Circunscrito capsular infarto Modelagem usando uma técnica Photothrombotic

O objetivo geral desta técnica é criar um modelo de infarto capsular circunscrito com comprometimento motor persistente usando a técnica fototrombótica. Antes de criar o infarto capsular, é necessário identificar a área do membro anterior na cápsula interna, introduzindo um vírus adeno-associado expressando GFP na área do membro anterior do córtex motor. Comece colocando um rato anestesiado em um quadro estereotáxico.

Em seguida, raspe a cabeça do rato e esterilize o couro cabeludo com álcool 70% e solução de povidona e iodo. Injete cloridrato de lidocaína a 2% sob o couro cabeludo na área da incisão pretendida no couro cabeludo para reduzir a dor intraoperatória. Aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos.

E coloque uma cortina estéril sobre o animal. Depois de fazer uma incisão na linha média de dois centímetros no couro cabeludo, posicione o braço estereotáxico para identificar a área do membro anterior do córtex motor de acordo com as coordenadas estereotáxicas. Faça um furo de entrada nesta posição.

Mova a agulha para o orifício perfurado e abaixe a agulha um milímetro através da dura-máter e no córtex motor. Use uma microbomba de alta precisão para injetar lentamente um micro litro de vírus. Deixe a agulha no lugar por mais 10 minutos para evitar o refluxo pelo trato da agulha.

Depois de decorridos 10 minutos, retire lentamente a agulha. Após limpar o local da operação com irrigação salina, prenda a ferida com sutura de náilon 3-0. Em seguida, solte o rato do quadro estereotáxico e transfira-o para uma câmara de recuperação para monitoramento.

Administre analgésico para controle da dor pós-operatória. Após duas a três semanas, sacrifique o rato de acordo com os métodos aprovados e corte o cérebro crioprotegido. Após a coloração para GFP, observe os axônios transduzidos por AAV-GFP na cápsula interna com um microscópio fluorescente.

Compare as localizações dos axônios transduzidos como visto na imagem fluorescente com o atlas do cérebro de rato para determinar com precisão as coordenadas estereotáxicas dos axônios transduzidos. Para preparar a interface neural óptica, primeiro use uma broca de corte para cortar aproximadamente quatro centímetros de uma agulha espinhal de calibre 27 com um estilete dentro. Em seguida, retire 10 centímetros da jaqueta de uma fibra óptica.

Insira a peça não revestida da fibra óptica em um tubo de metal. E prenda o tubo ao redor da fibra. Em seguida, use um prensador para prender a 1/2 inferior do tubo de metal duas vezes.

O tubo de metal preenche o espaço entre a fibra óptica e o cubo da agulha espinhal. Aplique epóxi curável por calor na fibra óptica. Aplique epóxi adicional no espaço vazio no cubo.

E insira a fibra óptica na agulha espinhal. Catalise o epóxi por 20 minutos a 100 graus Celsius para uma fixação estável. Uma vez curado, corte a fibra óptica que se projeta para fora da agulha espinhal e, em seguida, use folhas de diamante para polir a fibra óptica na ponta da agulha espinhal.

Por fim, conecte a parte do conector FCPC do patch cord ao acoplador do sistema de laser verde. Em seguida, use um medidor digital de potência óptica e energia para medir a intensidade da luz da ponta da fibra óptica para garantir a emissão precisa de luz. Coloque uma almofada térmica sob o corpo do animal para manter a temperatura corporal em 37,5 graus Celsius durante a cirurgia.

Comece anestesiando e preparando o rato para a cirurgia como antes. Depois de fazer uma incisão na linha média de dois centímetros, ajuste a altura da pinça nasal até que o Bregma e o Lambda estejam alinhados no mesmo nível. O alinhamento correto é fundamental para direcionar corretamente a cápsula interna.

Posicione o braço estereotáxico para localizar o local da fototrombose. Em seguida, faça um furo de dois milímetros neste ponto. Em seguida, polir e limpar a ponta da fibra óptica do ONI e, em seguida, fixe-a na moldura estereotáxica sem dobrar.

Verifique a ponta do ONI para garantir que esteja limpa e intacta. Meça a intensidade do laser da ponta da fibra óptica antes da inserção da interface óptica no local alvo do cérebro do rato. Ajuste a intensidade do laser para 3,5 miliwatts na ponta da fibra óptica.

Agora, abaixe o ONI na área-alvo da cápsula interna usando a coordenada dorsoventral determinada na primeira seção do protocolo. Em seguida, injete dois miligramas por quilograma de Rosa Bengala através da veia da cauda e, em seguida, inicie um cronômetro de contagem regressiva definido para um minuto. Quando o minuto tiver decorrido, ligue o laser verde de 532 nanômetros por 90 segundos para criar o infarto.

Após uma radiação, remova suavemente o ONI do cérebro. Após a limpeza do local da operação, prenda a ferida com sutura de náilon 3-0. Em seguida, remova o rato da estrutura estereotáxica e transfira-o para uma câmara de recuperação.

Esta imagem mostra a extensão das lesões de infarto em intensidades variadas de luz laser de dois miliwatts a cinco miliwatts duas semanas após a lesão fototrombótica. As setas indicam a lesão do infarto. A intensidade da luz óptica é considerada entre três miliwatts e quatro miliwatts neste ambiente experimental.

As próximas duas imagens mostram a aparência microscópica do infarto capsular três semanas após a fototrombose. Nesta seção coronal do cérebro do rato, as pontas das setas indicam o trato da agulha contendo a fibra óptica no tálamo e até a cápsula interna. Esses cortes seriados aninhados mostram a extensão da lesão do infarto na cápsula interna.

As setas indicam a lesão do infarto.