso.</li>
		<li>Larvas de transferência anestesiada 10 por 10 em uma placa de Petri 55mm repleto de gelada médio de embrião de E3 + tricaina.</li>
		<li>Sob um estereomicroscópio, alinhe 10 larvas no centro da caixa de Petri. Então transecto larvas cabeças acima o saco vitelino-usando microtesoura cirúrgica (excluir a bexiga natatória para evitar flutuação cabeças).</li>
		<li>Puxa-saco cabeças desde os pratos de petri com uma mL 3 pipetas de plástico grosso. Espere até que todas as cabeças se reúnem dentro a ponta da pipeta e em seguida, transferi-los para um homogeneizador de vidro contendo 1 mL gelada Media A (transferência em um volume mínimo para reduzir a mídia uma diluição por E3 + tricaina). Manter o homogenizador de vidro no gelo. Use um homogeneizador por condição experimental.</li>
		<li>Substituir cada pequeno prato de petri contendo gelo frio E3 + tricaina com um novo cada 30 min para assegurar essa transecção é executada no frio E3 + tricaina médio.</li>
		<li>Substitua o gelado A mídia no homogenizador de vidro quando a cor começa a desvanecer-se. Nota: Diluição de A mídia pode alterar o tecido cabeça devido a mudanças de temperatura.</li>
		<li>Uma vez que todos os chefes foram coletados (600 cabeças/condição), remover o volume máximo da mídia A partir do homogenizador de vidro e substituí-lo com 1 mL da gelada fresco Media.</li>
		<li>Perturbar o tecido do cérebro com um homogeneizador de vidro apertado no gelo. Execute 40 rodadas de esmagamento e voltas para larvas de dpf de 3-5 e 50 para larvas de dpf 7 e 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 2 mL da mídia à suspensão de células (1 mL A de mídia / 200 cabeças), que irá diluir as células e reduzir sua aglomeração com mielina para facilitar sua separação durante a centrifugação em gradiente médio de densidade.<ol>
<li>Para eliminar a aglomeração de célula, execute a suspensão de células através de um filtro de célula de 40 µm colocado em cima de um tubo de Falcão frio 50ml mantido no gelo. Repita esta operação 3 vezes.</li>
		<li>Transferir 1 mL da suspensão de células para tubos de frio 1,5 mL e girá-los a 300 g por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Remover o sobrenadante utilizando uma seringa de 10 mL + agulha 23 x 1 '.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ressuspender o centrifugado com 1 mL de meio de gradiente gelada 22% densidade levemente sobreposto por 0,5 mL de DPBS gelada 1 x (do não mistura-los, uma interfase entre ambas as soluções serão vistos).<ol>
<li>Girar os tubos em 950 g sem freio e aceleração lenta por 30 min a 4 ° C. Nota: Este passo separa a mielina de outras células pelo sequestro de no período do intérfase de DPBS 1 x e 22% médio gradiente de densidade, Considerando que células serão sedimento no fundo do tubo. Remoção de mielina é mais eficiente quando a concentração de célula não é muito alta.</li>
		<li>Usando uma seringa de 10 mL + agulha 23 x 1 ' descartar o máximo de DPBS, médio gradiente de densidade e mielina preso na sua interfase.</li>
		<li>Lavam-se células com 0,5 mL da mídia A + 2% de soro de cabra normal (NGS) e, em seguida, girar tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Descartar o máximo do líquido sobrenadante e, em seguida, juntar todos os chumbos de célula da mesma condição experimental junto em 1 mL de mídia A + 2% NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se as células de interesse expressam uma proteína fluorescente como macrófagos/microglia de mpeg1:eGFP ou neurônios de NBT:DsRed peixe transgénicos (screening de peixe transgénicos ver 1.1.3), executar a suspensão de células através de um filtro de célula de 35 µm cap e transferi-los para uma tubos de frio 5 mL FACS no gelo, protegidos da luz. Nota: Alternativamente, a imuno-coloração da microglia pode ser executada.</li>
</ol>3. Microglia Immuno-coloração
Nota: Todas as etapas são executadas a 4 ° C.
<ol><li>Ressuspender o centrifugado com 0,3 mL de mídia A + 2% NGS. Dividi-los em tubos de 3 x 1.5 mL: um para células imaculadas medir a autofluorescência de células de interesse, em segundo lugar para o anticorpo secundário (1/200) medir a ligação não-específica do anticorpo secundário para microglia e, terceiro, como um teste (4 4 mouse monoclonal anticorpo (microglia específico) (1/20) + (1/200) de anticorpo secundário).<ol>
<li>Adicione baixa endotoxina, livre de azida sódica (folha) em 1% para as células (todos os tubos) para bloquear CD16/CD32 interações com o domínio do Fc de imunoglobulinas. Incube as células por 10 min com agitação suave cada 5 min.</li>
		<li>Adicionar 4 a 4 anticorpo (1/20) para as células (tubo 3) e incube por 30 min com agitação suave a cada 10 min.</li>
		<li>Girar os tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave uma vez com 0,5 mL da mídia A + 2% NGS, então girar tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Ressuspender o centrifugado com 0,5 ml de mídia A + 2% NGS e incubar as células com folha em 1% por 10 min com agitação suave cada 5 min.</li>
		<li>Adicione o anticorpo secundário (1/200) para as células (tubo 2 e 3). Incube as células por 30 min com agitação suave cada 10 min e protecção leve.</li>
		<li>Girar os tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave duas vezes com 0,5 mL de mídia A + 2% NGS, então a re-suspender centrifugado com 1 mL de mídia A + 2% NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Executar a suspensão de células através de uma tampa de filtro de célula µm 35 e transferi-los para tubos de 5ml frio FACS no gelo, protegido da luz.</li>
