Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

O objetivo geral deste protocolo é isolar neurônios, macrófagos e microglia de cérebros de larvas de peixe-zebra e extrair RNA de alta qualidade para realizar análises a jusante, como qPCR e transcriptômica. As larvas de peixe-zebra transgênicas são uma ferramenta poderosa para imagens ao vivo e nos dão a oportunidade de observar células individuais como a microglia em seu ambiente de vida ao longo do tempo. No entanto, para obter uma compreensão detalhada de suas funções, precisamos entender seu perfil de expressão gênica, e nosso protocolo de isolamento e classificação é projetado para esse fim.

A principal vantagem dessa técnica é que ela pode isolar diferentes tipos de células do sistema nervoso central com modificações mínimas em seu perfil de expressão gênica, para que as funções e propriedades celulares possam ser caracterizadas. A eficiência deste protocolo reflete-se na sua eficácia. Com este protocolo, quantidades suficientes de RNA podem ser produzidas em curtos períodos de tempo para várias aplicações downstream.

Depois de criar embriões de peixe-zebra em meio E3 contendo PTU de acordo com o protocolo de texto, use um estereomicroscópio fluorescente para rastrear larvas em dois dpf para macrófagos positivos para GFP e micróglia em neurônios positivos para DsRED. Para homogeneizar os embriões em um ponto, cinco ml de Tricaína 15 milimolar por 50 ml de meio a 50 larvas para preparar a anestesia. Em seguida, use uma pipeta Pasteur de três ml para transferir 10 larvas de cada vez para uma placa de Petri de 55 ml cheia de meio E3 gelado com tricaína para anestesiar terminalmente.

Sob um esteromicroscópio, alinhe 10 larvas no centro da placa de Petri e, em seguida, usando uma microtesoura cirúrgica, corte as cabeças larvais acima do saco vitelino. Com uma pipeta Pasteur de três ml, pegue todas as cabeças e, com o mínimo de líquido possível, transfira-as para um homogeneizador de vidro com gelo contendo um ml de meio gelado A. Substitua cada pequena placa de Petri contendo E3 mais tricaína gelada por uma nova a cada 30 minutos para garantir que a transecção seja realizada em meio E3 mais tricaína frio. Substitua a Mídia A gelada no homogeneizador de vidro quando a cor começar a desbotar.

Uma vez que todo o grupo de cabeças tenha sido coletado, remova todo o meio A do homogeneizador de vidro e substitua-o por um ml de meio fresco gelado A. Com o homogeneizador ainda no gelo, use um pilão bem ajustado para romper o tecido cerebral realizando 40 rodadas de esmagamento e voltas para três a cinco larvas de dpf e 50 rodadas para sete e oito larvas de dpf. Em seguida, adicione dois ml de Meio A à suspensão celular para diluir as células e reduzir sua aglomeração com mielina. Elimine a aglomeração celular passando a suspensão celular através de um filtro de células de 40 mícrons em um tubo de falcão frio de 50 ml no gelo.

Repita esta etapa três vezes. Transferir alíquotas de um ml de suspensão celular para tubos frios de um ponto e cinco ml e centrifugá-los a 300 vezes g e quatro graus Celsius durante 10 minutos. Em seguida, usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de calibre 23 de uma polegada, remova o sobrenadante.

Com um ml de meio gelado com gradiente de densidade de 22 por cento suavemente sobreposto por zero vírgula cinco ml de 1X dbps gelado, ressuspenda suavemente o pellet celular. Gire os tubos a 950 vezes g sem interrupção na aceleração lenta a quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a centrifugação, descarte o meio de gradiente de densidade dbps na mielina preso em sua interfase.

Em seguida, use cinco ml de meio A com dois por cento de NGS para lavar as células e gire os tubos a 300 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Remova o máximo de sobrenadante possível e, em seguida, junte os grânulos celulares da mesma condição experimental em um ml de Meio A com dois por cento de NGS. Se as células de interesse expressarem uma proteína fluorescente, passe a suspensão celular por uma tampa de filtro de células de 35 mícrons e transfira-as para tubos FACS frios de 5 ml em gelo protegido da luz.

Para imunocorar a microglia, use três ml de ponto zero de meio A mais dois por cento de NGS para ressuspender o pellet celular e, em seguida, divida as células entre três tubos de um ponto e cinco ml, um para células não coradas para medir a autofluorescência, um para medir a ligação inespecífica de um anticorpo secundário à microglia e um terceiro como teste. A todos os tubos, adicione um por cento de baixa endotoxina livre de azida ou uma folha para bloquear as interações CD16, CD32 com o domínio FC das imunoglobulinas. Em seguida, incube as células por 10 minutos com agitação suave a cada cinco minutos.

Em seguida, ao terceiro tubo, adicione o anticorpo 4C4 e incube-o por 30 minutos com agitação suave a cada 10 minutos. Em seguida, gire os tubos a 300 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Depois de descartar o sobrenadante, lave o pellet uma vez com zero vírgula cinco ml de Meio A mais dois por cento de NGS antes de girar os tubos novamente.

Ressuspenda o pellet celular com zero vírgula cinco ml de Meio A mais dois por cento de NGS, em seguida, adicione uma folha de um por cento e incube as células por 10 minutos com agitação suave a cada cinco minutos. Aos tubos dois e três, adicione anticorpos secundários e coloque os tubos no escuro. Depois de girar os tubos e descartar o sobrenadante, use cinco ml de meio A mais dois por cento de NGS para lavar as amostras duas vezes e, em seguida, ressuspenda os grânulos celulares com um ml de meio A mais dois por cento de NGS.

Passe a suspensão celular por uma tampa de filtro de célula de 35 mícrons e transfira-a para tubos FACS frios de cinco ml em gelo protegido da luz. Por fim, realize a classificação FACS e a extração de RNA de acordo com o protocolo de texto. Neste estudo, neurônios e macrófagos mais microglia foram isolados de oito larvas positivas para NBT dsRED dpf mpeg1 EGFP.

O FACS foi usado para separar as células dos detritos em função de seu tamanho e granularidade. Células individuais foram então separadas de gibões ou aglomerados celulares. Da população de células únicas, um portão foi desenhado para eliminar as células mortas.

O gráfico de pontos correspondente revelou que este protocolo experimental preserva a integridade da membrana plasmática celular, pois a taxa de células mortas é de apenas 26,7%. Como mostrado aqui, neurônios e macrófagos mais microglia foram facilmente segregados dos portões da população de células vivas. Dentro do cérebro, a população de neurônios parecia ser mais proeminente do que a população de macrófagos e micróglias.

Em um segundo estudo, a classificação FACS foi usada para isolar microglia viva de cérebros larvais com 4C4, um anticorpo que rotula especificamente a microglia. Conforme resumido nesta tabela de dados de isolamento de microglia e extração de RNA, o número de microglia nos cérebros das larvas de peixe-zebra varia e é muito baixo em três dpf. Finalmente, os resultados da extração de RNA obtidos com um experimento de microglia de cinco cérebros de larvas de peixe-zebra dpf são mostrados neste traço de eletroforese com uma visualização clara do RNA ribossômico.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 12 horas, dependendo de quantas cabeças são necessárias por condição. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter tudo frio e as superfícies limpas para evitar a degradação do RNA. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores da área de neurociências que usam o peixe-zebra como modelo para explorar perfis de expressão gênica de diferentes células em condições fisiológicas e patológicas.

Depois de assistir ao vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar neurônios, macrófagos e micróglias de cérebros de larvas de peixe-zebra e como extrair RNA de alta qualidade para realizar análises posteriores, como qPCR e transcriptômica.