Name: Strand DNA Deslocamento Portas para redes de reação de Execução químicos derivados do plasmídeo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprenda a derivar portas de deslocamento de fita de DNA a partir de plasmídeos bacterianos e testá-las por cinética de fluorescência. Este método avança a programação molecular e a biologia sintética.

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As Figuras 1, 2, 3, 4, 6, 8 e quadros 2, 3, 10, 15, 16 são modificados a partir de 29 Ref. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (NSF conceder-CCF 1117143 e NSF-CCF 1.162.141 para GS). Y.-JC foi apoiado por bolsas de estudo governamentais de Taiwan. SDR foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciência Programa de Pós-Graduação Research Fellowship (GRFP).

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<li>Krishnan, Y., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+based+molecular+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid based molecular devices.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50, 3124-3156 (2011).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+strand+displacement+kinetics+using+toehold+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Control of DNA strand displacement kinetics using toehold exchange.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 17303-17314 (2009).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475, 368-372 (2011).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+digital+circuit+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scaling up digital circuit computation with DNA strand displacement cascades.</a> Science. 332, 1196-1201 (2011).</li>
<li>Zadegan, R. M., Jepsen, M. D., Hildebrandt, L. L., Birkedal, V., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+fuzzy+and+boolean+logic+gates+based+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Construction of a fuzzy and boolean logic gates based on DNA.</a> Small. 11, 1811-1817 (2015).</li>
<li>Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+nucleic+acid+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free nucleic acid logic circuits.</a> Science. 314, 1585-1588 (2006).</li>
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<li>Zhang, D. Y., Hariadi, R. F., Choi, H. M., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+DNA+strand-displacement+circuitry+with+DNA+tile+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Integrating DNA strand-displacement circuitry with DNA tile self-assembly.</a> Nat. Commun. 4, (1965).</li>
<li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406, 605-608 (2000).</li>
<li>Green, S. J., Lubrich, D., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+hairpins%3A+fuel+for+autonomous+DNA+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">DNA hairpins: fuel for autonomous DNA devices.</a> Biophys. J. 91, 2966-2975 (2006).</li>
<li>Venkataraman, S., Dirks, R. M., Rothemund, P. W., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autonomous+polymerization+motor+powered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">An autonomous polymerization motor powered by DNA hybridization.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 490-494 (2007).</li>
<li>Green, S. J., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+chemomechanical+cycles%3A+a+mechanism+for+autonomous+molecular+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Coordinated chemomechanical cycles: a mechanism for autonomous molecular motion.</a> Phys. Rev. Lett. 101, 238101(2008).</li>
<li>Omabegho, T., Sha, R., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bipedal+DNA+Brownian+motor+with+coordinated+legs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bipedal DNA Brownian motor with coordinated legs.</a> Science. 324, 67-71 (2009).</li>
<li>Turberfield, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fuel+for+free-running+nanomachines%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA fuel for free-running nanomachines.</a> Phys. Rev. Lett. 90, 118102(2003).</li>
<li>Dirks, R. M., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+amplification+by+hybridization+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Triggered amplification by hybridization chain reaction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 15275-15278 (2004).</li>
<li>Seelig, G., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalyzed+relaxation+of+a+metastable+DNA+fuel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalyzed relaxation of a metastable DNA fuel.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 12211-12220 (2006).</li>
<li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318, 1121-1125 (2007).</li>
<li>Yin, P., Choi, H. M., Calvert, C. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+biomolecular+self-assembly+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming biomolecular self-assembly pathways.</a> Nature. 451, 318-322 (2008).</li>
<li>Chen, X., Briggs, N., McLain, J. R., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stacking+nonenzymatic+circuits+for+high+signal+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Stacking nonenzymatic circuits for high signal gain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 5386-5391 (2013).</li>
