Name: Bioativa de Prussian Blue Nanopartículas para Multimodal Imagem Molecular Applications (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprenda a sintetizar nanopartículas de azul da Prússia biofuncionalizadas com íons de gadolínio ou manganês para imagem molecular multimodal por ressonância magnética e fluorescência.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Sheikh Zayed de Inovação Cirúrgica Pediátrica (RAC Awards #30000174 e 30001489).

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Os autores não têm nada a divulgar.

Este artigo apresentou os métodos para a síntese de uma nova classe de agentes de imagem multimodais, moleculares baseados em nanopartículas bioativa de azul da Prússia. As modalidades de imagem molecular incorporados nas nanopartículas são imagens de fluorescência e ressonância magnética molecular, devido às suas características complementares. As nanopartículas azuis cobalto bioativa de ter um design core-shell. As principais etapas da síntese destas nanopartículas são: 1) one-pot síntese, que dá os núcleos que são co...

A imagem molecular é a visualização não invasiva e direcionada de processos biológicos no celular, subcelular e níveis moleculares 1. A imagem molecular permite um espécime a permanecer no seu microambiente nativa, enquanto as suas vias e mecanismos endógenos são avaliados em tempo real. Tipicamente, imagiologia molecular envolve a administração de um agente de imagiologia exógeno sob a forma de uma molécula pequena, macromolécula, ou nanopartículas para visualizar, alvo, e rastrear processos fisiológicos relevantes serem estudados 2. As diversas modalidades de imagem que foram exploradas em imagem molecular incluem MRI, CT, PET, SPECT, ultra-som, photoacoustics, espectroscopia Raman, bioluminescência, fluorescência e microscopia intravital 3. Imagiologia multimodal é a combinação de dois ou mais modalidades de imagem em que a combinação aumenta a capacidade de visualizar e caracterizar vários processos e eventos biológicos 4. Multimodal imaging explora os pontos fortes das técnicas de imagem individuais, enquanto compensar suas limitações individuais 3. Este artigo apresenta o protocolo para a síntese de nanopartículas azuis cobalto bioativa (PB NPS) - uma nova classe de agentes de imagem multimodais, moleculares. Os PB NPs são utilizados para geração de imagens de fluorescência e MRI molecular. OP é um pigmento que consiste de ferro (II) e (III) átomos de ferro alterno numa rede cúbica de face centrada (Figura 1). A estrutura é composta de PB ligandos lineares de cianeto de uma liga de Fe II - CN - Fe III ligação que incorpora catiões para equilibrar cargas da sua rede tridimensional 5. A capacidade de PB para incorporar cátions em sua estrutura é explorada por carregar separadamente gadolínio e manganês nas NPs PB para o contraste de ressonância magnética. A justificativa para perseguir um projeto de nanopartículas para o contraste MRI é por causa deas vantagens deste projeto oferece em relação a agentes de contraste MRI atuais. A grande maioria dos agentes de contraste de MRI e aprovado pelo FDA dos EUA são o gadolínio que são paramagnética na natureza e oferecem contraste positivo pelo spin-estrutura mecanismo de relaxamento 6,7,8. Em comparação com um único gadolínio-quelato que proporciona uma baixa intensidade de sinal por si só, a incorporação de vários iões gadolínio dentro da estrutura PB das nanopartículas proporciona uma maior intensidade de sinal (contraste positivo) 3,9. Além disso, a presença de vários iões gadolínio dentro da rede PB aumenta a densidade geral de rotação e a magnitude do paramagnetismo das nanoparticulas, o que perturba o campo magnético local na sua vizinhança, gerando assim contraste negativo pelo mecanismo de relaxação spin-spin. Assim, as nanopartículas contendo gadolínio funcionar tanto como um T (positivo) e T 2 (agentes de contraste negativo) 10,11. Num subgrupo de pacientes com insuficiência renal, a administração de agentes de contraste à base de gadolínio tem sido associada ao desenvolvimento de fibrose sistémica nefrogénica 8,12, 13. Esta observação levou a investigações sobre a utilização de iões paramagnéticos alternativos como agentes de contraste para MRI. Por conseguinte, o desenho versátil das nanopartículas está adaptado para incorporar os iões de manganês dentro da rede PB. Semelhante a quelatos de gadolínio, manganês quelatos também são paramagnéticos e são normalmente utilizados para proporcionar a intensidade de sinal positivo em MRI 7,14. Tal como acontece com gadolínicos PB PN, os contendo manganês PB PN também funcionar como um T (positivo) e T 2, os agentes de contraste (negativo). Para incorporar capacidades de imagem de fluorescência, as nanopartículas &quot;núcleos&quot; são revestidas com um invólucro &quot;biofuncional&quot; consistindo de avidina marcada fluorescentemente-glicoproteína (Figura 1). Avidina não apenas permite imagens de fluorescência, mas também serve como uma plataforma de acoplagem para ligandos biotinilados que alvejam as células e tecidos específicos. A ligação de avidina-biotina é uma das mais fortes conhecidas, ligações não-covalentes caracterizados por afinidade de ligação extremamente forte entre a avidina e a biotina 15. A fixação de ligantes bioestanhados ao revestida com avidina PB NPs confere capacidades de segmentação moleculares para os PN PB. A motivação para a prossecução de fluorescência e imagem latente usando PB NPs é porque estas modalidades de imagem possuem características complementares. Imagens de fluorescência é uma das técnicas de imagem molecular ópticos mais utilizado, e permite a visualização simultânea de vários objetos em altas sensibilidades 1,16,17. Imagens de fluorescência é um cofre, modalidade não-invasivo, mas está associada a baixos profundidades de penetração e resoluções espaciais 1,3,16. Por outro lado, a RM gera uma alta temporaisd resolução espacial de forma não invasiva e sem a necessidade de radiação ionizante 1,3,16. No entanto MRI sofre de baixa sensibilidade. Portanto imagens de fluorescência e RM foram selecionados como as técnicas de imagem molecular, devido às suas características complementares de penetração em profundidade, sensibilidade e resolução espacial. Este artigo apresenta o protocolo para a síntese e biofunctionalization das NPs PB, PB PN (GdPB), e contendo gadolínio PB PN (MnPB) 10,11 contendo manganês. Os seguintes métodos são descritos: 1) de medição de tamanho, carga, e estabilidade temporal das nanopartículas, 2) avaliação da citotoxicidade das nanopartículas, 3) de medição de relaxamentos MRI, e 4) a utilização de nanopartículas para fluorescência e ressonância magnética molecular de uma população de células alvo in vitro. Estes resultados demonstram o potencial dos PN para utilização como agentes de imagem moleculares multimodais, in vivo.

