Circunscrito capsular infarto Modelagem usando uma técnica Photothrombotic
2 de junho de 2016
Este manuscrito descreve uma técnica de modelagem de infarto capsular. Aqui utilizamos uma técnica photothrombotic modificado com baixa intensidade de luz após o mapeamento de destino pré-cirurgia. Usando esta técnica, criamos um modelo de enfarte capsular circunscrito com comprometimento motor persistente.
O objetivo geral desta técnica é criar um modelo de infarto capsular circunscrito com comprometimento motor persistente, utilizando a técnica fototrombótica. Antes de criar o infarto capsular, é necessário identificar a área do membro anterior na cápsula interna, introduzindo um vírus adeno-associado que expressa GFP na área do córtex motor do membro anterior. Comece posicionando uma rata anestesiada em um estereotáxico.
Em seguida, rape a cabeça da rata e esterilize o couro cabeludo utilizando álcool 70% e solução de poviodine e iodo. Injete cloreto de lidocaína 2% sob o couro cabeludo na região da incisão planejada para reduzir a dor intraoperatória. Aplique pomada oftálmica para prevenir o ressecamento dos olhos.
E coloque um campo estéril sobre o animal. Após fazer uma incisão mediana de dois centímetros no couro cabeludo, posicione o braço estereotáxico para identificar a área do membro anterior da córtex motora de acordo com as coordenadas estereotáxicas. Faça um orifício de entrada nesta posição.
Posicione a agulha sobre o orifício perfurado e abaixe a agulha um milímetro através da dura-máter até o córtex motor. Utilize uma microbomba de alta precisão para injetar lentamente um microlitro do vírus. Mantenha a agulha no local por mais 10 minutos para prevenir o refluxo ao longo do trajeto da agulha.
Após decorridos 10 minutos, retire lentamente a agulha. Após limpar o local operatório com irrigação de soro fisiológico, feche a ferida com sutura de nylon 3-0. Em seguida, solte o rato do estereotáxico e transfira-o para uma câmara de recuperação para monitoramento.
Administre analgésico para controle da dor pós-operatória. Após duas a três semanas, sacrifique a rata de acordo com métodos aprovados e seccione o cérebro crioprotegido. Após coloração para GFP, observe os axônios transduzidos pelo AAV-GFP na cápsula interna com um microscópio de fluorescência.
Compare os locais dos axônios transduzidos observados na imagem fluorescente com o atlas do cérebro de rato para determinar com precisão as coordenadas estereotáxicas dos axônios transduzidos. Para preparar a interface neural óptica, use primeiro uma broca de corte para cortar aproximadamente quatro centímetros de uma agulha espinhal 27 gauge com estilo dentro. Em seguida, retire 10 centímetros da bainha de uma fibra óptica.
Insira o pedaço sem revestimento da fibra óptica em um tubo metálico. E prenda o tubo ao redor da fibra. Em seguida, use um prensador para fixar a metade inferior do tubo metálico duas vezes.
O tubo metálico preenche o espaço entre a fibra óptica e o hub da agulha espinhal. Aplique epóxi curável por calor na fibra óptica. Aplique epóxi adicional no espaço vazio do hub.
E insira a fibra óptica na agulha espinal. Cure a resina epóxi por 20 minutos a 100 graus Celsius para fixação estável. Após a cura, corte a fibra óptica que sobressai da agulha espinal e, em seguida, use folhas de lixa diamantada para polir a fibra óptica na ponta da agulha espinal.
Por fim, conecte a parte do conector FCPC do cabo de conexão ao acoplador do sistema a laser verde. Em seguida, utilize um medidor digital de potência e energia óptica para medir a intensidade da luz na ponta da fibra óptica, garantindo a emissão precisa da luz. Coloque uma almofada aquecida sob o corpo do animal para manter a temperatura corporal em 37,5 graus Celsius durante a cirurgia.
Comece anestesiando e preparando a rata para cirurgia como antes. Após fazer uma incisão mediana de dois centímetros, ajuste a altura do prendedor nasal até que o Bregma e o Lambda estejam alinhados no mesmo nível. O alinhamento correto é essencial para direcionar com precisão a cápsula interna.
Posicione o braço estereotáxico para localizar o sítio para fototrombose. Em seguida, faça um furo de dois milímetros nesse ponto. Depois, pola e limpe a ponta da fibra óptica do ONI, então fixe-a ao suporte estereotáxico sem dobrar.
Verifique a ponta do ONI para garantir que está limpa e intacta. Meça a intensidade do laser na ponta da fibra óptica antes da inserção da interface óptica no local-alvo do cérebro do rato. Ajuste a intensidade do laser para 3,5 miliwatts na ponta da fibra óptica.
Agora, posicione o ONI na área-alvo da cápsula interna utilizando a coordenada dorsoventral determinada na primeira seção do protocolo. Em seguida, injete dois miligramas por quilograma de Rubi de Rosa através da veia da cauda e inicie um cronômetro regressivo ajustado para um minuto. Quando o minuto terminar, ligue o laser verde de 532 nanômetros por 90 segundos para criar o infarto.
Após a irradiação, remova cuidadosamente o ONI do cérebro. Após a limpeza do local operatório, feche o ferimento com sutura de náilon 3-0. Em seguida, retire o rato do estereotáxico e transfira-o para uma câmara de recuperação.