<li>Phillips, A., Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programming+language+for+composable+DNA+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">A programming language for composable DNA circuits.</a> J. R. Soc. Interface. 6, Suppl 4. S419-S436 (2009).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Polo, F., Emmott, S., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+DSD%3A+a+design+and+analysis+tool+for+DNA+strand+displacement+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Visual DSD: a design and analysis tool for DNA strand displacement systems.</a> Bioinformatics. 27, 3211-3213 (2011).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Cardelli, L., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abstractions+for+DNA+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Abstractions for DNA circuit design.</a> J. R. Soc. Interface. 9, 470-486 (2012).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+and+modularity+properties+of+a+non-covalent+DNA+catalytic+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Robustness and modularity properties of a non-covalent DNA catalytic reaction.</a> Nucleic Acids Res. 38, 4182-4197 (2010).</li>
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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Este artigo descreve um método para derivar portões ndsDNA a partir de DNA de plasmídeo muito puro. Além disso, um protocolo é apresentada para caracterizar o desempenho portão utilizando um ensaio de cinética de fluorescência. Os dados experimentais mostram que o sistema de plasmídeo derivado de supera sua contraparte sintética, mesmo se o sistema sintético é montado a partir de fios purificado utilizando electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Provavelmente, o melhor desempenho de portas derivado do plasmídeo é principalmente devido à muito alta pureza do DNA biológico. ADN sintético contém uma variedade de erros, em particular, deleções que resultam em oligonucleótidos de tais produtos secundários comprimento n-1, e são tipicamente não completamente removido em PAGE ou cromatograf ia líquida de alta eficiência (HPLC) procedimentos de purificação. Também foram observadas melhorias semelhantes aos aqui relatados em um estudo prévio de um amplificador hairpin catalisada que usou DNA derivado de fontes biológicas 21. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; No entanto, mesmo o uso de portas derivado do plasmídeo não pode eliminar completamente os erros no desempenho portão, para as quais existem pelo menos duas razões: em primeiro lugar sobre-digestão ou falta de precisão de corte pode levar a portões com demasiados nicks ou cortes nas posições erradas. Em qualquer caso, as portas são mais susceptíveis de participar em reacções indesejadas. Tais problemas podem ser facilitado através da optimização da quantidade de enzima utilizada (ver Figura 4). Em segundo lugar, nestas experiências, a maioria das entradas e cordões eram auxiliares de ADN sintético e continha assim as supressões e mutações. Em princípio, todas as entradas de cadeia simples e fios auxiliares também poderia ser obtido a partir de ADN de fagemideo por meio de uma digestão com enzimas de nicking do genoma viral M13 pré-codificada 26. Talvez o desempenho do circuito pode ser melhorado utilizando ADNcs derivados do genoma bacteriano. Enquanto o uso de portões derivado de plasmídeo foi encontrada para melhorar o desempenho do circuito, uma análisedos tempos de processamento e custos revelou que, enquanto a produção de portas derivado de plasmídeo é ligeiramente mais barato (Tabela 15), leva-se 2-3 vezes mais em comparação com o tempo de processamento e a purificação da montagem de portas de oligos sintetizados comercialmente (Tabela 16). Os custos primários de portões são derivados do plasmídeo síntese de genes e a utilização de enzimas de restrição. Para 300 pmol de portas (suficiente para 15 reacções em 30 nM), o custo estimado para Junte-se portas é de aproximadamente US $ 170 e US $ 200 para Fork portões, a diferença de custo ser devido ao uso de diferentes enzimas nicking. Em contraste, a síntese química dos fios para os mesmos custos de porta em torno $ 260, incluindo uma taxa de purificação PAGE. O custo do tempo primário para portas derivado do plasmídeo é no procedimento de clonagem, que, assim como a síntese de DNA, pode ser terceirizado para uma empresa de síntese de genes. No entanto, uma vez montado, portas derivado do plasmídeo tem a vantagem de que os plasmídeos hospedeiros podem ser facilmente replicadas de umaND pode ser armazenado na forma de estoques de glicerol bacterianas. Isto faz com que seja possível voltar a utilizar os portões muitas vezes. Olhando para a frente, o melhor desempenho de portas derivado do plasmídeo poderia permitir uma gama muito maior de dinâmica de comportamentos que têm sido experimentalmente demonstrado até agora com DNA CRNs. Por exemplo, recente trabalho teórico 47,48 sugeriu que padrões espaciais auto-organizadas na macro-escala podem ser realizados com DNA CRNs através de um mecanismo de difusão reação. O método aqui apresentado fornece um caminho viável para a construção de componentes moleculares subjacentes a tais materiais de DNA auto-padronização. Apesar de desafiador, desenvolvendo morfologias macro-escala de uma forma programável teria implicações significativas em áreas que vão desde pesquisas em biomateriais para a medicina regenerativa.