</ol>4. célula de triagem (FACS)
Nota: Executar todas as etapas, a 4 ° C.
<ol><li>Classificar os neurônios, macrófagos/microglia e microglia usando um FACS. Nota: Esta etapa é geralmente realizada por um membro do pessoal da instalação de FACS e configurações dependem do tipo de equipamento utilizado.<ol>
<li>Adicione DAPI em uma concentração de 1 µ g/mL em cada tubo de FACS para rotular as células mortas.</li>
		<li>Configurar o FACS e tipo de neurônios, macrófagos/microglia ou microglia de todas as células do cérebro. Separar células de detritos em função do seu tamanho e granulosidade e, em seguida, single-células por dispersão para a frente e dispersão do lado da porta. Exclua células mortas por DAPI rotulagem de células vivas. Identifica os neurônios, macrófagos/microglia ou microglia por seus respectivos coloração positiva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recolher pilhas em tubos de 1,5 mL contendo 1 mL de gelado A mídia + 2% NGS em gelo. Use tubos diferentes para cada tipo de célula.<ol>
<li>Girar os tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C e em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave uma vez com 0,5 mL de mídia A então descartar o sobrenadante no máximo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. extração do RNA
<ol><li>Extraia o RNA dos diferentes tipos de células separados por FACS. Para a extração de RNA usar um kit específico e siga as orientações do fabricante. Certifique-se para trabalhar em um ambiente livre de RNase por pipetas com um produto de descontaminação de RNase e limpeza do espaço de trabalho e usar filtro dicas.<ol>
<li>Recentemente Prepare-se 1 mL de tampão de Lise suplementado com 50 µM β-Mercaptoetanol. Nota: Aqui, β-Mercaptoetanol é adicionado para reduzir a degradação de RNA.</li>
		<li>Prepare a solução de etanol 70% e 80% usando RNase água livre.</li>
		<li>Lyse pilhas com 75 µ l de tampão de Lise suplementado com 50 µM β-Mercaptoetanol. Em seguida, use uma máquina trituradora para melhorar o rompimento da pilha.</li>
		<li>Continue manual de extração de RNA de acordo com o fabricante.</li>
		<li>No final do protocolo, Eluir o RNA com 14 µ l de água livre de RNase para obter uma concentração suficiente de RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo experimental descrito aqui representa um método robusto e eficiente para isolar as células do cérebro de zebrafish larvas de 3 a 8 dpf. Importante, este é o primeiro protocolo que permite o isolamento específico da microglia do zebrafish larval cérebros. O protocolo é projetado para preservar a integridade da membrana celular e para minimizar possíveis modificações da expressão genética ocorrem durante o processamento. Este último ponto é crucial para a relevância dos resultados com base na análise desses perfis genômicos celulares isolados. Com efeito, polarização microglia e macrófagos são fortemente influenciados pelo seu microambiente. A 37 ° C, estas células teria mudado seu perfil de expressão de gene em resposta a condições experimentais (resposta de lesão (transecção)). Portanto, foi crucial para realizar este experimento a 4 ° C antes da extração de RNA, para retardar processos celulares e atividades metabólicas. Além disso, a homogeneização do tecido de cérebro mecânico a 4 ° C foi escolhida em vez de digestão enzimática do tecido a 37 ° C para evitar qualquer impacto sobre perfis de expressão de gene.
É importante salientar que este método é muito rápido; dentro de um dia de várias populações de células do cérebro podem ser isoladas de pelo menos duas diferentes condições experimentais e seu RNA extraído. O comprimento total do protocolo depende do número de larvas usados para cada condição como a transecção de cabeças larvas é o passo limitante (∼ 350 cabeças/h). Em geral, para trabalhar com microglia de 3, 5 e 7 dpf é aconselhável transecto 600 cabeças ∼ por teste para obter suficiente RNA para extrair (tabela 1). Como micróglia representam o tipo de célula com o menor rendimento (aproximadamente 112 células per capita no dpf 7), o número de cabeças pode ser reduzido para outros tipos de células, incluindo os macrófagos (aproximadamente 170 células per capita em 7 dpf).
Outra vantagem deste protocolo é que, uma vez que se estabeleceram as configurações no classificador de FACS, as mesmas configurações podem ser usadas para diferentes experiências. Tem sido observado que populações de células se encaixam perfeitamente de um experimento para outro com portões previamente concebidos, mostrando a reprodutibilidade de experimentos usando esse método.
Uma ligeira desvantagem desse método é a relativamente baixa quantidade de RNA que é colhido. No entanto, esta limitação é mais uma questão biológica do que um problema técnico, como o número de micróglia é muito baixo em estágios iniciais de desenvolvimento do cérebro (tabela 1). Por causa desta baixa quantidade de RNA coletado, etapas de amplificação precisam ser considerados para executar análise de expressão de gene ampla do genoma. Felizmente, estas etapas de amplificação produzem quantidades suficientes de cDNA de alta qualidade. Assim, mudanças globais nos perfis de expressão do gene de células isoladas podem ser estudadas.
Em conclusão, este protocolo fornece um método robusto para isolar e estudar vários tipos de células do CNS de cérebros de zebrafish larval. Isto pode ser aplicado para ganhar uma compreensão mais profunda dessas células durante o desenvolvimento, bem como para estudar o seu papel na doença.