<table><tbody><tr><td>Hexacianoferrato de potássio (II) tri-hidratado (K4Fe(CN)6&middot; 3H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de manganês (II) tetrahidratado (MnCl2&middot; 4H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>nitrato de gadolínio (III) hexa-hidratado (Gd(NO3)3&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211591</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de ferro (III) hexahidratado (FeCl3&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Sulfato de Condroitina Proteoglicano, Anticorpo Conjugado de Biotina</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilado Anti-Eotaxina-3</td> Neuro-2a <td>Peprotech</td><td>500-P156GBT</td><td></td></tr><tr><td>Linha Celular</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular BSG D10</td><td>Estoque de laboratório</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>OE21 Linha celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96062201</td><td></td></tr><tr><td>SUDIPG1 Neuroesferas</td><td>Estoque de laboratório</td><td>---</td><td></td></tr> <tr><td>Linha celular Eol-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94042252</td><td></td></tr><tr><td>bromidrato de poli(L-lisina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1399</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Aminoactinomicina D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Calcein Red-Orange, AM</td><td>Life Technologies</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>Avidin-Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21370</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica</td><td>Instech</td><td>P270</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>QSonica</td><td>Q125</td><td></td></tr><tr><td>Placa Quente/Agitador Magnético</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>Folha de Alumínio Ultra Limpa</td><td>VWR</td><td>89107-732</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Misturador</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga cónicos de 1,7 ml</td><td>VWR</td><td>87003-295</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>Suportes de tubos</td><td>VWR</td><td>82024-342</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de plástico descartáveis</td><td>VWR</td><td>7000-590 (/586)</td><td></td></tr><tr><td>Célula capilar Zetasizer</td><td>VWR</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Filtros centrífugos, coluna giratória de 0,2 micrómetros</td><td>VWR</td><td>82031-356</td><td></td></tr><tr><td>Tabuleiro de cultura de células de 96 poços</td><td>VWR</td><td>29442-056</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 0,25% solução 1x</td><td>JR Scientific</td><td>82702</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Grade PBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>XTT Kit de Ensaio de Proliferação Celular</td><td>Trevigen</td><td>4891-025-K</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flask</td><td>89092-700</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Biowhitaker</td><td>12-604Q</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td> Life <td>Technologies</td><td>10437-010</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep 1x</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal de Varredura a Laser Fluoview FV1200</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio</td> com Câmara <td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, Quadrado, No. 1.5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur Citômetro de Fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 T Ímã de Ressonância Magnética Clínica</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balão</td><td></td><td></td><td></td> de fundo redondo de 100 ml</tr></tbody></table>