A previsibilidade de bases de Watson-Crick tem permitido nanotecnologia de DNA dinâmico a emergir como uma forma programável para projetar dispositivos moleculares com propriedades dinâmicas 1,2. Em particular, o deslocamento cadeia de DNA -, uma reação de hibridização competitiva programável - provou ser um poderoso mecanismo de engenharia de sistemas dinâmicos de DNA. Em uma reação de deslocamento de cadeia de DNA, um oligonucleï¿½ido de entrada desloca um &quot;output&quot; vertente anteriormente vinculado a partir de um parceiro de ligação complementar. Várias tais reações podem ser encadeados em cascatas de reação de várias etapas com um alto grau de controle sobre a ordem eo tempo de reação individual etapas 3. DNA cascatas de deslocamento de cadeia foram usadas para criar circuitos digitais e analógicos moleculares 4-7, nanoestruturas comutáveis ​​8-10, motores moleculares autónomas 11-15, e amplificadores catalíticos não covalentes 13,16-21. Além disso, DNA dispositivos que utilizam reações de deslocamento de cadeia pode ser simulado e projetado para diversas aplicações utilizando software 22-24 desenho assistido por computador. Atualmente, o DNA sintetizado quimicamente serve como o principal material para a nanotecnologia de DNA. No entanto, os erros no processo de síntese de DNA, e os oligonucleótidos imperfeitos resultantes, são acreditados para limitar o desempenho de dispositivos de ADN dinâmicas, fazendo com que as reacções laterais erradas. Por exemplo, as reacções de &quot;vazamento&quot; pode resultar na libertação de um oligonucleótido de saída, mesmo na ausência de uma reacção de disparo. Tais efeitos são mais óbvias nas cascatas de reacção autocatalítica onde mesmo uma quantidade mínima de vazamento inicial irá eventualmente resultar na activação completa da cascata 19,20. Por outro lado, as reacções muitas vezes não conseguem alcançar o nível esperado de activação porque alguns componentes não provocam, mesmo na presença de 7,25 a entrada pretendida. Para fazer com que o desempenho de DNA com base emnanodispositivos comparáveis ​​com os seus homólogos à base de proteínas biológicas, tais modos de erro precisa ser reduzido drasticamente. Plasmídeos bacterianos ou outro ADN biológica pode servir como uma fonte de ADN altamente puro relativamente barato para aplicações de nanotecnologia. Grandes quantidades de ADN pode ser gerado por replicação em bactérias e as capacidades inerentes de revisão dos sistemas vivos garantir a pureza do ADN resultante. De fato, vários trabalhos recentes têm reconhecido a utilidade potencial de DNA biológico para aplicações de nanotecnologia 21,26-28. No entanto, a natureza totalmente de cadeia dupla de DNA de plasmídeo foi medida proibida a sua utilização como um material para a fabricação de dispositivos de ADN dinâmicas, que consistem tipicamente de vários oligonucleótidos e contêm ambos os domínios de cadeia dupla e de cadeia simples. Em um recente artigo 29 esta questão foi abordada e uma nova arquitetura portão DNA que consiste principalmente de DNA de cadeia dupla entalhado (ndsDNA) foi introduzird. É importante ressaltar que os sistemas de portões ndsDNA pode ser concebido que perceber a dinâmica especificados por qualquer rede de reação química formais (CRN) 29. portões ndsDNA poderia, assim, ser utilizados, em princípio, para criar sistemas dinâmicos que apresentam oscilações e caos, biestabilidade e memória, lógica booleana ou comportamentos algorítmicos 30-38. Por exemplo, Ref. 29 demonstraram uma CRN três reacção que fornecida uma implementação molecular de um protocolo de &quot;consenso&quot;, um tipo de algoritmo de computação distribuída 29,39,40. Este trabalho demonstrou pela primeira vez uma nova utilização para o formalismo CRN como uma &quot;linguagem de programação&quot; para sintetizar rapidamente sistemas moleculares funcionais (Figura 1A). Aqui, um protocolo detalhado para derivar portões ndsDNA de ADN de plasmídeo é fornecida. Primeiro é uma revisão do processo de concepção sequência. Depois segue-se uma explicação de como oligonucleótidos sintéticos que contêmas sequências de porta são clonados em plasmídeos e sequência verificada e amplificado através de cultura bacteriana. Em seguida, é mostrado como ndsDNA portas podem ser derivados a partir dos plasmídeos por tratamento enzimático (ver Figura 2). Por fim, um método para testar o comportamento portão usando a cinética de fluorescência os ensaios é descrita. Mecanismo de reacção Como um exemplo, o protocolo centra-se na reacção química catalítica de A + B&gt; B + C. As espécies de A, B, e C (&quot;sinais&quot;, Figura 1B) correspondem todas a uma molécula diferente de cadeia simples de ADN. As sequências destas moléculas são completamente independentes e os fios não reagem um com o outro directamente. As sequências de todos os sinais têm dois domínios funcionais diferentes, ou seja, subsequências que agem em conjunto em reacções de deslocamento de cadeia: 1) um ponto de apoio de domínio curto (etiquetas TA, TB, TC) que é usado para a iniciação da cadeia deslocamento reaction, e 2) um domínio longo (etiquetas a, b, c) que determina a identidade do sinal. Interações entre fios de sinal são mediados por ADN (ndsDNA) Complexos de porta de cadeia dupla com entalhe (chamados Adira AB e Fork BC) e as espécies de cadeia simples auxiliares (&lt;tr r&gt;, &lt;b tr&gt;, &lt;c tb&gt; e &lt;i tc &gt;). A reacção de formal de A + B&gt; B + C é executada através de uma série de passos de reacção de deslocamento de cadeia, em que cada passo reaccional expõe um ponto de apoio para uma reacção subsequente (Figura 1B). Neste exemplo, os sinais A e B são inicialmente livre em solução enquanto o sinal de C está ligado ao portão forquilha. No final da reacção, B e C estão em solução. De modo mais geral, os sinais que estão vinculados a um portão estão inativos, enquanto os sinais que são livres em solução são ativos, isto é, eles podem participar de uma reação de deslocamento de cadeia comouma entrada. O curso do tempo da reacção é seguido usando uma estratégia repórter fluorescente (Figura 1C). Em trabalho anterior 29, demonstrou-se que este mecanismo de reacção, não só realiza a estequiometria correcta, mas também a cinética da reacção alvo.