Conhecimento sobre o desenvolvimento do cérebro e doenças cerebrais melhorou significativamente na última década desde a primeira quantificação de cérebro de rato transcriptomes1. Com efeito, análise de expressão de gene ampla do genoma nos dá acesso para detalhadas informações genéticas no tecido cerebral e as células que podem complementar e melhorar as observações feitas com outras técnicas e ferramentas.
O peixe-zebra é um potente modelo biológico, fáceis de criar e modificar geneticamente; sua transparência óptica em estágios larvas permite de observações de imagens ao vivo2. Infelizmente, em comparação ao humano e mouse, o número de anticorpos disponíveis para executar imuno-coloração é um pouco baixa. Para corrigir isso, linhas de peixe zebrafish transgênicos são feitas facilmente modificando geneticamente o peixe para expressar proteínas fluorescentes sob os promotores específicos de tipo de célula. Linhas de zebrafish transgênicos têm sido utilizadas no passado para estudar o papel de macrófagos e microglia durante o desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC) e doença3,4,5,6. No entanto, para obter uma compreensão detalhada destes processos, precisamos entender mudanças na expressão gênica nos tipos de célula respectivos. Para esse fim, nós desenvolvemos um método experimental para isolar especificamente células como os neurônios, macrófagos e microglia de 3 a 8 dias cérebros de zebrafish larval pós fertilização (dpf). Para o estabelecimento do protocolo, trabalhamos com linhas de peixe transgênico que expressam a proteína verde fluorescente (GFP) em macrófagos/microglia sob o macrófago-expressa o gene promotor (mpeg1:eGFP) e DsRed nos neurônios sob a ß-tubulina neural promotor (NBT:DsRed)7,8,9. Além disso, realizamos imuno-coloração de micróglia usando 4 4, um anticorpo monoclonal de rato que especificamente manchas zebrafish microglia10,11. Depois, ácido ribonucleico (RNA) é extraído dessas células para mais quantitativas cadeia da polimerase (qPCR) ou análises de transcriptoma. Este protocolo foi projetado para homogeneizar eficientemente o tecido cerebral de zebrafish larvas; coletar os neurônios, macrófagos/microglia e microglia sem alteração de sua integridade de membrana plasmática e finalmente extrair RNA destas células em alta qualidade (RIN > 7) e a quantidade para executar análise genômica. Ao contrário de estudos anteriormente publicados que usam o tratamento de tripsina a 37 ° C para digerir o cérebro tecido12,13, este protocolo promove o trabalho em 4 ° C até a etapa de extração de RNA para reduzir as modificações do perfil de expressão do gene. Esta etapa é crucial como microglia e os macrófagos são células altamente sensíveis que respondem às mudanças em seu microambiente imediatamente, alterando seu gene expressão perfil e polarização14,15, 16.
O protocolo, aqui descrito em detalhe, mostra que o isolamento de neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros, mas virtualmente, pode ser adaptado a qualquer outra célula presentes dentro do cérebro - usando linhas de peixe transgénicos ou rotulados com anticorpos específicos. Este método irá permitir uma melhor caracterização das células CNS através de suas análises de expressão de gene ampla de genoma e ajudará a compreender o seu papel durante o desenvolvimento e doenças cerebrais.

