Bioativa de Prussian Blue Nanopartículas para Multimodal Imagem Molecular Applications

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar nanopartículas de azul da Prússia biofuncionalizadas para utilização como agentes de imagem molecular multimodal. Isso é realizado primeiramente pela síntese de nanopartículas de azul da Prússia que contêm íons de gadolínio ou manganês, os quais realçam o sinal de RNM. O segundo passo consiste em ligar o fluoróforo avadina à superfície das nanopartículas, conferindo-lhes capacidade de imagem por fluorescência.

Em seguida, as nanopartículas revestidas com avadon são biofuncionalizadas com os anticorpos biotinilados desejados para direcionamento celular. Um passo final consiste em realizar uma verificação de controle de qualidade das nanopartículas biofuncionalizadas, medindo seu tamanho, potencial zeta e estabilidade temporal. Em última instância, as nanopartículas biofuncionalizadas são utilizadas em aplicações de imagem molecular multimodal para visualizar uma população específica de células-alvo dentro de uma mistura, utilizando imagem por fluorescência e ressonância magnética.

Os agentes de imagemagem comerciais atuais são tipicamente unimodais e oferecem resolução apenas no nível anatômico. As nanopartículas de azul da Prússia combinam dois modos complementares de imagemagem — RNM e fluorescência — e permitem imagemagem molecular e em níveis subcelulares. As aplicações de nanopartículas multifuncionais estendem-se ao diagnóstico de câncer e doenças inflamatórias, além do monitoramento da resposta ao tratamento dessas condições.

Isso ocorre porque nanopartículas biofuncionalizadas podem direcionar-se e ligar-se a uma população de células dentro de uma região específica do corpo. Embora este método possa fornecer informações sobre o diagnóstico de câncer e doenças inflamatórias, bem como a resposta ao tratamento, ele também pode ser aplicado a outras condições patológicas que se beneficiem da sensibilidade e especificidade da imagem molecular. Utilizando fluorescência e ressonância magnética, tivemos inicialmente a ideia de produzir essas nanopartículas quando determinamos que o azul da Prússia, um agente aprovado pela FDA para consumo oral humano, poderia ser sintetizado de forma estável por meio de um esquema de síntese em uma única etapa e robustamente biofuncionalizado utilizando técnicas padrão de bioconjugação.

Para começar, prepare uma solução 5 milimolar de hexacianoferrato(II) de potássio em cinco mililitros de água deionizada para obter a solução A. Em seguida, prepare a solução B contendo cloreto de ferro(III) 2,5 milimolar e cloreto de manganês(II) 2,5 milimolar em 10 mililitros de água deionizada para a síntese de nanopartículas de azul da Prússia de manganês. Outras nanopartículas podem ser sintetizadas conforme indicado no protocolo do texto. Transfira a solução B para um balão de fundo redondo e agite a solução a 1000 rpm à temperatura ambiente.

Usando uma bomba peristáltica, adicione a solução A gota a gota ao recipiente a uma taxa de 10 mililitros por hora. Após a adição completa da solução A, agite a mistura a 1000 rpm por mais 30 minutos. Em seguida, transfira alíquotas de um mililitro da mistura para tubos de microcentrífuga e adicione 0,2 mililitros de cloreto de sódio cinco milimolar a cada tubo.

Centrifugue os tubos a 20.000 × g durante pelo menos 10 minutos e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando o pellet de nanopartículas. Em seguida, adicione um mililitro de água desionizada a cada pellet. Use uma ponteira micrométrica para suspender uniformemente as nanopartículas em solução por sonicação.

Lave as nanopartículas pelo menos mais três vezes para remover os componentes da reação inicial da suspensão após a última centrifugação, reconstitua as nanopartículas em um mililitro de água desionizada após revestir as nanopartículas com den fluorescente conforme descrito no protocolo do texto, retire os estoques de anticorpos biotinilados da geladeira. Aqui. Utilize antígeno glial neuronal dois e anti-eotaxina humana três. Transfira o anticorpo biotinilado para um filtro microfuga de náilon de 0,2 micrômetros e, em seguida, centrifugue o tubo a 14.000 × g por 10 minutos.

Em seguida, adicione menos de ou igual a 0,05 miligrama do anticorpo por miligrama de nanopartículas revestidas com Aden e cubra os tubos com papel alumínio para protegê-los da luz. Incube os tubos sob agitação suave por duas a quatro horas a quatro graus Celsius. Após a ligação dos anticorpos, adicione 10 microlitros de uma amostra de nanopartículas de um miligrama por mililitro a 990 microlitros de água desionizada em um vete plástico descartável, tampe o vete e vorteie para homogeneizar.

