Bioativa de Prussian Blue Nanopartículas para Multimodal Imagem Molecular Applications

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar nanopartículas biofuncionalizadas de azul da Prússia para uso de agentes de imagem molecular multimodais. Isso é feito sintetizando primeiro nanopartículas de azul da Prússia que contêm íons de gadolínio ou manganês, que aumentam o sinal de ressonância magnética. O segundo passo é anexar avadon fluorescente na superfície das nanopartículas, o que confere capacidade de imagem fluorescente.

Em seguida, as nanopartículas revestidas com avadon são biofuncionalizadas com a célula desejada visando anticorpos biotinilados. Uma etapa final é realizar uma verificação de controle de qualidade nas nanopartículas biofuncionalizadas, medindo seu tamanho, potencial zeta e estabilidade temporal. Em última análise, as nanopartículas biofuncionalizadas são utilizadas em aplicações de imagem molecular multimodal para visualizar uma população-alvo específica de células dentro de uma mistura usando imagens de fluorescência e ressonância magnética.

Os agentes de imagem comerciais atuais são tipicamente monomodo e oferecem resolução apenas no nível anatômico. As nanopartículas de azul da Prússia combinam dois modos de imagem complementares, ressonância magnética e fluorescência, e permitem imagens moleculares e níveis subcelulares. As aplicações de nanopartículas multimodais se estendem ao diagnóstico de câncer e doenças inflamatórias, além do monitoramento de suas respostas ao tratamento.

Isso ocorre porque as nanopartículas biofuncionalizadas podem atingir e se ligar a uma população de células dentro de uma região específica do corpo. Embora esse método possa fornecer informações sobre o diagnóstico de câncer e doenças inflamatórias e a resposta ao tratamento, ele também pode ser aplicado a outras condições patológicas que se beneficiarão da sensibilidade e especificidade da imagem molecular. Usando fluorescência e ressonância magnética, tivemos a ideia de produzir essas nanopartículas quando determinamos que o azul da Prússia e o agente aprovado pela FDA para consumo oral humano poderiam ser sintetizados de forma estável usando um esquema de síntese de uma parte e robustamente biofuncionalizados usando técnicas padrão de bioconjugado.

Para começar, prepare uma solução de 5 milhões de molares de hexa sano de potássio ferrato dois em cinco mililitros de água deionizada para fazer a solução A próxima solução de reparo B contendo 2,5 milimolares de ferro, três cloreto e 2,5 milimolares de manganês. Dois cloretos em 10 mililitros de água deionizada para síntese de nanopartículas de manganês azul da Prússia. Outras nanopartículas podem ser sintetizadas conforme indicado no protocolo de texto, transferir a solução B para um frasco de fundo redondo e agitar a solução a 1000 RPM à temperatura ambiente.

Usando uma bomba peristáltica, adicione a solução, A gota a gota no recipiente a uma taxa de 10 mililitros por hora. Após a adição da solução A, mexa a mistura a 1000 RPM por mais 30 minutos. Em seguida, transfira alíquotas de um mililitro da mistura para tubos de microcentrífuga e adicione 0,2 mililitros de cinco mili cloreto de sódio a cada tubo.

Centrifugar os tubos a 20 000 vezes G durante pelo menos 10 minutos e, em seguida, retirar cuidadosamente o supinato, deixando o sedimento de nanopartículas. Em seguida, adicione um mililitro de água deionizada a cada pellet. Use uma micro ponta para suspender as nanopartículas uniformemente em solução por sonicação.

Lave as nanopartículas pelo menos mais três vezes para remover os componentes da reação inicial da suspensão após a centrifugação final, suspenda novamente as nanopartículas em um mililitro de água deionizada após revestir as nanopartículas com denil fluorescente conforme descrito no protocolo de texto, remova os estoques de anticorpos biotinilados da geladeira. Aqui. Use o antígeno glial anti-neurônio dois e a eotaxina anti-humana três. Transferir o anticorpo biotinilado para um filtro de micro nylon 0,2 e centrifugar o tubo a 14 000 vezes G durante 10 minutos.

Em seguida, adicione menos ou igual a 0,05 miligrama do anticorpo por miligrama de nanopartículas revestidas com Aden e cubra os tubos com papel alumínio para protegê-los da luz. Incube os tubos com agitação suave por duas a quatro horas a quatro graus Celsius. Depois de anexar os anticorpos, adicione 10 microlitros de um miligrama por mililitro de amostra de nanopartículas a 990 microlitros de água deionizada em uma tampa de plástico descartável e misture em V.