<table><tbody><tr><td>1-fenil 2-tioureia (PTU)</td> <td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Gibco</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri padrão Sterilin 90mm</td><td>ThermoFisher</td><td>101VIRR</td><td></td></tr><tr><td>Micro-tesoura cirúrgica</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Pipeta de plástico pasteur a granel</td><td>SLS</td><td>PIP4206</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de vidro</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri padrão Sterilin 55mm</td><td>ThermoFisher</td><td>P55V</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; filtro de células m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>tubo cônico de polipropileno de 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>BD</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 23G x 1''BD</td><td></td> <td>300800</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal (NGS)</td><td>Sinalização celular</td><td>5425S</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; tampa do filtro de células m</td><td>BD</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>tubos FACS</td><td>BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Baixa Endotoxina, Livre de Azida (LEAF)</td><td>Biolegend</td><td>101321</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-4C4</td><td>Cortesia de Catherina Becker (Universidade de Edimburgo)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Classificador FACS FACSAria II</td><td>BD</td><td>QMRI, instalação</td><td></td>FACS</tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 31350-010</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 96 Sistema de PCR em Tempo Real&nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq System V2</td><td>NuGEN</td><td>7102-32</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico reagentes</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e extração de rna de neurônios, macrófagos e microglia de zebrafish larval cérebros

