Strand DNA Deslocamento Portas para redes de reação de Execução químicos derivados do plasmídeo

O objetivo geral deste procedimento é derivar portas de deslocamento de fita de DNA de plasmídeos bacterianos. A principal vantagem dessa técnica é que ela utiliza o plasmídeo bacteriano como uma fonte altamente pura para gerar portas de DNA robustas. Demonstrando este procedimento estarão meus colegas Sam Dip e eu Para começar a produzir em massa e, em seguida, isolar contendo portas de DNA usando kits de isolamento de DNA, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha e de acordo com as instruções do fabricante seguindo ellucian.

Medir a concentração de DNA plasmidial usando técnicas padrão. Em seguida, digerir o ADN adicionando quatro unidades da enzima de restrição PV U2 HF por cada miligrama do plasmídeo. Em seguida, adicione dois volumes equivalentes de etanol absoluto gelado à amostra.

Incube a mistura a 80 graus Celsius negativos por pelo menos uma hora para precipitar o DNA. Em seguida, pulverize o DNA precipitado centrifugando a amostra a 10.000 a 14.000 vezes G e zero graus Celsius por 30 minutos. Remova o SNAT e adicione 1000 microlitros de etanol a 95% em temperatura ambiente à amostra.

Em seguida, inverta a amostra 10 a 15 vezes em seguida, centrifugue a amostra a 10.000 a 14.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos. Quando terminar, remova o sobrenadante e seque o DNA ao ar em uma bancada por 10 a 20 minutos. Ao remover o sobrenadante do DNA precipitado, tome cuidado para não perturbar o pellet ou o rendimento diminuirá significativamente.

Uma vez seco, ressuspenda o pellet de DNA em até 200 microlitros de água livre de nuclease e vórtice para misturar. Adicionar mais de 200 microlitros de água geralmente fará com que a amostra se dilua para uso. Em experimentos de cinética, medir o DNA ressuspenso usando um espectrofotômetro seguindo as instruções do fabricante.

Em seguida, adicione quatro unidades da enzima de corte M-B-B-S-R-D uma por um micrograma de plasmídeo e adicione o tampão enzimático correspondente. Incubar a amostra a 65 graus Celsius por uma hora para digerir as comportas conjuntas. Em seguida, digerir as comportas adicionando oito unidades da enzima de corte NT BST mb uma por um micrograma de plasmídeo e o tampão enzimático correspondente.

Incubar a amostra a 55 graus Celsius durante uma hora. Para preparar os repórteres fluorescentes primeiro Resus, suspenda e quantifique as amostras conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, misture 10 microlitros da fita inferior dos repórteres com 13 microlitros da fita superior em tampão EDTA de acetato de tris com 12,5 milimolares de magnésio.

Para garantir que toda a flora, quatro fios rotulados sejam extintos, um excesso de 30% do fio rotulado com têmpera deve ser adicionado. Em seguida, anil o complexo repórter C usando um termociclador. Resfrie a amostra de 95 graus Celsius a 20 graus Celsius a uma taxa de um grau Celsius por minuto.

Quando terminar, armazenou a amostra a quatro graus Celsius após a calibração. Comece as medições de fluorescência ajustando primeiro o controlador de temperatura para 25 graus Celsius enquanto a temperatura se estabiliza. Configure os parâmetros adequados para medições cinéticas no software de aquisição de dados.

Depois de abrir o software para o fluorímetro espectral, defina a largura de deslizamento para 2,73 nanômetros para a excitação e a emissão monocromática. Em seguida, defina o tempo de integração para 10 segundos para cada 62º ponto de tempo e defina o tempo total de medição para 24 horas. Por fim, defina os comprimentos de onda de excitação e emissão para corresponder à floresta de flora usada no experimento.

Em seguida, adicione 410,2 microlitros de água livre de nuclease e 52,8 microlitros de 10 tampão EDTA de acetato extra contendo 125 milimolares de magnésio a uma célula de quartzo sintético. Adicione também dois microlitros de fios T poli de 300 milimolares e, em seguida, vortex a célula de quartzo sintético por 10 a 15 segundos. Em seguida, com nove microlitros das fitas repórter a 10 micromolares e seis microlitros de cada fita auxiliar a 10 micromolares.

Em seguida, a 45 microlitros das comportas da junta e do garfo em um micromolar e misture suavemente a solução pipetando-a para cima e para baixo pelo menos 20 vezes. Finalmente, a nove microlitros de 10% de sódio, faça sulfato ductal para atingir uma concentração final de 0,15% SDS, misture suavemente a reação pipetando para cima e para baixo pelo menos 20 vezes, coloque imediatamente as células sintéticas de um litro na câmara do fluter de espectro e inicie a medição cinética. Após cinco minutos de medição, adicione três microlitros dos fios de entrada.

Adicione 10 micromolares à célula sintética de um litro. Enquanto o programa de aquisição de dados estiver pausado, misture suavemente a reação pipetando-a para cima e para baixo pelo menos 20 vezes e, em seguida, feche a tampa de luz e continue a registrar a cinética da reação até que ela fique estável. Os dados de cinética de estado para as portas derivadas do plasma e as portas sintetizadas são mostrados aqui nos experimentos.

A concentração da fita de sinal A é fixa, enquanto a quantidade do sinal catalítico B é variada. O sinal C é usado para ler o progresso da reação sem interromper. A rotatividade do ciclo catalítico é definida como a quantidade de sinal C produzida para cada catalisador B em um determinado momento.

Para um sistema catalítico ideal, esse número de rotatividade deve aumentar linearmente com o tempo e ser independente da quantidade de catalisador, desde que o substrato não seja limitante. Aqui observa-se que o sistema sintetizado se desvia do aumento linear ideal do turnover muito mais cedo do que o sistema derivado do plasma, indicando sequestro do catalisador por meio de uma reação colateral indesejável. O vazamento do circuito das portas derivadas do plasma e das sintetizadas é comparado aqui, e observa-se que a proporção do sinal de vazamento usando portas derivadas do plasma é cerca de 8% menor do que a que usa portas sintetizadas após 10 horas de reação.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar portas de DNA robustas a partir de plasmídeo bacteriano e testar as portas usando medições de cinética de fluorescência.