Bem, então determine o tamanho médio das nanopartículas usando um sistema dinâmico de espalhamento de luz com um ângulo de medição de 173 graus. Comece preparando suspensões de 10 mililitros de células em PBS a uma concentração de aproximadamente 100.000 células por mililitro para tubos de culturas mistas contendo proporções variadas de cada linha celular devem ser preparados conforme descrito no protocolo de texto a dois mililitros de 5% BS, A para cada tubo para bloquear as células e minimizar a ligação não específica. Em seguida, adicione um mililitro de um miligrama por mililitro, biofuncionalize as nanopartículas a cada tubo e incube a mistura por uma hora.

Em seguida, enxágue as células livres de nanopartículas não ligadas, girando os tubos a 1000 vezes G por cinco minutos e dobrando novamente os pellets em um mililitro de PBS. Repita esse processo pelo menos mais duas vezes. Fixe as células usando 10% de formaldeído em PBS e, em seguida, adicione 10 microgramas por mililitro, sete aminoactina e micina D em PBS para corar as células, incube o tubo em gelo por 30 minutos e depois enxágue as células com PBS.

Em seguida, carregue a amostra no citômetro de fluxo e analise 10.000 células fechadas de cada amostra. Um procedimento semelhante para células de imagem ligadas a nanopartículas fluorescentes usando microscopia confocal a laser é descrito no protocolo de texto. Para começar, use as células em frascos T 75 até aproximadamente 80% de confluência e, em seguida, lave as células com cinco mililitros de PBS.

Adicione cinco mililitros de 1% BSA em PBS e bloqueie as células por uma hora. Em seguida, adicione cinco mililitros de nanopartículas revestidas com anticorpos de 0,5 miligramas por mililitro ao frasco e incube as células por uma hora para permitir que as nanopartículas se liguem. Em seguida, enxágue as células três vezes com cinco mililitros de PBS para remover as nanopartículas não ligadas.

Em seguida, adicione dois mililitros de solução de EDTA a 0,25% de tripsin e incube as células por cinco minutos para desprepará-las do frasco. Adicione oito mililitros de DMEM para extinguir a tentina e, em seguida, transfira a suspensão da célula para tubos de centrífuga. Gire-os a 1000 vezes G por cinco minutos para pellet as células.

Em seguida, aspire o supinado e ressuspenda as células em um mililitro de PBS. Adicione um mililitro de formaldeído a 10% em PBS para fixar as células e, em seguida, transfira 100 microlitros de cada amostra para poços separados de uma placa de fundo plano de 96 poços. Adicione 100 microlitros de 1% de aros fundido em água deionizada a cada poço e misture pipetando para cima e para baixo.

Deixe o gel solidificar a quatro graus Celsius por 12 horas para produzir um fantasma. Depois que o gel solidificar, coloque o simulador em um ímã clínico horizontal de três T próximo a um bloco cúbico sólido de 150 centímetros de ágar 2%. Em seguida, prenda o fantasma e o bloco de ágar no centro de uma bobina cerebral HD de oito canais para medir os tempos de relaxamento, use fatias coronais de 0,5 milímetros de espessura tomadas a meia altura dos ensaios de espalhamento de luz dinâmica de 96 placas de poços foram usados para determinar o diâmetro hidrodinâmico da estabilidade das nanopartículas geradas Estudos verificados a estabilidade a longo prazo das nanopartículas são usadas em experimentos baseados em água e mídia celular.

A microscopia confocal a laser mostrou nanopartículas fluorescentes carregadas com anticorpos para EOT três encontradas especificamente na superfície das células EOL um. Quando anticorpos para um NG dois são usados, eles se ligam especificamente à superfície das neuroesferas BSG. As nanopartículas biofuncionalizadas foram capazes de marcar com sucesso com fluorescência uma população de células-alvo, conforme medido por citometria de fluxo.

Além disso, as nanopartículas foram capazes de atingir uma subpopulação específica de células em uma mistura, mesmo em células-alvo baixas, para controlar as proporções celulares. Finalmente, as nanopartículas biofuncionalizadas aumentaram o contraste de ressonância magnética das células-alvo, células tratadas com nanopartículas carregadas com um nng. Dois anticorpos apresentaram hiperintensidade nas sequências ponderadas em T um em comparação com as células tratadas com partículas controle.

Em contraste, as duas nanopartículas A NNG conferiram hipointensidade nas duas sequências ponderadas T em comparação com as partículas controle. Uma vez mestres. A síntese de nanopartículas de azul de pressão biofuncionalizadas pode ser concluída em dois dias se for realizada corretamente.

Semelhante a este procedimento, as nanopartículas podem ser biofuncionalizadas com diferentes biopolímeros e ligante direcionado para investigar novas doenças e novas condições. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar nanopartículas de azul da Prússia para aplicações de fluorescência e imagem para rotular a população de células. Não se esqueça de seguir rigorosamente as diretrizes de segurança e os procedimentos operacionais padrão para a realização dos estudos no ímã de ressonância magnética clínica.