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Para obter uma compreensão detalhada do papel de células diferentes do CNS durante o desenvolvimento ou o estabelecimento e progressão do patologias do cérebro, é importante isolar essas células sem alterar seu perfil de expressão do gene. O modelo de zebrafish fornece um grande número de linhas de peixe transgênico em que tipos de células específicas são rotulados; por exemplo, neurônios na linha de NBT:DsRed ou macrófagos/microglia na linha de mpeg1:eGFP. Além disso, os anticorpos têm sido desenvolvidos para manchar a células específicas, tais como microglia com o 4-4 anticorpo.
Aqui, descrevemos o isolamento de neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros. Central para este protocolo é evitar uma digestão enzimática do tecido a 37 ° C, o que poderia modificar perfis celulares. Em vez disso, é usado um sistema mecânico de homogeneização do tecido a 4 ° C. Este protocolo envolve homogeneização dos cérebros em suspensão de células, sua imuno-coloração e o isolamento de neurônios, macrófagos e microglia por FACS. Depois, extraído do RNA essas células e avaliada a sua qualidade/quantidade. Conseguimos obter RNA de alta qualidade (número de integridade do RNA (RIN) > 7) para realizar qPCR em análise macrófagos/microglia e neurônios e transcriptomic na microglia. Essa abordagem permite uma melhor caracterização destas células, bem como uma compreensão mais clara sobre o seu papel no desenvolvimento e patologias.