bioativa de prussian blue nanopartículas para multimodal imagem molecular applications

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, imagiologia molecular permite a visualização de processos biológicos em resoluções celulares, subcelulares, e em nível molecular, utilizando várias técnicas de imagem, complementares. Esses agentes de imagiologia facilitar a avaliação em tempo real das vias e mecanismos in vivo, o que aumenta tanto a eficácia de diagnóstico e terapêutico. Este artigo apresenta o protocolo para a síntese de nanopartículas azuis cobalto bioativa (PB NPS) - uma nova classe de agentes para a utilização em aplicações de imagem molecular multimodais. As modalidades de imagem incorporados no nanopartículas, imagens de fluorescência e imagem por ressonância magnética (MRI), têm características complementares. As NPs PB possui um desenho de núcleo-invólucro que o gadolínio e iões de manganês incorporados dentro dos espaços intersticiais do retículo PB gerar contraste para IRM, tanto em T 1 e T 2 sequências ponderadas. Os PB NPs são revestidas com avidina fluorescente usando eletrostática auto-comotagem, o que permite imagens de fluorescência. As nanopartículas revestidas com avidina são modificados com ligandos biotinilados que conferem capacidades de segmentação moleculares para as nanopartículas. A estabilidade e a toxicidade das nanopartículas são medidos, bem como os seus relaxividades MRI. Os recursos de imagens multimodais, moleculares destas PB NPs bioativa são então demonstrada, utilizando-os para imagens de fluorescência e ressonância magnética molecular in vitro.

Usando o esquema de síntese de um pote, nanopartículas de PB PN (diâmetro médio de 78,8 nm, índice de polidispersão (PDI) = 0,230; calculado pelo instrumento de espalhamento de luz dinâmico), GdPB (diâmetro médio de 164,2 nm, PDI = 0,102), ou MnPB ( diâmetro médio de 122,4 nm, PDI = 0,124) que são monodispersas (como medido por DLS) pode ser sintetizado de forma consistente (Figura 2A). Os potenciais zeta medidos das partículas sintetizadas são menos do que -30 mV (Figura 2B), indicando...

Este protocolo descreve a síntese de nanopartículas biofuncionalizadas de azul da Prússia e seu uso como agentes de imagem molecular multimodais. As nanopartículas têm um design de núcleo-casca onde os íons de gadolínio ou manganês dentro do núcleo da nanopartícula geram contraste de ressonância magnética. O invólucro biofuncional contém fluoróforos para imagens de fluorescência e ligantes de direcionamento para direcionamento molecular.