Esta imagem mostra a extensão das lesões de infarto sob diferentes intensidades de luz laser, variando de dois a cinco miliwatts, duas semanas após a lesão fototrombótica. As setas indicam a lesão de infarto. A intensidade da luz óptica é considerada estar entre três e quatro miliwatts nesta configuração experimental.
As próximas duas imagens mostram a aparência microscópica do infarto capsular três semanas após a foto-trombose. Nesta seção coronal do cérebro de rato, as cabeças de seta indicam o trajeto da agulha contendo a fibra óptica no tálamo e até a cápsula interna. Essas seções seriadas e sobrepostas coradas mostram a extensão da lesão por infarto na cápsula interna.
As setas indicam a lesão por infarto.
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Visão Geral
Este manuscrito descreve uma técnica de modelagem de infarto capsular utilizando uma técnica foto-trombótica modificada. Essa abordagem permite a criação de um modelo de infarto capsular circunscrito que resulta em déficit motor persistente.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neurobiologia
- Deficiência Motora
Contexto
- Infartos capsulares estão associados a déficits motores.
- Técnicas fototrombóticas são usadas para induzir lesões cerebrais localizadas.
- Compreender os mecanismos de comprometimento motor é crucial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas.
- O mapeamento de alvos é essencial para a criação precisa de modelos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo confiável de infarto capsular.
- Investigar os efeitos dos infartos capsulares na função motora.
- Utilizar uma técnica foto-trombótica modificada para direcionamento preciso.
Métodos Utilizados
- Identificação da área do membro anterior na cápsula interna utilizando vírus adeno-associado que expressa GFP.
- Preparação da rata por anestesia e posicionamento no estereotáxico.
- Esterilização do couro cabeludo e preparação da incisão.
- Injeção de lidocaína para minimizar a dor intraoperatória.
Resultados Principais
- Criação bem-sucedida de um modelo de infarto capsular circunscrito.
- Demonstração de déficit motor persistente após o infarto.
- Validação da técnica foto-trombótica modificada.
- Estabelecimento de um método reprodutível para estudos futuros.
Conclusões
- A técnica foto-trómbotica modificada é eficaz para modelar infartos capsulares.
- Este modelo pode ser utilizado para estudar comprometimentos motores e intervenções potenciais.
- É necessária mais pesquisa para explorar os mecanismos subjacentes aos déficits motores.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Essa técnica fototrombótica permite modelar com precisão o acidente vascular cerebral na substância branca, direcionando-se seletivamente à cápsula interna enquanto preserva a substância cinzenta adjacente. O infarto capsular circunscrito resultante produz déficits motores persistentes, fornecendo um sistema relevante para a doença, útil para a desmistificação mecanicista de candidatos a neuroterapias. O modelo apoia a validação de alvos e a avaliação pré-clínica de intervenções voltadas à patologia da substância branca, abordando uma lacuna crítica na pesquisa sobre acidente vascular cerebral.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas à fisiopatologia do acidente vascular cerebral na substância branca.
- Valor Operacional: Fornece um sistema relevante para a doença, destinado à validação funcional de alvos na circuitaria motora.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao associar a localização do infarto à deficiência motora persistente.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera volumes de lesão quantificáveis por meio da titulação da intensidade óptica para avaliação de resposta à dose.
- Valor Operacional: Fornece modelos de infarto altamente replicáveis com leituras consistentes de déficit motor.
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em etapas subsequentes de neuroproteção ou neurorestauração.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Modela o acidente isquêmico cerebral na substância branca nos níveis comportamental, de circuito e celular para validação pré-clínica.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de continuidade ou interrupção do desenvolvimento com base na especificidade da lesão e na correlação com desfechos funcionais.
- Alinhamento de Biomarcadores: Facilita a correlação entre a extensão do infarto e a gravidade do déficit motor para o desenvolvimento de biomarcadores preditivos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a identificação do alvo até os testes de eficácia pré-clínica, permitindo o aperfeiçoamento iterativo de estratégias neuroterapêuticas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a vulnerabilidade da substância branca e a interrupção de vias motoras específicas aos circuitos.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio do controle preciso da lesão e pontuação quantitativa dos déficits motores.
- Análises: Oferece medidas volumétricas do infarto e respostas comportamentais para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à continuidade pré-clínica por meio da fenotipagem persistente de déficits motores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para testes iterativos de compostos neuroprotetores e reabilitadores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva no engajamento do alvo por meio da modelagem seletiva de infartos na substância branca.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio da calibração da intensidade do laser e direcionamento estereotáxico.
- Valor Estratégico: Redução do risco biológico em estágios avançados ao permitir a eliminação precoce de riscos mecanicistas nas vias da substância branca.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de compostos com base na capacidade de mitigar déficits motores persistentes em um modelo validado.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em entrega de vetores virais, cirurgia estereotáxica e fabricação de interfaces neurais ópticas.
- Depende de instrumentação de precisão, incluindo frames estereotáxicos, microinjetores e sistemas a laser calibrados.
- Necessita padronização entre equipes para consistência do título viral, preparação de fibras ópticas e monitoramento pós-operatório.
- Considerações para adaptação incluem coordenadas estereotáxicas específicas da espécie e propriedades ópticas da substância cinzenta versus branca.
- Limitações práticas incluem a complexidade cirúrgica e a necessidade de validação pós-operatória por meio de histologia e comportamento.