<table><tbody><tr><td>Phusion PCR Master Mix de alta fidelidade com tampão HF</td><td>NEB</td><td>M0531S</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>PstI-HF</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Caldo fantástico, modificado</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0918-250G</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Hispeed Maxi-prep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>Nb.BsrDI</td><td>NEB</td><td>R0648L</td><td></td></tr><tr><td>Nt.BstNBI</td><td>NEB</td><td>R0607L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocos Genômicos de Fita Dupla</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorímetro Fluorímetro-3</td>Células de Quartzo Sintéticas <td>Horiba/Jobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Starna</td><td>23-5.45-S0G-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Kit de Extração de Gel</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Backbones</td><td>BioBrick</td><td>E0240-pSB1A2</td><td>Plasmídeo de alto número de cópias com resistência à ampicilina. A sequência pode ser encontrada em http://parts.igem.org</td></tr></tbody></table>

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Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

A nanotecnologia de DNA requer grandes quantidades de DNA altamente puro como material de engenharia. O DNA do plasmídeo pode atender a essa necessidade, pois é replicado com alta fidelidade, é prontamente amplificado por meio de cultura bacteriana e pode ser armazenado indefinidamente na forma de estoques de glicerol bacteriano. No entanto, a natureza de fita dupla do DNA do plasmídeo até agora impediu seu uso eficiente para a construção de nanoestruturas de DNA ou dispositivos que normalmente contêm domínios de fita simples ou ramificados. Em trabalhos recentes, descobriu-se que as portas de deslocamento da fita de DNA de fita dupla cortada (ndsDNA) podem ser originadas do DNA do plasmídeo. O seguinte é um protocolo que detalha como essas portas ndsDNA podem ser codificadas de forma eficiente em plasmídeos e podem ser derivadas dos plasmídeos por meio de um pequeno número de etapas de processamento enzimático. Também é fornecido um protocolo para testar portas ndsDNA usando medições de cinética de fluorescência. As portas NdsDNA podem ser usadas para implementar redes de reação química arbitrárias (CRNs) e, assim, fornecer um caminho para o uso do formalismo CRN como uma linguagem de programação molecular prescritiva. Para demonstrar essa tecnologia, uma cascata de reação de várias etapas com cinética catalítica é construída. Além disso, é mostrado que os componentes derivados do plasmídeo têm um desempenho melhor do que os componentes idênticos montados a partir do DNA sintético.