O protocolo descrito é uma abordagem simples para isolar os neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros. A partir desses isolados de células, uma quantidade significativa de alta qualidade (RIN &gt; 7) RNA foram extraídos. O objectivo do presente protocolo é isolar diferentes tipos de células do SNC, com mínima modificação do seu perfil de expressão do gene para analisar e caracterizar as funções e propriedades da célula. Portanto, o protocolo inteiro é realizado a 4 ° C, com uma homogeneização do tecido de cérebro mecânico. Este método tem sido utilizado com sucesso para dois estudos realizados em laboratório. No primeiro estudo, os neurônios e macrófagos/microglia foram isoladas de 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ larva (Figura 1). FACS permitida a separação da pilha de detritos em função do seu tamanho (FSC-A) e granularidade (SSC-A) (Figura 1A). Células únicas foram então separadas de parelhas ou aglomerados de células (Figura 1B). Da população única célula, um portão foi desenhado para eliminar as células mortas (DAPI+). O enredo de ponto correspondente revelou que este protocolo experimental preserva a integridade da membrana plasmática celular, como a taxa de células mortas é apenas 26,7% (Figura 1C). Finalmente, neurônios (DsRed+) e macrófagos/microglia (GFP+) eram facilmente separavam os portões de população de células vivas. A população de neurônio (23,1%) parecia ser mais proeminente do que a população de macrófagos/microglia (1,56%) dentro do cérebro (Figura 1D). Este protocolo permitiu para isolar o RNA dessas células para realizar análises subsequentes qPCR para comparar a expressão de genes específicos entre os neurônios e macrófagos/microglia. A Figura 2 mostra neuronal e os níveis de expressão do gene de macrófagos/microglia do antígeno nuclear de proliferação celular (pcna)contra gene β-actina domésticas, por exemplo.
O segundo estudo este método focado em microglia isolamento de 3, 5 e 7 dpf cérebros larval. Em contraste com o experimento descrito acima, as células foram isoladas por imuno-coloração usando 4 4, um anticorpo que rotula especificamente microglia (Figura 3 A-D). Como descrito anteriormente, microglia (4 4+) foram selecionados a partir de células vivas e coletados (Figura 3-D). Microglia números dentro zebrafish larval cérebros são variáveis (tabela 1) e muito baixa no dpf 3 (∼ 25 por peixes). Qualidade e quantidade de RNA extraído dessas células foram medidos utilizando um sistema de eletroforese capilar micro baseado. Resultados obtidos do RNA extraído de micróglia 5 dpf zebrafish larval cérebros foram fornecidos para ilustrar um exemplo de análise de RNA (tabela 1 (dpf 5; experimento 4)). A Figura 4 mostra o rastreamento de eletroforese e sua representação gráfica obtidos para esta amostra com uma visualização clara do RNA ribossomal (28s e 18s). Estes dados são necessários para calcular a amostra RIN e determinar a concentração de RNA. A tabela 1 resume o número de isolados microglia por peixes, a quantidade de RNA por microglia e o escore de RIN obtido para cada experimento diferente em 3, 5 e 7 dpf. A quantidade e a qualidade do RNA extraído de micróglia isolado usando este método permitiram a amplificar o RNA em cDNA usando um kit. Testes de qualidade e quantidade fornecidos por Edimburgo genómica confirmam que o cDNA amplificado de qualidade suficiente para a preparação de biblioteca e posterior sequenciamento. A Figura 5 mostra a distribuição de tamanho de fragmentos de cDNA e sua quantidade medido utilizando um sistema eletroforético. Neste exemplo, o cDNA tinha um tamanho médio de 299bp em uma concentração de 36100 pmol/l. tabela 2 ilustra, respectivamente, qualidade e quantidade de testes feitos no cDNA amplificado de amostras do RNA (tabela 1 (dpf 5; experimento 4)). O cDNA amplificado tem sido usado com sucesso para o sequenciamento.
Vários estudos realizados em laboratório confirmaram que a qualidade e a quantidade de RNA extraído de neurônios, macrófagos e microglia podem ser usados para qPCR subsequente e as análises de expressão de gene ampla do genoma. Portanto, este protocolo experimental pode ser usado para isolar confiantemente diferentes tipos de células do CNS sem alterar sua integridade de membrana e limitando a modificação do seu perfil de expressão do gene.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> Figura 1 : FACS 8 dpf zebrafish larvas de classificação para os neurônios e macrófagos/microglia do /NBT:DsRed mpeg1:GFP++ . (A-C) Gating sucessivas mostra seleção sequencial de todo cérebro células (A), dispersão de células únicas por dispersão para a frente e lateral (B). Células (C) mortos foram excluídas pela rotulagem DAPI. (D) os neurônios e macrófagos/microglia foram identificados respectivamente pela coloração positiva DsRed e GFP. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> Figura 2 : Análise de expressão do Gene para pcna e β-actina nos neurônios e macrófagos/microglia. RNA de neurônios isolados e macrófagos/microglia pode ser transcrito em cDNA para uso em análises quantitativas de PCR. níveis de expressão de RNAm de pcna contra gene β-actina domésticas em neurônios isolados e macrófagos/microglia determinado pelo qPCR (N = 3). Mudança de dobra foi medida utilizando o método comparativo (ΔΔCT). Erro da barra representam média ± SEM. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> Figura 3 : FACS classificação para microglia de 3 larvas de zebrafish dpf. (A-C) Sucessivas sequencial Mostrar seleção associada do cérebro todas as células (A), dispersão de células únicas por dispersão para a frente e lateral (B). Células (C) mortos foram excluídas pela rotulagem DAPI. (D) Microglia foram identificados por 4 4 coloração positiva. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> Figura 4 : Resultados de eletroforese capilar-micro do RNA extraído das 5 dpf zebrafish microglia. Os dois picos altos são o RNA ribosomal 18S e 28S. Número de integridade do RNA (RIN) foi calculado automaticamente pelo software bioanalyzer usando a relação gerada da 18S e 28S subunidades ribossomais e a análise do rastreamento eletroforética inteira. Microglia RNA tem um RIN 8,6. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> Figura 5 : Testes de qualidade e quantidade do cDNA amplificado de amostra de RNA de 5 dpf zebrafish microglia. A imagem mostra a distribuição de tamanho de fragmento do cDNA da amostra analisada com um tamanho médio de 299 BP <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Condição</td>
			<td>Experimento</td>
			<td>Número de peixes</td>
			<td>Número do celular</td>
			<td>Número de células por peixes</td>
			<td>Concentração de RNA (pg/ul)</td>
			<td>RNA total (pg)</td>
			<td>Quantidade de RNA por célula (pg)</td>
			<td>Pontuação de RIN</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17,03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37.55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31.15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0.16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18.54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0,10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19,94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0,26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0.07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54,18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0,09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84.59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0,06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99.87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0.08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092</td>
			<td>0,06</td>
			<td>7,8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Resumo de isolamento microglia e dados de extração de RNA de 3, 5 e 7 dpf zebrafish larvas.
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ID de amostra interna</td>
			<td>ID de amostra externo</td>
			<td>Qubit (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(ng/ul)</td>
			<td>Concentração média (ng/ul)</td>
			<td>Volume (ul)</td>
			<td>UG recebido</td>
			<td>Aprovação/reprovação para concentração mínima</td>
			<td>Aprovação/reprovação para quantidade de minimim</td>
			<td>Aprovação/reprovação para quantidade recomendada</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 dpf (experimento 4)</td>
			<td>58,8</td>
			<td>58,4</td>
			<td>58,6</td>
			<td>30</td>
			<td>1.76</td>
			<td>Passar</td>
			<td>Passar</td>
			<td>Passar</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">Requisitos de amostra para a preparação da biblioteca:</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biblioteca Prep</td>
			<td>Quantidade mínima (ng)</td>
			<td>Quantidade recomendada (ng)</td>
			<td>Mínima concentração ng/uL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TruSeq Nano gel biblioteca inserção livre bp 350 de cDNA</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Testes de quantidade de cDNA amplificado de amostra de RNA de 5 dpf zebrafish microglia.

