Geração e cultura de sangue Conseqüência células endoteliais do sangue periférico humano

O objetivo geral deste protocolo é gerar de forma confiável células endoteliais de crescimento sanguíneo a partir do sangue periférico humano. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia vascular, como como a disfunção das células endoteliais contribui para doenças cardiovasculares, incluindo hipertensão arterial pulmonar ou doença de von Willebrand. A principal vantagem dessa técnica é que ela gera consistentemente uma população estável de células endoteliais de crescimento sanguíneo a partir de um pequeno volume de sangue periférico adulto

Para iniciar este procedimento. Para cada doador, adicione três mililitros de citrato de sódio a cada um dos dois tubos de centrífuga cônicos de 50 mililitros. Em seguida, adicione 30 mililitros do sangue coletado a cada tubo.

Inverta suavemente os tubos duas a três vezes para misturar. Em seguida, dilua 60 mililitros de sangue com DPBS na proporção de um para um e incline o tubo que contém o gradiente de densidade. Meio de centrifugação em um ângulo de 20 graus com a superfície de trabalho usando um auxiliar de pipeta e uma pipeta sorológica de 25 mililitros.

Lentamente, coloque 21 mililitros de sangue diluído em cima do meio. Em seguida, centrifugue as amostras a 400 vezes G por 35 minutos à temperatura ambiente com o acelerador e a interrupção Durante a centrifugação, repare uma solução de colágeno a 50 microgramas por mililitro diluindo o estoque. Colágeno tipo um em 10 mililitros de ácido acético 0,02 molar estéril.

Filtre a suspensão de colágeno antes de usar. Em seguida, adicione 7,5 mililitros de solução de colágeno a um frasco de cultura de células T 75. Deixar revestir o balão à temperatura ambiente durante uma hora.

Após uma hora de revestimento, aspirar a solução de colagénio e pipetar 10 mililitros de DPBS no balão para lavar o ácido acético residual. Aspire o DPBS e repita a lavagem mais uma vez. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio de geração de BOEC ao frasco para evitar que o revestimento de colágeno seque até que a suspensão celular esteja pronta para o plaqueamento.

Após a centrifugação do gradiente de densidade, colete cuidadosamente a camada de revestimento leucocitário usando uma pipeta de transferência de plástico estéril e evite transferir o meio de gradiente de densidade. A coleta de buffy coat deve render aproximadamente 20 mililitros de suspensão cel e plasma de cada tubo. Em seguida, diluir a suspensão de células mononucleares em DPBS na proporção de um para um e inverter para misturar e, em seguida, centrifugar à temperatura ambiente durante 20 minutos a 300 vezes G com o travão e o acelerador regulados no máximo após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células adicionando um mililitro de meio de geração de BOEC a cada pellet e, pipetando para cima e para baixo, puxar repetidamente todas as suspensões de células e completar o volume total para 10 mililitros com o meio restante.

Para obter uma estimativa do número total de células, dilua 10 microlitros da suspensão celular com 490 microlitros de solução de Turk para obter os glóbulos vermelhos. Em seguida, contar uma amostra de 10 microlitros da suspensão de células diluídas usando um hemocitômetro. Em seguida, colocar a suspensão celular em um único frasco T 75 revestido de colágeno.

Cubra o volume médio até 15 mililitros por frasco e cultura. As células a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Agora troque o meio a cada dois dias adicionando 15 mililitros de geração fresca de BOEC, meio à cultura para fins de semana, as mudanças médias podem ser adiadas para a cada três dias.

Monitore o frasco de cultura BOEC no sétimo ao 14º dia para ver o aparecimento de colônias de crescimento. Identifique as colônias como grupos circulares de células exibindo a morfologia clássica de paralelepípedos endoteliais. Uma vez que uma colônia ou várias colônias sejam identificadas no frasco, continue com as mudanças médias e permita que as colônias cresçam para aproximadamente 1000 a 2000 células por colônia.

Antes de embalar, determine o número de células por colônia por meio de uma estimativa visual aproximada. Em seguida, passe as células enxaguando os frascos duas vezes com 10 mililitros de DPBS. Adicione cinco mililitros de uma x tripsin EDTA e incube em uma incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Após cinco minutos, neutralize a tripsina com 10 mililitros de meio contendo FBS e coloque as células em suspensão com pipetagem repetida. Em seguida, centrifugar a suspensão a 300 vezes G durante cinco minutos. Ressuspenda as células em 15 mililitros de BOEC fresco Continuar.

O meio muda até que as células sejam confluentes e passem. As células descritas anteriormente para a placa de embalagem contínua. Nada menos que 750.000 células por frasco T 75, pois baixas densidades celulares podem fazer com que os BO eecs parem de proliferar.

Neste procedimento, a tripsina examina as células e centrifuga-as a 300 vezes G por cinco minutos. Depois disso, aspire o snat e ressuspenda as células em 10 mililitros de meio. Colete uma amostra de 10 microlitros da suspensão celular e faça uma contagem manual de células.

Em seguida, centrifugue novamente a amostra e ressuspenda-a em meio de criopreservação gelada duas vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Adicione 0,5 mililitros de suspensão celular a cada frasco e coloque os frascos em um recipiente de criopreservação de isopropanol gelado. Em seguida, coloque o recipiente em um freezer negativo de 80 graus Celsius por pelo menos duas horas antes de transferir para nitrogênio líquido.

Para descongelar as células, adicione 10 mililitros de meio pré-aquecido a um tubo de centrífuga cônico de 15 mililitros. Remova as células do nitrogênio líquido e descongele em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação suave até que reste apenas um pequeno cristal de gelo no frasco. Em seguida, adicione o conteúdo do frasco gota a gota ao tubo cônico da centrífuga e gire para baixo a 300 vezes G por cinco minutos.

Em seguida, aspirar o sobrenadante e suspender o sedimento celular. Adicionar a suspensão celular ao balão T 75 e completar o médio até 15 ml. Nesta imagem, as colônias de crescimento, que aparecem como coleções de células endoteliais são dispostas em uma monocamada de paralelepípedos e proliferam radialmente a partir de um ponto central ao redor das colônias de crescimento, são as células monocíticas aderentes que compõem a grande maioria das células nas primeiras culturas Após a embalagem, os bo Oecs altamente proliferativos assumem a cultura à medida que as células monocíticas não proliferativas morrem ou não se reconectam.

Aqui está uma imagem de imunofluorescência representativa de imunos Bo Oecs corados com um anticorpo contra o marcador de superfície celular endotelial CD 1 44. E nesta imagem B oecs eram imunocorados com um anticorpo contra o fator de von Willebrand da glicoproteína do sangue. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de duas horas se executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar processar as amostras de sangue o mais rápido possível e, de preferência, dentro de duas horas após a coleta. Após este procedimento, as células podem ser usadas para estudar a função das células endoteliais na saúde e na doença ou reprogramadas em células-tronco potentes de fluência induzida para uso em estudos de diferenciação, modelagem de doenças ou terapia celular após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para estudarmos o impacto de mutações no receptor de proteína morfogenética óssea tipo dois na patogênese da hipertensão arterial pulmonar em células endoteliais de crescimento sanguíneo do paciente e células musculares do humor derivadas de IPSC.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar e caracterizar células endoteliais estáveis de crescimento sanguíneo a partir de um pequeno volume de sangue periférico. Não se esqueça de que trabalhar com sangue humano não rastreado pode ser extremamente perigoso e equipamentos de proteção individual, incluindo luvas e jaleco, devem sempre ser usados durante a realização deste procedimento.