Este protocolo descreve um método para derivar portas de deslocamento de fita de DNA de plasmídeos e testá-las usando medições de cinética de fluorescência. As portas podem ser compostas modularmente em sistemas multicomponentes para aproximar o comportamento de redes formais de reação química (CRN), demonstrando um novo uso para CRNs como linguagem de programação molecular.

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DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

O objetivo geral deste procedimento é derivar portas de deslocamento de fita de DNA de plasmídeos bacterianos. A principal vantagem dessa técnica é que ela utiliza o plasmídeo bacteriano como uma fonte altamente pura para gerar portas de DNA robustas. Demonstrando este procedimento estarão meus colegas Sam Dip e eu Para começar a produzir em massa e, em seguida, isolar contendo portas de DNA usando kits de isolamento de DNA, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha e de acordo com as instruções do fabricante seguindo ellucian.Medir a concentração de DNA plasmidial usando técnicas padrão. Em seguida, digerir o ADN adicionando quatro unidades da enzima de restrição PV U2 HF por cada miligrama do plasmídeo. Em seguida, adicione dois volumes equivalentes de etanol absoluto gelado à amostra.Incube a mistura a 80 graus Celsius negativos por pelo menos uma hora para precipitar o DNA. Em seguida, pulverize o DNA precipitado centrifugando a amostra a 10.000 a 14.000 vezes G e zero graus Celsius por 30 minutos. Remova o SNAT e adicione 1000 microlitros de etanol a 95% em temperatura ambiente à amostra.Em seguida, inverta a amostra 10 a 15 vezes em seguida, centrifugue a amostra a 10.000 a 14.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos. Quando terminar, remova o sobrenadante e seque o DNA ao ar em uma bancada por 10 a 20 minutos. Ao remover o sobrenadante do DNA precipitado, tome cuidado para não perturbar o pellet ou o rendimento diminuirá significativamente.Uma vez seco, ressuspenda o pellet de DNA em até 200 microlitros de água livre de nuclease e vórtice para misturar. Adicionar mais de 200 microlitros de água geralmente fará com que a amostra se dilua para uso. Em experimentos de cinética, medir o DNA ressuspenso usando um espectrofotômetro seguindo as instruções do fabricante.Em seguida, adicione quatro unidades da enzima de corte M-B-B-S-R-D uma por um micrograma de plasmídeo e adicione o tampão enzimático correspondente. Incubar a amostra a 65 graus Celsius por uma hora para digerir as comportas conjuntas. Em seguida, digerir as comportas adicionando oito unidades da enzima de corte NT BST mb uma por um micrograma de plasmídeo e o tampão enzimático correspondente.Incubar a amostra a 55 graus Celsius durante uma hora. Para preparar os repórteres fluorescentes primeiro Resus, suspenda e quantifique as amostras conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, misture 10 microlitros da fita inferior dos repórteres com 13 microlitros da fita superior em tampão EDTA de acetato de tris com 12,5 milimolares de magnésio.Para garantir que toda a flora, quatro fios rotulados sejam extintos, um excesso de 30% do fio rotulado com têmpera deve ser adicionado. Em seguida, anil o complexo repórter C usando um termociclador. Resfrie a amostra de 95 graus Celsius a 20 graus Celsius a uma taxa de um grau Celsius por minuto.Quando terminar, armazenou a amostra a quatro graus Celsius após a calibração. Comece as medições de fluorescência ajustando primeiro o controlador de temperatura para 25 graus Celsius enquanto a temperatura se estabiliza. Configure os parâmetros adequados para medições cinéticas no software de aquisição de dados.Depois de abrir o software para o fluorímetro espectral, defina a largura de deslizamento para 2,73 nanômetros para a excitação e a emissão monocromática. Em seguida, defina o tempo de integração para 10 segundos para cada 62º ponto de tempo e defina o tempo total de medição para 24 horas. Por fim, defina os comprimentos de onda de excitação e emissão para corresponder à floresta de flora usada no experimento.Em seguida, adicione 410,2 microlitros de água livre de nuclease e 52,8 microlitros de 10 tampão EDTA de acetato extra contendo 125 milimolares de magnésio a uma célula de quartzo sintético. Adicione também dois microlitros de fios T poli de 300 milimolares e, em seguida, vortex a célula de quartzo sintético por 10 a 15 segundos. Em seguida, com nove microlitros das fitas repórter a 10 micromolares e seis microlitros de cada fita auxiliar a 10 micromolares.Em seguida, a 45 microlitros das comportas da junta e do garfo em um micromolar e misture suavemente a solução pipetando-a para cima e para baixo pelo menos 20 vezes. Finalmente, a nove microlitros de 10% de sódio, faça sulfato ductal para atingir uma concentração final de 0,15% SDS, misture suavemente a reação pipetando para cima e para baixo pelo menos 20 vezes, coloque imediatamente as células sintéticas de um litro na câmara do fluter de espectro e inicie a medição cinética. Após cinco minutos de medição, adicione três microlitros dos fios de entrada.Adicione 10 micromolares à célula sintética de um litro. Enquanto o programa de aquisição de dados estiver pausado, misture suavemente a reação pipetando-a para cima e para baixo pelo menos 20 vezes e, em seguida, feche a tampa de luz e continue a registrar a cinética da reação até que ela fique estável. Os dados de cinética de estado para as portas derivadas do plasma e as portas sintetizadas são mostrados aqui nos experimentos.A concentração da fita de sinal A é fixa, enquanto a quantidade do sinal catalítico B é variada. O sinal C é usado para ler o progresso da reação sem interromper. A rotatividade do ciclo catalítico é definida como a quantidade de sinal C produzida para cada catalisador B em um determinado momento.Para um sistema catalítico ideal, esse número de rotatividade deve aumentar linearmente com o tempo e ser independente da quantidade de catalisador, desde que o substrato não seja limitante. Aqui observa-se que o sistema sintetizado se desvia do aumento linear ideal do turnover muito mais cedo do que o sistema derivado do plasma, indicando sequestro do catalisador por meio de uma reação colateral indesejável. O vazamento do circuito das portas derivadas do plasma e das sintetizadas é comparado aqui, e observa-se que a proporção do sinal de vazamento usando portas derivadas do plasma é cerca de 8% menor do que a que usa portas sintetizadas após 10 horas de reação.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar portas de DNA robustas a partir de plasmídeo bacteriano e testar as portas usando medições de cinética de fluorescência.