Bioativa de Prussian Blue Nanopartículas para Multimodal Imagem Molecular Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar nanopartículas de azul da Prússia biofuncionalizadas para utilização como agentes de imagem molecular multimodal. Isso é realizado primeiramente pela síntese de nanopartículas de azul da Prússia que contêm íons de gadolínio ou manganês, os quais realçam o sinal de RNM. O segundo passo consiste em ligar o fluoróforo avadina à superfície das nanopartículas, conferindo-lhes capacidade de imagem por fluorescência.Em seguida, as nanopartículas revestidas com avadon são biofuncionalizadas com os anticorpos biotinilados desejados para direcionamento celular. Um passo final consiste em realizar uma verificação de controle de qualidade das nanopartículas biofuncionalizadas, medindo seu tamanho, potencial zeta e estabilidade temporal. Em última instância, as nanopartículas biofuncionalizadas são utilizadas em aplicações de imagem molecular multimodal para visualizar uma população específica de células-alvo dentro de uma mistura, utilizando imagem por fluorescência e ressonância magnética.Os agentes de imagemagem comerciais atuais são tipicamente unimodais e oferecem resolução apenas no nível anatômico. As nanopartículas de azul da Prússia combinam dois modos complementares de imagemagem — RNM e fluorescência — e permitem imagemagem molecular e em níveis subcelulares. As aplicações de nanopartículas multifuncionais estendem-se ao diagnóstico de câncer e doenças inflamatórias, além do monitoramento da resposta ao tratamento dessas condições.Isso ocorre porque nanopartículas biofuncionalizadas podem direcionar-se e ligar-se a uma população de células dentro de uma região específica do corpo. Embora este método possa fornecer informações sobre o diagnóstico de câncer e doenças inflamatórias, bem como a resposta ao tratamento, ele também pode ser aplicado a outras condições patológicas que se beneficiem da sensibilidade e especificidade da imagem molecular. Utilizando fluorescência e ressonância magnética, tivemos inicialmente a ideia de produzir essas nanopartículas quando determinamos que o azul da Prússia, um agente aprovado pela FDA para consumo oral humano, poderia ser sintetizado de forma estável por meio de um esquema de síntese em uma única etapa e robustamente biofuncionalizado utilizando técnicas padrão de bioconjugação.Para começar, prepare uma solução 5 milimolar de hexacianoferrato(II) de potássio em cinco mililitros de água deionizada para obter a solução A. Em seguida, prepare a solução B contendo cloreto de ferro(III) 2,5 milimolar e cloreto de manganês(II) 2,5 milimolar em 10 mililitros de água deionizada para a síntese de nanopartículas de azul da Prússia de manganês. Outras nanopartículas podem ser sintetizadas conforme indicado no protocolo do texto. Transfira a solução B para um balão de fundo redondo e agite a solução a 1000 rpm à temperatura ambiente.Usando uma bomba peristáltica, adicione a solução A gota a gota ao recipiente a uma taxa de 10 mililitros por hora. Após a adição completa da solução A, agite a mistura a 1000 rpm por mais 30 minutos. Em seguida, transfira alíquotas de um mililitro da mistura para tubos de microcentrífuga e adicione 0,2 mililitros de cloreto de sódio cinco milimolar a cada tubo.Centrifugue os tubos a 20.000 × g durante pelo menos 10 minutos e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando o pellet de nanopartículas. Em seguida, adicione um mililitro de água desionizada a cada pellet. Use uma ponteira micrométrica para suspender uniformemente as nanopartículas em solução por sonicação.Lave as nanopartículas pelo menos mais três vezes para remover os componentes da reação inicial da suspensão após a última centrifugação, reconstitua as nanopartículas em um mililitro de água desionizada após revestir as nanopartículas com den fluorescente conforme descrito no protocolo do texto, retire os estoques de anticorpos biotinilados da geladeira. Aqui. Utilize antígeno glial neuronal dois e anti-eotaxina humana três. Transfira o anticorpo biotinilado para um filtro microfuga de náilon de 0,2 micrômetros e, em seguida, centrifugue o tubo a 14.000 × g por 10 minutos.Em seguida, adicione menos de ou igual a 0,05 miligrama do anticorpo por miligrama de nanopartículas revestidas com Aden e cubra os tubos com papel alumínio para protegê-los da luz. Incube os tubos sob agitação suave por duas a quatro horas a quatro graus Celsius. Após a ligação dos anticorpos, adicione 10 microlitros de uma amostra de nanopartículas de um miligrama por mililitro a 990 microlitros de água desionizada em um vete plástico descartável, tampe o vete e vorteie para homogeneizar.Em seguida, determine o tamanho médio das nanopartículas utilizando um sistema de espalhamento dinâmico de luz com um ângulo de medição de 173 graus. Comece preparando suspensões de 10 mililitros de células em PBS numa concentração de aproximadamente 100.000 células por mililitro; para culturas