Apresentamos um protocolo para isolar os neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros sob condições fisiológicas e patológicas. Após o isolamento, RNA é extraído dessas células para analisar seu perfil de expressão do gene. Este protocolo permite para a coleção de RNA de alta qualidade para a realização de análise a jusante como qPCR e transcriptomics.

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

O objetivo geral deste protocolo é isolar neurônios, macrófagos e microglia de cérebros de larvas de peixe-zebra e extrair RNA de alta qualidade para realizar análises a jusante, como qPCR e transcriptômica. As larvas de peixe-zebra transgênicas são uma ferramenta poderosa para imagens ao vivo e nos dão a oportunidade de observar células individuais como a microglia em seu ambiente de vida ao longo do tempo. No entanto, para obter uma compreensão detalhada de suas funções, precisamos entender seu perfil de expressão gênica, e nosso protocolo de isolamento e classificação é projetado para esse fim.A principal vantagem dessa técnica é que ela pode isolar diferentes tipos de células do sistema nervoso central com modificações mínimas em seu perfil de expressão gênica, para que as funções e propriedades celulares possam ser caracterizadas. A eficiência deste protocolo reflete-se na sua eficácia. Com este protocolo, quantidades suficientes de RNA podem ser produzidas em curtos períodos de tempo para várias aplicações downstream.Depois de criar embriões de peixe-zebra em meio E3 contendo PTU de acordo com o protocolo de texto, use um estereomicroscópio fluorescente para rastrear larvas em dois dpf para macrófagos positivos para GFP e micróglia em neurônios positivos para DsRED. Para homogeneizar os embriões em um ponto, cinco ml de Tricaína 15 milimolar por 50 ml de meio a 50 larvas para preparar a anestesia. Em seguida, use uma pipeta Pasteur de três ml para transferir 10 larvas de cada vez para uma placa de Petri de 55 ml cheia de meio E3 gelado com tricaína para anestesiar terminalmente.Sob um esteromicroscópio, alinhe 10 larvas no centro da placa de Petri e, em seguida, usando uma microtesoura cirúrgica, corte as cabeças larvais acima do saco vitelino. Com uma pipeta Pasteur de três ml, pegue todas as cabeças e, com o mínimo de líquido possível, transfira-as para um homogeneizador de vidro com gelo contendo um ml de meio gelado A. Substitua cada pequena placa de Petri contendo E3 mais tricaína gelada por uma nova a cada 30 minutos para garantir que a transecção seja realizada em meio E3 mais tricaína frio. Substitua a Mídia A gelada no homogeneizador de vidro quando a cor começar a desbotar.Uma vez que todo o grupo de cabeças tenha sido coletado, remova todo o meio A do homogeneizador de vidro e substitua-o por um ml de meio fresco gelado A. Com o homogeneizador ainda no gelo, use um pilão bem ajustado para romper o tecido cerebral realizando 40 rodadas de esmagamento e voltas para três a cinco larvas de dpf e 50 rodadas para sete e oito larvas de dpf. Em seguida, adicione dois ml de Meio A à suspensão celular para diluir as células e reduzir sua aglomeração com mielina. Elimine a aglomeração celular passando a suspensão celular através de um filtro de células de 40 mícrons em um tubo de falcão frio de 50 ml no gelo.Repita esta etapa três vezes. Transferir alíquotas de um ml de suspensão celular para tubos frios de um ponto e cinco ml e centrifugá-los a 300 vezes g e quatro graus Celsius durante 10 minutos. Em seguida, usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de calibre 23 de uma polegada, remova o sobrenadante.Com um ml de meio gelado com gradiente de densidade de 22 por cento suavemente sobreposto por zero vírgula cinco ml de 1X dbps gelado, ressuspenda suavemente o pellet celular. Gire os tubos a 950 vezes g sem interrupção na aceleração lenta a quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a centrifugação, descarte o meio de gradiente de densidade dbps na mielina preso em sua interfase.Em seguida, use cinco ml de meio A com dois por cento de NGS para lavar as células e gire os tubos a 300 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Remova o máximo de sobrenadante possível e, em seguida, junte os grânulos celulares da mesma condição experimental em um ml de Meio A com dois por cento de NGS. Se as células de interesse expressarem uma proteína fluorescente, passe a suspensão celular por uma tampa de filtro de células de 35 mícrons e transfira-as para tubos FACS frios de 5 ml em gelo protegido da luz.Para imunocorar a microglia, use três ml de ponto zero de meio A mais dois por cento de NGS para ressuspender o pellet celular e, em seguida, divida as células entre três tubos de um ponto e cinco ml, um para células não coradas para medir a autofluorescência, um para medir a ligação inespecífica de um anticorpo secundário à microglia e um terceiro como teste. A todos os tubos, adicione um por cento de baixa endotoxina livre de azida ou uma folha para bloquear as interações CD16, CD32 com o domínio FC das imunoglobulinas. Em seguida, incube as células por 10 minutos com agitação suave a cada cinco minutos.Em seguida, ao terceiro tubo, adicione o anticorpo 4C4 e incube-o por 30 minutos com agitação suave a cada 10 minutos. Em seguida, gire os tubos a 300 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Depois de descartar o sobrenadante, lave o pellet uma vez com zero vírgula cinco ml de Meio A mais dois por cento de NGS antes de girar os tubos novamente.Ressuspenda o pellet celular com zero vírgula cinco ml de Meio A mais dois por cento de NGS, em seguida, adicione uma folha de um por cento e incube as células por 10 minutos com agitação suave a cada cinco minutos. Aos tubos dois e três, adicione anticorpos secundários e coloque os tubos no escuro. Depois de girar os tubos e descartar o sobrenadante, use cinco ml de meio A mais dois por cento de NGS para lavar as amostras duas vezes e, em seguida, ressuspenda os grânulos celulares com um ml de meio A mais dois por cento de NGS.Passe a suspensão celular por uma tampa de filtro de célula de 35 mícrons e transfira-a para tubos FACS frios de cinco ml em gelo protegido da luz. Por fim, realize a classificação FACS e a extração de RNA de acordo com o protocolo de texto. Neste estudo, neurônios e macrófagos mais microglia foram isolados de oito larvas positivas para NBT dsRED dpf mpeg1 EGFP.O FACS foi usado para separar as células dos detritos em função de seu tamanho e granularidade. Células individuais foram então separadas de gibões ou aglomerados celulares. Da população de células únicas, um portão foi desenhado para eliminar as células mortas.O gráfico de pontos correspondente revelou que este protocolo experimental preserva a integridade da membrana plasmática celular, pois a taxa de células mortas é de apenas 26,7%. Como mostrado aqui, neurônios e macrófagos mais microglia foram facilmente segregados dos portões da população de células vivas. Dentro do cérebro, a população de neurônios parecia ser mais proeminente do que a população de macrófagos e micróglias.Em um segundo estudo, a classificação FACS foi usada para isolar microglia viva de cérebros larvais com 4C4, um anticorpo que rotula especificamente a microglia. Conforme resumido nesta tabela de dados de isolamento de microglia e extração de RNA, o número de microglia nos cérebros das larvas de peixe-zebra varia e é muito baixo em três dpf. Finalmente, os resultados da extração de RNA obtidos com um experimento de microglia de cinco cérebros de larvas de peixe-zebra dpf são mostrados neste traço de eletroforese com uma visualização clara do RNA ribossômico.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 12 horas, dependendo de quantas cabeças são necessárias por condição. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter tudo frio e as superfícies limpas para evitar a degradação do RNA. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores da área de neurociências que usam o peixe-zebra como modelo para explorar perfis de expressão gênica de diferentes células em condições fisiológicas e patológicas.Depois de assistir ao vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar neurônios, macrófagos e micróglias de cérebros de larvas de peixe-zebra e como extrair RNA de alta qualidade para realizar análises posteriores, como qPCR e transcriptômica.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve a técnica de microdissecção do cérebro de um peixe-zebra adulto. Este método ajuda na obtenção de neurosferas derivadas de todo o cérebro que podem ser estudadas mais a fundo.