Em seguida, determine o tamanho médio das nanopartículas utilizando um sistema de espalhamento dinâmico de luz com um ângulo de medição de 173 graus. Comece preparando suspensões de 10 mililitros de células em PBS numa concentração de aproximadamente 100.000 células por mililitro; para culturas mistas, tubos contendo diferentes proporções de cada linhagem celular devem ser preparados conforme descrito no protocolo textual. Adicione dois mililitros de BSA a 5% a cada tubo para bloquear as células e minimizar a ligação não específica. Em seguida, adicione um mililitro de nanopartículas biofuncionalizadas a um miligrama por mililitro a cada tubo e incube a mistura por uma hora.

Em seguida, remova as nanopartículas não ligadas lavando as células por meio da centrifugação dos tubos a 1000 × g durante cinco minutos e ressuspendendo os pellets em um mililitro de PBS. Repita este processo pelo menos mais duas vezes. Fixe as células utilizando formaldeído a 10% em PBS e, em seguida, adicione 10 microgramas por mililitro de sete amino actinomicina D em PBS para corar as células, incube o tubo em gelo por 30 minutos e, depois, lave as células com PBS.

Em seguida, carregue a amostra no citômetro de fluxo e analise 10.000 células dentro do gate de cada amostra. Um procedimento semelhante para imagens de células ligadas a nanopartículas fluorescentes utilizando microscopia confocal a laser é descrito no protocolo textual. Para começar, cultive as células em frascos T75 até aproximadamente 80% de confluência e, em seguida, lave as células para remover o meio com cinco mililitros de PBS.

Adicione cinco mililitros de BSA 1% em PBS e bloquee as células por uma hora. Em seguida, adicione cinco mililitros de nanopartículas recobertas com anticorpo a 0,5 miligramas por mililitro ao frasco e incube as células por uma hora para permitir a ligação das nanopartículas. A seguir, lave as células três vezes com cinco mililitros de PBS para remover as nanopartículas não ligadas.

Em seguida, adicione dois mililitros de solução de tripsina-EDTA 0,25% e incube as células por cinco minutos para destacá-las do frasco. Adicione oito mililitros de DMEM para inativar a tripsina e, então, transfira a suspensão celular para tubos de centrífuga. Centrifugue a 1000 × g durante cinco minutos para sedimentar as células.

Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de PBS. Adicione um mililitro de formaldeído 10% em PBS para fixar as células e, então, transfira 100 microlitros de cada amostra para poços separados de uma placa de fundo plano de 96 poços. Adicione 100 microlitros de ágar 1% fundido em água desionizada a cada poço e misture pipetando para cima e para baixo.

Deixe o gel solidificar a quatro graus Celsius por 12 horas para obter um fantoma. Após a solidificação do gel, coloque o fantoma ao lado de um bloco sólido cúbico de 150 centímetros de agar a 2% em um ímã clínico horizontal de três T. Em seguida, fixe o fantoma e o bloco de agar no centro de uma bobina cerebral HD de oito canais para medir os tempos de relaxamento, utilizando fatias coronais de 0,5 milímetro de espessura tomadas na altura média da placa de 96 poços. Ensaios de espalhamento dinâmico de luz foram utilizados para determinar o diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas geradas. Estudos de estabilidade confirmaram a estabilidade a longo prazo das nanopartículas, que são utilizadas em experimentos com base aquosa e em meios celulares.

A microscopia confocal a laser mostrou nanopartículas fluorescentes carregadas com anticorpos para EOT três encontrados especificamente na superfície de células EOL uma. Quando anticorpos para um NG dois são utilizados, eles se ligam especificamente à superfície de neuroesferas BSG. As nanopartículas biofuncionalizadas foram capazes de rotular com sucesso com fluorescência uma população de células-alvo conforme medido por citometria de fluxo.

Além disso, as nanopartículas foram capazes de direcionar uma subpopulação específica de células em uma mistura, mesmo em baixas proporções de células-alvo em relação às células controle. Por fim, as nanopartículas biofuncionalizadas aumentaram o contraste na ressonância magnética das células direcionadas, células tratadas com nanopartículas carregadas com um nng. Dois anticorpos apresentaram hipersinal nas sequências ponderadas em T um em comparação com células tratadas com partículas controle.

Em contraste, as duas nanopartículas A NNG conferiram hipointensidade nas sequências ponderadas em T2 em comparação com as partículas controle. Uma vez mestres. A síntese de nanopartículas de azul de prusia biofuncionalizadas pode ser concluída em dois dias, se realizada corretamente.

De forma semelhante a este procedimento, as nanopartículas podem ser biofuncionalizadas com diferentes biopolímeros e ligantes de direcionamento para investigar novas doenças e novas condições. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar nanopartículas de azul da Prússia para aplicações de fluorescência e imagem, com o intuito de marcar populações de células. Não se esqueça de seguir rigorosamente as diretrizes de segurança e os procedimentos operacionais padrão para a realização dos estudos no magneto clínico de ressonância magnética.