mistas, tubos contendo diferentes proporções de cada linhagem celular devem ser preparados conforme descrito no protocolo textual. Adicione dois mililitros de BSA a 5% a cada tubo para bloquear as células e minimizar a ligação não específica. Em seguida, adicione um mililitro de nanopartículas biofuncionalizadas a um miligrama por mililitro a cada tubo e incube a mistura por uma hora.Em seguida, remova as nanopartículas não ligadas lavando as células por meio da centrifugação dos tubos a 1000 × g durante cinco minutos e ressuspendendo os pellets em um mililitro de PBS. Repita este processo pelo menos mais duas vezes. Fixe as células utilizando formaldeído a 10% em PBS e, em seguida, adicione 10 microgramas por mililitro de sete amino actinomicina D em PBS para corar as células, incube o tubo em gelo por 30 minutos e, depois, lave as células com PBS.Em seguida, carregue a amostra no citômetro de fluxo e analise 10.000 células dentro do gate de cada amostra. Um procedimento semelhante para imagens de células ligadas a nanopartículas fluorescentes utilizando microscopia confocal a laser é descrito no protocolo textual. Para começar, cultive as células em frascos T75 até aproximadamente 80% de confluência e, em seguida, lave as células para remover o meio com cinco mililitros de PBS.Adicione cinco mililitros de BSA 1% em PBS e bloquee as células por uma hora. Em seguida, adicione cinco mililitros de nanopartículas recobertas com anticorpo a 0,5 miligramas por mililitro ao frasco e incube as células por uma hora para permitir a ligação das nanopartículas. A seguir, lave as células três vezes com cinco mililitros de PBS para remover as nanopartículas não ligadas.Em seguida, adicione dois mililitros de solução de tripsina-EDTA 0,25% e incube as células por cinco minutos para destacá-las do frasco. Adicione oito mililitros de DMEM para inativar a tripsina e, então, transfira a suspensão celular para tubos de centrífuga. Centrifugue a 1000 × g durante cinco minutos para sedimentar as células.Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de PBS. Adicione um mililitro de formaldeído 10% em PBS para fixar as células e, então, transfira 100 microlitros de cada amostra para poços separados de uma placa de fundo plano de 96 poços. Adicione 100 microlitros de ágar 1% fundido em água desionizada a cada poço e misture pipetando para cima e para baixo.Deixe o gel solidificar a quatro graus Celsius por 12 horas para obter um fantoma. Após a solidificação do gel, coloque o fantoma ao lado de um bloco sólido cúbico de 150 centímetros de agar a 2% em um ímã clínico horizontal de três T. Em seguida, fixe o fantoma e o bloco de agar no centro de uma bobina cerebral HD de oito canais para medir os tempos de relaxamento, utilizando fatias coronais de 0,5 milímetro de espessura tomadas na altura média da placa de 96 poços. Ensaios de espalhamento dinâmico de luz foram utilizados para determinar o diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas geradas. Estudos de estabilidade confirmaram a estabilidade a longo prazo das nanopartículas, que são utilizadas em experimentos com base aquosa e em meios celulares.A microscopia confocal a laser mostrou nanopartículas fluorescentes carregadas com anticorpos para EOT três encontrados especificamente na superfície de células EOL uma. Quando anticorpos para um NG dois são utilizados, eles se ligam especificamente à superfície de neuroesferas BSG. As nanopartículas biofuncionalizadas foram capazes de rotular com sucesso com fluorescência uma população de células-alvo conforme medido por citometria de fluxo.Além disso, as nanopartículas foram capazes de direcionar uma subpopulação específica de células em uma mistura, mesmo em baixas proporções de células-alvo em relação às células controle. Por fim, as nanopartículas biofuncionalizadas aumentaram o contraste na ressonância magnética das células direcionadas, células tratadas com nanopartículas carregadas com um nng. Dois anticorpos apresentaram hipersinal nas sequências ponderadas em T um em comparação com células tratadas com partículas controle.Em contraste, as duas nanopartículas A NNG conferiram hipointensidade nas sequências ponderadas em T2 em comparação com as partículas controle. Uma vez mestres. A síntese de nanopartículas de azul de prusia biofuncionalizadas pode ser concluída em dois dias, se realizada corretamente.De forma semelhante a este procedimento, as nanopartículas podem ser biofuncionalizadas com diferentes biopolímeros e ligantes de direcionamento para investigar novas doenças e novas condições. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar nanopartículas de azul da Prússia para aplicações de fluorescência e imagem, com o intuito de marcar populações de células. Não se esqueça de seguir rigorosamente as diretrizes de segurança e os procedimentos operacionais padrão para a realização dos estudos no magneto clínico de ressonância magnética.

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