plasmid-derived-dna-strand-displacement-gates-for-implementing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Origami de DNA é um método poderoso para a fabricação de objetos em nanoescala precisos, programando a auto-montagem de moléculas de DNA. Aqui, nós descrevemos como DNA origami pode ser utilizado para criar um robô robótica capaz de sentir sinais biológicos e responder pela forma de deslocamento, posteriormente retransmitida para o efeito desejado.

Projetando um robô Bio-responsivo de DNA Origami

A síntese de plasmídeos personalizados é trabalhosa e demorada. Este protocolo descreve o uso da clonagem de montagem Gibson para reduzir o trabalho e a duração do procedimento de clonagem de DNA personalizado. O protocolo descrito também produz construções de proteínas marcadas confiáveis para a expressão de mamíferos a um custo semelhante à clonagem tradicional de DNA de cortar e colar.

Geração de plasmídeo vectores que expressam proteínas marcadas-bandeira nos termos do regulamento de Alongamento Human Fator-1α Promotor Usando Assembleia Gibson

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Uso de montagem in vivo para construção de plasmídeo de alta eficiência

Aprenda a derivar portas de deslocamento de fita de DNA a partir de plasmídeos bacterianos e testá-las por cinética de fluorescência. Este método avança a programação molecular e a biologia sintética.

Strand DNA Deslocamento Portas para redes de reação de Execução químicos derivados do plasmídeo

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