Dissecção do cérebro do peixe-zebra: uma técnica de neurobiologia de peixes

Este vídeo descreve um protocolo para isolar neurônios, macrófagos e microglia de cérebros de larvas de peixe-zebra, interrompendo mecanicamente o tecido cerebral. As populações de células purificadas podem ser usadas para análise genômica.

Isolamento de células cerebrais de larvas de peixe-zebra: uma técnica para obter neurônios, macrófagos e microglia intactos do tecido cerebral do peixe-zebra

Neste vídeo, isolamos células microgliais de peixe-zebra por meio de classificação de células acopladas a imunocoloração. A microglia isolada pode ser usada em experimentos a jusante para entender seu papel em patologias cerebrais.

Isolamento de Microglia por Classificação de Células Acopladas por Imunocoloração: Um Método de Imunocoloração para Isolar Microglia de Células Cerebrais de Peixe-Zebra Usando Classificação de Células Ativadas por Fluorescência

Gene análise de um subconjunto de células num tecido específico de expressão representa um grande desafio. Este artigo descreve como isolar RNA total de alta qualidade a partir de uma população de células específicas, combinando um método rápido imunomarcação com captura a laser microdissection.

Isolamento de RNA celular subpopulações específicas Utilizando captura de Laser Microdissection combinada com o rápido immunolabeling

Aqui é proporcionado um método reprodutível para estudar a neurogénese adulto utilizando um ensaio neuroesfera derivado de todo o cérebro ou a partir de qualquer telencefálicos tectal ou regiões do cerebelo do cérebro adulto peixe-zebra. Além disso, descreve-se o procedimento para manipular a expressão de genes em neuroesferas de peixe-zebra.

Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro

Este protocolo apresenta uma abordagem para a análise do transcriptoma toda de zebrafish embriões, larvas, ou células de classificados. Nós incluímos o isolamento do RNA, análise de caminho de dados de RNASeq e validação de qRT-PCR-baseados de mudanças de expressão do gene.

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

Apresentamos um protocolo eficiente e fácil de usar para a preparação de culturas de células primárias de zebrafish embriões para transfeccao e imagens de células vivas, bem como um protocolo para preparar as células primárias do cérebro adulto zebrafish.

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Este protocolo demonstra a microinjeção de lipopolissacarídeo na região ventricular cerebral em um modelo larval de peixe-zebra para estudar a resposta neuroinflamatória e a neurotoxicidade resultantes.

Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade

Aqui, descrevemos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias após a fertilização, para análise de sequenciamento de RNA de célula única.

Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única

Demonstramos um método que aproveita a microscopia confocal de varredura rápida para realizar imagens ao vivo de células da microglia no tectum óptico do peixe-zebra em desenvolvimento, permitindo a análise da dinâmica dessas células in vivo.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia no embrião de peixe-zebra

Aprenda a isolar neurônios, macrófagos e microglia de cérebros de larvas de zebrafish e extrair RNA de alta qualidade para análises de qPCR e transcriptômica. Este protocolo permite estudar perfis de expressão gênica em condições fisiológicas e patológicas.

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

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